ARCH. MED. S
D. KRYM., 2008, LVIII, 212-217 pRACE pogL
DowE
Patrycja Daca, Marta Mielnik, Urszula Rogalla, Katarzyna Skonieczna,
Katarzyna Linkowska, Tomasz Grzybowski
Zastosowanie reakcji minisekwencjonowania do oznaczania
przynależności haplogrupowej mitochondrialnego DNA
The application of minisequencing reactions for haplogroup assignment
of mitochondrial DNA
Z Katedry Medycyny SÄ…dowej UMK w Toruniu, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera
w Bydgoszczy
Kierownik: prof. dr hab. med. K. Åšliwka
w ostatnim czasie obserwuje siÄ™ wzrost zainteresowa- SNps in mitochondrial DNA. Among the SNp typing
nia polimorfizmem jednonukleotydowym (ang. Single techniques, due to its high sensitivity and promptness
Nucleotide polymorphisms  SNps) mitochondrialne- of determinations, minisequencing appears to
go DNA (mtDNA), nie tylko w badaniach populacyj- be one of the fastest and most frequently applied
nych, ale również w genetyce sądowej. Ciągły rozwój methods in forensic laboratories. This review presents
technik biologii molekularnej oraz powiększający się currently available minisequencing systems used for
zasób wiedzy filogenetycznej umożliwiają coraz szyb- haplogroup assignment of mtDNA in European, East
sze i dokładniejsze oznaczanie dużej liczby SNps Asian and Native American populations.
w obrębie genomu mitochondrialnego. Spośród
technik stosowanych do analizy SNps na szczególną Słowa kluczowe: mitochondrialny DNA, filo-
uwagę zasługuje metoda minisekwencjonowania. geografia, polimorfizmy jednonukleotydowe,
Z uwagi na wysoką czułość tej metody i szybkość minisekwencjonowanie
wykonywanych nią oznaczeń, jest ona coraz częściej Key words: mitochondrial DNA, phylogeog-
stosowana w laboratoriach genetyczno-sÄ…dowych raphy, single nucleotide polymorphisms,
na całym świecie. Niniejsza praca stanowi przegląd minisequencing
istniejących systemów minisekwencjonowania stoso-
wanych do oznaczania przynależności haplogrupo-
wej mtDNA z populacji Europy, Azji wschodniej oraz wSTęp
u rdzennych Amerykanów.
Analiza sekwencji mitochondrialnego DNA
In the last few years, one could observe an increased stała się jednym z wartościowych narzędzi
interest in mitochondrial DNA (mtDNA) single w badaniach genetycznych przeprowadzanych
nucleotide polymorphisms (SNps) as a result of dla potrzeb wymiaru sprawiedliwości. Za sprawą
their numerous applications in population genetics dużej liczby cząsteczek w komórce oraz wyso-
and forensic science. Continuous progress in kiej odporności na degradację, mitochondrialny
molecular technologies together with an increasing DNA stał się szczególnie użytecznym markerem,
body of phylogenetic knowledge, based mainly on stosowanym do badań śladów biologicznych
complete mitochondrial genome sequencing, allows zawierających zdegradowany materiał gene-
both for selection and accurate typing of many tyczny oraz w przypadkach identyfikacji ofiar
Nr 4 ZASToSowANIE REAKCJI MINISEKwENCJoNowANIA 213
przestępstw czy katastrof [1, 2]. Z kolei duża SNps. Doskonałym ich z
ródłem jest kodujący
zmienność mtDNA wewnątrz populacji wy- region mtDNA, zwłaszcza w sytuacji, kiedy
nikająca z około dziesięciokrotnie wyższego znana jest filogeneza głównych haplogrup i pod-
tempa mutacji w porównaniu z jądrowym DNA, haplogrup mitochondrialnych. określanie spe-
a także brak rekombinacji i dziedziczenie w linii cyficznych haplogrupowo wariantów SNps w ob-
żeńskiej czynią z mtDNA doskonały marker do rębie regionu kodującego w znaczący sposób
