Aminokwasy, peptydy, białka

background image

1

AMINOKWASY

zwi

ą

zki dwufunkcyjne;

w naturze > 500, kodowane – ok. 20

100 000 ró

ż

nych białek


Inne podziały:

Ze wzgl

ę

du na pozycj

ę

grupy aminowej (

αααα

-,

ββββ

-,

γγγγ

-….aminokwasy)

NH

2

-CHR-(CH

2

)

x

-COOH x = 0,1,2…; rz

ę

dowo

ść

gr. aminowej;

glikogenne (przetwarzane w glukoz

ę

lub glikogen w przypadku niedoboru

w

ę

glowodanów: Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Asp, Glu, Arg, His, Met, Pro), ketogenne (keton

ko

ń

cowym produktem przemiany np. Leu)

Alifatyczne, aromatyczne, heterocykliczne…

Oboj

ę

tne, kwasowe, zasadowe

AMINOKWASY KODOWANE:

a/ niepolarne, hydrofobowe (łososiowy); b/ polarne nienaładowane