badań antropologicznych i ewolucyjnych [2, 3]. poprawiło rozdzielczość badań populacyjnych
Analiza krótkiego fragmentu cząsteczki DNA i identyfikacyjnych. wzrost zainteresowania
(regionu kontrolnego) pozwala wykazać różnice markerami SNp wiąże się również ze znacznie
pomiędzy osobami, z kolei analiza sekwencji szybszym i łatwiejszym w stosunku do tradycyj-
całego genomu dostarcza informacji na temat nych metod sekwencjonowania generowaniem
ewolucyjnego pochodzenia ludzkości oraz danych oraz stosunkowo łatwą implementacją
szlaków migracji człowieka współczesnego [2, technologii w laboratorium. ponadto dla aplikacji
4]. w badaniach filogenetycznych haplotypy sądowych istotne znaczenie ma fakt, iż analizy
mtDNA o określonym wzorze sekwencji, odzie- SNps mogą być przeprowadzane na bardzo
dziczonym od wspólnego przodka, skupione są krótkich amplikonach, a zatem również w przy-
w monofiletyczne grupy określane mianem kla- padku częściowej degradacji pozyskanego ma-
dów bądz
haplogrup, definiowanych za pomocą teriału biologicznego [3]. Istnieje szereg nowo-
określonych polimorfizmów regionu kodującego czesnych metod umożliwiających wykrywanie
w powiązaniu z charakterystycznymi wariantami polimorfizmów jednonukleotydowych (SNps),
regionu kontrolnego (HVS I oraz HVS II). Dane takich jak ilościowy pCR w czasie rzeczywistym
pochodzące wyłącznie z sekwencjonowania z zastosowaniem molekularnych sond TaqMan,
regionu kontrolnego, a zwłaszcza z jego wy- oligunukleotydowa reakcja ligacji (oLA) czy też
branych fragmentów, nie zawsze wystarczają spektrometria masowa (MALDI-ToF). Jednakże
do określenia przynależności haplogrupowej zarówno dla potrzeb sądowych, jak i populacyj-
mtDNA. przykładowo, większość podgrup nych, istotne znaczenie mają nie tylko szybkość
w obrębie najczęstszej w Europie haplogrupy wykonywanych analiz, ich wysoka czułość i po-
H definiowana jest poprzez mutacje regionu wtarzalność, ale także stosunkowo niskie koszty
kodującego, a nie kontrolnego [5]. Dodatko- [3, 4, 9]. Narzędziem idealnie spełniającym te
wo szybkie tempo substytucji zachodzÄ…cych wymagania jest reakcja minisekwencjonowania.
w regionie kontrolnym oraz zjawisko homoplazji Jest ona oparta na zastosowaniu nieznakowa-
(pojawianie się równoległych mutacji oraz re- nego startera zaprojektowanego tak, by miejsce
wersji) mogą prowadzić do mylnej interpretacji mutacji bezpośrednio przylegało do jego końca
uzyskanych wyników, na przykład notowany 3 . w kolejnym etapie reakcji starter jest wydłuża-
w populacjach słowiańsko-języcznych haplotyp ny przez pojedynczy, znakowany fluorescencyj-
HVS I/HVS II 16311C-263g-315.1C oraz jego po- nie dideoksynukleotyd. Każdy ze stosowanych
chodne mogą należeć zarówno do haplogrupy ddNTps wyznakowany jest innym barwnikiem
H, jak i HV3 [6, 7]. fluorescencyjnym, dzięki czemu możliwe jest
Rozdzielczość analiz można zwiększyć po- rozróżnienie poszczególnych pozycji nukleoty-
przez sekwencjonowanie pełnych genomów mi- dowych. Zaletą reakcji minisekwencjonowania
tochondrialnych. w ostatnim czasie dokonał się jest możliwość detekcji wielu SNps jednocześnie
bardzo znaczący postęp w dziedzinie genomiki w reakcji multipleksowej. Do końca 5 startera
mitochondrialnej  opublikowano tysiące sek- przyłączony jest wówczas różnej długości tzw.
wencji pełnych genomów z populacji wszystkich  ogon poli T, który pozwala na łatwy rozdział
kontynentów, co pozwoliło na stosunkowo pre- produktów poprzez elektroforezę kapilarną [3,
cyzyjnÄ… rekonstrukcjÄ™ filogenezy ludzkiego mtD- 4, 9, 10].
NA na skalÄ™ globalnÄ…. Zebrania i podsumowania
dotychczasowych danych na ten temat dokonali oKREŚLANIE pRZYNALEżNoŚCI
w ostatnim czasie m.in. van oven i Kayser [8]. HApLogRUpowEJ Z wYKoRZYSTANIEM
Niestety sekwencjonowanie pełnych genomów REAKCJI MINISEKwENCJoNowANIA
jest nadal kosztowne i stosunkowo czasochłon-
ne, toteż wysiłki wielu zespołów badawczych, Częstości różnych haplogrup mitochondrial-
zainteresowanych określaniem przynależności nego DNA wykazują znaczne zróżnicowanie
haplogrupowej mtDNA, skoncentrowały się na kontynentalne, przypisywane działaniu dryfu
selekcji i ograniczonym typowaniu markerów genetycznego oraz selekcji naturalnej. Dużą
214 patrycja Daca Nr 4
różnorodność obserwuje się również wewnątrz  west-Eurasia-plex pozwala również na
haplogrup w obrębie poszczególnych populacji, oznaczanie haplogrup H1 (g3010A) oraz H3
przy czym najwyższy poziom osiąga ona w po- (T6776C), najczęstszych w Europie podkladów
pulacji afrykańskiej. System minisekwencjono- haplogrupy H.
wania stosowany do klasyfikacji haplogrupowej Uzupełnieniem multipleksu  west-Eurasia-
powinien uwzględniać filogeograficzne zależ- -plex jest zestaw markerów jednonukleotydo-
ności, tj. powinien być skonstruowany w taki wych zaproponowany przez Coble i wsp. [2].
sposób, aby umożliwić dokonanie klasyfikacji Metoda oparta na reakcji minisekwencjonowa-
mtDNA w obrębie populacji danego kontynentu nia przewiduje typowanie 59 markerów SNps,
lub jego części. wyselekcjonowanych na podstawie doniesień
Zestaw specyficznych haplogrupowo warian- naukowych. Są one zebrane w ośmiu multiplek-
tów polimorficznych SNps umożliwia dokonanie sowych panelach i pozwalają na oznaczanie
dyskryminacji na poziomie sub-kontynentalym, szeregu podkladów w obrębie europejskich
różnicując populacje zachodniej i wschodniej haplogrup  HV, JT oraz K [2]. Niewątpliwą zaletą
Eurazji. Do tej pory zoptymalizowano kilka mul- systemu opracowanego przez Coble i wsp. [2]
tipleksowych reakcji minisekwencjonowania, jest zastosowanie różnych kombinacji wariantów
które z powodzeniem mogą być stosowane polimorficznych charakteryzujących haplogrupy
zarówno do celów sądowych, jak i antropo- występujące z największą częstością w Europie,
logicznych [11]. Spośród nich na uwagę za- co znacznie poprawia rozdzielczość oznaczeń.
sługuje reakcja  west-Eurasia-plex , na którą Jednakże z uwagi na ograniczenia reakcji mul-
składa się panel zawierający 16 markerów tipleksowych nie wszystkie SNps różnicujące
SNp zlokalizowanych w regionie kodującym daną haplogrupę udało się zebrać w pojedyn-
mtDNA, definiujących 9 głównych haplogrup czym panelu, dlatego niektóre z pozycji polimor-
zachodnio-eurazjatyckich: H, I, J, K, T, U, V, ficznych umieszczone zostały w kilku różnych
w, X [12]. Zestaw skonstruowano wybierajÄ…c multipleksach. System opracowany przez Coble
przede wszystkim mutacje znajdujące się poza i wsp. [2] służy raczej do rozróżniania częstych
genami kodującymi białka bądz
też mutacje haplotypów regionu kontrolnego za pomocą
synonimiczne. Kierowano się tutaj postulatami dodatkowych markerów regionu kodującego,
natury etycznej, według których testy stoso- nie zaś do kompleksowej klasyfikacji haplogru-
wane w genetyce sądowej powinny dotyczyć powej nieznanych próbek mtDNA. Został on
przede wszystkim niekodujących fragmentów więc zaprojektowany z myślą o zastosowaniach
genomu człowieka [2]. w zestawie  west-Eura- typowo identyfikacyjnych, jako uzupełnienie ru-
sia-plex wielkość fragmentów amplifikowanych tynowo stosowanych analiz sekwencji regionu
przed właściwą reakcją minisekwencjonowania kontrolnego.
nie przekracza 100 p.z., co jest niewątpliwą Jako że wiedza na temat markerów specy-
zaletą w przypadku zdegradowanego DNA ficznych haplogrupowo wciąż rośnie, kolejne
[12]. Konstrukcja reakcji opierała się na za- zespoły badawcze opracowują systemy umoż-
łożeniu, iż tranzycja w pozycji 7028 różnicuje liwiające coraz szybsze i dokładniejsze ozna-
haplogrupę H oraz pozostałe haplogrupy. Te czanie haplogrup na podstawie polimorfizmów
ostatnie definiowane są następnie na podstawie regionu kodującego. Mikkelsen i wsp. [13]
specyficznych haplogrupowo polimorfizmów. zaproponowali reakcję minisekwencjonowa-
w celu identyfikacji haplogrup wywodzących nia, która w jednym zestawie multipleksowym
się z makrohaplogrupy N za pośrednictwem R, różnicuje główne haplogrupy zachodniej Eur-
zestaw Brandstätter i wsp. [12] wykorzystuje po- azji, natomiast w drugim wyodrÄ™bnia podklady
limorfizmy C15904T dla V; g12372A i C14766T w obrębie haplogrupy H. Rozdzielczość pierw-
dla U; A1811g, g12372A, C14766T i T14798C szego panelu opracowanego przez cytowanych
dla K (jest to podgrupa w obrębie haplogrupy autorów jest większa niż w przypadku zestawu
U); A11251g, g13708A i C14766T dla J oraz  west-Eurasia-plex , pozwala on bowiem na
g709A, g8697A, A11251g i C14766T dla T (J i T rozróżnienie szeregu podhaplogrup w obrębie
są haplogrupami siostrzanymi, tj. wywodzącymi głównych kladów europejskich  U2, U4, U5,
się z jednego węzła). omawiany zestaw pozwa- K2a, J1b, J1c. warto jednak zwrócić uwagę, że
la również na identyfikację haplogrupy w za z wyjątkiem K2a wszystkie one są możliwe do
pomocÄ… tranzycji g709A, g8251A i C14766T; X zidentyfikowania na podstawie diagnostycznych
na podstawie motywu g1719A i C14766T oraz polimorfizmów regionu kontrolnego. Haplo-
I poprzez tranzycje g1719A, g8251A i C14766T. grupÄ™ H charakteryzuje natomiast wysoka, bo
Nr 4 ZASToSowANIE REAKCJI MINISEKwENCJoNowANIA 215
sięgająca ok. 40-50%, częstość występowania  odpowiednio w pozycjach 10398 i 10400. obie
w populacjach europejskich oraz bardzo szeroki wspomniane makrohaplogrupy majÄ… prawie jed-
zasięg geograficzny. Jednocześnie jej wewnętrz- nakowy udział w całkowitej puli mtDNA w Eurazji
ne zróżnicowanie jest możliwe do zidentyfikowa- wschodniej. Spośród kladów wywodzących się
nia poprzez sekwencjonowanie regionu kontrol- bezpośrednio z makrohaplogrupy N, omawiany
nego tylko w niewielkim stopniu  na podstawie zestaw umożliwia oznaczanie haplogrupy A2
SNps tego regionu można oznaczyć w sposób występującej w populacjach okołobiegunowych,
niebudzący większych wątpliwości jedynie pod- charakterystycznej dla niektórych grup Indian
klady H1a, H6 i H15 [5]. Tymczasem w obrębie amerykańskich haplogrupy X2a oraz azjatyckiej
haplogrupy H, zdefiniowanej na podstawie haplogrupy N9 wraz z jej podgrupami N9a,
tranzycji w pozycjach 2706 oraz 7028, w popu- N9a1 oraz N9a4. w obrębie wywodzącej się z N
lacjach Europy, Bliskiego wschodu i Kaukazu makrohaplogrupy R definiowanej na podstawie
scharakteryzowano do tej pory 21 podkladów tranzycji w pozycji 12705, wyróżniono dwie głów-
(H1-H21), a większość z nich obejmuje szereg ne gałęzie  B oraz R9 [17]. Haplogrupa B, poza
drobniejszych odgałęzień [5, 14]. Drugi z paneli dziewięcionukleotydową delecją w pozycjach
opracowanych przez Mikkelsena i wsp. [13] 8281-8289, została dość szczegółowo oznaczo-
pozwala na identyfikację szeregu podhaplogrup na przez włączenie wariantów SNps definiujących
w obrębie H-H1, H1a, H1b, H2a1, H3, H3a, H5a, jej podgrupy B4b, B4c oraz B4f. Z kolei w obrębie
H5a1, H6a1, H7, H13a1a1, H15 oraz H16. R9 zestaw umożliwia oznaczenie podhaplogrup
Najbardziej szczegółowej analizy haplogrupy R9b i F. wewnątrz tej ostatniej możliwe jest ozna-
H dokonali do tej pory Brandstätter i wsp. [15]. czenie trzech głównych podkladów F1, F2, F3,
KierujÄ…c siÄ™ aktualnÄ… wiedzÄ… na temat filogenezy z czego F1 i F3 jest podzielony na mniejsze pod-
tej haplogrupy wyselekcjonowali oni 45 poli- grupy. Zestaw opracowany przez cytowanych
morfizmów jednonukleotydowych, a następnie autorów pozwala również na oznaczanie szere-
opracowali metodę ich oznaczania za pomocą gu haplogrup wywodzących się bezpośrednio
dwóch multipleksowych zestawów pCR oraz z makrohaplogrupy M  M7, M8 (wraz z jednym
trzech reakcji minisekwencjonowania z wy- z jej dobrze znanych podkladów  C), M9, M10,
korzystaniem znakowanych fluorescencyjnie M11, M12 g oraz D. w obrębie tej ostatniej wy-
dideoksynukleotydów. Haplogrupę H oznacza- odrębniono charakteryzującą się największym
no na podstawie wspominanych wcześniej po- wewnętrznym zróżnicowaniem w populacjach
zycji SNps, a w dalszej kolejności różnicowano azjatyckich haplogrupę D4, wraz z jej rdzennie
na główne podgrupy występujące w Europie amerykańskim podkladem D1 [17]. omówiona
(H1-H17) oraz szereg mniejszych podkladów. reakcja jest z pewnością najpełniejszym opra-
Metoda ta z powodzeniem może być stosowa- cowanym dotychczas testem pozwalającym na
na zarówno dla celów przesiewowych, a więc szybką identyfikację wschodnio-euroazjatyckich
wstępnego, filogenetycznego typowania pró- i rdzennie amerykańskich haplogrup mtDNA na
bek, jak i szczegółowej analizy poszczególnych podstawie wybranych wariantów SNps regionu
podgrup w obrębie haplogrupy H [15]. kodującego. Jednocześnie jednak warto zwrócić
Analiza rozkładu częstości poszczególnych uwagę, że odzwierciedla ona jedynie niewielką
haplogrup w obrębie populacji europejskiej część zróżnicowania mtDNA u mieszkańców
pozwala stwierdzić, iż w puli mitochondrialnego wschodniej Azji oraz Indian amerykańskich, po-
DNA Europy pojawiają się również haplogrupy znanego do tej pory dzięki sekwencjonowaniu
charakterystyczne dla wschodniej Eurazji, choć pełnych genomów [18, 19, 20, 21]. warto rów-
z niskimi częstościami (łącznie ok. 1.5%). przy- nież podkreślić, że nie opracowano dotychczas
kładowo, w populacji polskiej i rosyjskiej zano- testów opartych na minisekwencjonowaniu,
towano obecność wschodnio-euroazjatyckich które umożliwiłyby rozpoznawanie chociaż części
haplogrup Z1, C5c1, D5a3 czy g2a [6,16, niepub- ogromnego zróżnicowania mtDNA w popula-
likowane dane autorów pracy]. Alvares-Iglesias cjach afrykańskich [22].
i wsp. [17] opracowali reakcję minisekwencjono- Można się spodziewać, że w miarę dalszego
wania, w której oznaczane są 32 markery SNps rozwoju genomiki mitochondrialnej, tj. pozna-
z obszaru kodującego mtDNA, charakteryzujące wania sekwencji kolejnych pełnych genomów,
główne haplogrupy azjatyckie i rdzennie amery- będzie wzrastała także liczba testów opartych
kańskie. Filogenetyczna klasyfikacja opiera się na minisekwencjonowaniu, zwiększających roz-
w tym przypadku na zróżnicowaniu dwóch ma- dzielczość rutynowych analiz mtDNA zarówno
krohaplogup N i M na podstawie dwóch tranzycji w genetyce populacyjnej, jak i sądowej.
216 patrycja Daca Nr 4
pIÅšMIENNICTwo Coble M. D., Real F. C., Desmyter S., Dupuy B.
M., Harrison C., Hohoff C., Just R., Krämer T.,
1. parson w., Bandelt H. J.: Extended gu- Morling N., Salas A., Schmitter H., Schneider p.
idelines for mtDNA typing of population data M., Sonntag M. L., Vallone p. M., Brandstätter
in forensic science. Forensic Sci. Int.: genetics A.: Identification of west Eurasian mitochondrial
2007, 1, 13-19. haplogroups by mtDNA SNp screening: Results
2. Coble M. D., Just R. S., o Callaghan J. E., of the 2006-2007 EDNAp collaborative exercise.
Letmanyi I. H., peterson C. T., Irwin J. A., parsons Forensic Sci. Int. genetics 2008, 2, 61-68.
T. J.: Single nucleotide polymorphisms over the 12. Brandstätter A., parsons T. J., parson w.:
entire mtDNA genome that increase the power Rapid screening of mtDNA coding region SNps
of forensic testing in Caucasians. Int. J. Legal for the identification of west European Cauca-
Med. 2004, 117, 137-146. sian haplogroups. Int. J. Legal Med. 2003, 117,
3. Vallone p. M., Just R. S., Coble M. D., 291-298.
Butler J. M., parsons T. J.: A multiplex allele- 13. Mikkelsen M., Rockenbauer E., SÅ‚rensen
specific primer extension assay for forensically E., BÅ‚rsting C., Morcing N.: A mitochondrial
informative SNps distributed throughout the DNA SNp multiplex assigning Caucasians into
mitochondrial genome. Int. J. Legal Med. 2004, 36 haplo- and subhaplogroups. Forensic Sci.
118, 147-157. Int. genetics 2008, 1, 287-289.
4. Sobrino B., Brión M., Carracedo A.: SNps 14. Brandstätter A., Zimmermann B., wagner
in forensic genetics: a review on SNp typing J., göbel T., Röck A., Salas A., Carracedo A.,
methodologies. Forensic Sci. Int. 2005, 154, parson w.: Timing and deciphering mitochon-
181-194. drial DNA macro-haplogroup R0 variability in
5. Roostalu U., Kutuev I., Loogväli E. L., Met- Central Europe and Middle East. BMC Evol.
spalu E., Tambets K., Reidla M., Khusnutdinova Biol. 2008, 8, 191.
E. K., Usanga E., Kivisild T., Villems R.: origin 15. Brandstätter A., Salas A., Niederstätter H.,
and expansion of haplogroup H, the dominant gassner C., Carracedo A., parson w.: Dissec-
human mitochondrial DNA lineage in west Eu- tion of mitochondrial superhaplogroup H using
rasia: the Near Eastern and Caucasian perspec- coding region SNps. Electrophoresis 2006, 27,
tive. Mol. Biol. Evol. 2007, 24, 436-448. 2541-2550.
6. grzybowski T., Malyarchuk B. A., Derenko 16. Malyarchuk B. A., grzybowski T., Derenko
M. V., perkova M. A., Bednarek J., woz
niak M.: M. V., Czarny J., woz
niak M., Miścicka-Śliwka D.,
Complex interactions of the Eastern and western Mitochondrial DNA variability in poles and Rus-
Slavic populations with other European groups sians, Ann. Hum. genet. 2002, 66, 261-283.
as revealed by mitochondrial DNA analysis. Fo- 17. Alvarez-Iglesias V., Jaime J. C., Carracedo
rensic Sci. Int. genetics 2007, 1, 141-147. A., Salas A.: Coding region mitochondrial DNA
7. Malyarchuk B., grzybowski T., Derenko SNps: Targeting East Asian and Native American
M., perkova M., Vanecek T., Lazur J., gomolcak haplogroups. Forensic Sci. Int. genetics 2007,
p., Tsybovsky I.: Mitochondrial DNA phylogeny 1, 44-55.
in Eastern and western Slavs. Mol. Biol. Evol. 18. Kong Q. p., Bandelt H. J., Sun C., Yao Y.
2008, 25, 1651-1658. g., Salas A., Achilli A., wang C. Y., Zhong L., Zhu
8. van oven M., Kayser M.: Updated com- C. L., wu S. F., Torroni A., Zhang Y. p.: Updating
prehensive phylogenetic tree of global human the East Asian mtDNA phylogeny: a prerequisite
mitochondrial DNA variation. Hum. Mutat. 2008, for the identification of pathogenic mutations.
DoI: 10.1002/humu. 20921. Hum. Mol. genet. 2006, 15, 2076-2086.
9. Kwok p. Y.: Methods for genotyping single 19. Derenko M., Malyarchuk B., grzybowski
nucleotide polymorphisms. Annu. Rev. geno- T., Denisova g., Dambueva I., perkova M., Dor-
mics Hum. genet. 2001, 2, 235-258. zhu C., Luzina F., Lee H. K., Vanecek T., Villems
10. Quintáns B., Alvarez-Iglesias V., Salas A., R., Zakharov I.: phylogeographic analysis of mi-
phillips C., Lareu M. V., Carracedo Á.: Typing tochondrial DNA in northern Asian populations.
of mitochondrial DNA coding region SNps of Am. J. Hum. genet. 2007, 81, 1025-1041.
forensic and anthropological interest using 20. Tamm E., Kivisild T., Reidla M., Metspalu
SNapshot minisequencing. Forensic Sci. Int. M., Smith D. g., Mulligan C. J., Bravi C. M.,
2004, 140, 251-257. Rickards o., Martinez-Labarga C., Khusnutdi-
11. parson w., Fendt L., Ballard D., BÅ‚rsting nova E. K., Fedorova S. A., golubenko M. V.,
C., Brinkmann B., Carracedo Á., Carvalho M., Stepanov V. A., gubina M. A., Zhadanov S. I.,
Nr 4 ZASToSowANIE REAKCJI MINISEKwENCJoNowANIA 217
ossipova L. p., Damba L., Voevoda M. I., Dipierri Quintana-Murci L., Tyler-Smith C., wells R. S.,
J. E., Villems R., Malhi R. S.: Beringian standstill Rosset S.: The dawn of human matrilineal diver-
and spread of Native American founders. pLoS sity. Am. J. Hum. genet. 2008, 82, 1130-1140.
oNE 2007, 2: e829.
21. Achilli A., perego U. A., Bravi C. M., Coble Adres do korespondencji:
M. D., Kong Q. p., woodward S. R., Salas A., Tor- Dr hab. Tomasz grzybowski
roni A., Bandelt H. J.: The phylogeny of the four Katedra Medycyny SÄ…dowej
pan-American MtDNA haplogroups: implications Zakład genetyki Molekularnej i Sądowej UMK
for evolutionary and disease studies. pLoS oNE w Toruniu Collegium Medicum w Bydgoszczy
2008, 3: e1764. ul. Marii Skłodowskiej-Curie 9
22. Behar D. M., Villems R., Soodyall H., Blue- 85-094 Bydgoszcz
Smith J., pereira L., Metspalu E., Scozzari R., Tel: [phone]
Makkan H., Tzur S., Comas D., Bertranpetit J., e-mail: [e-mail]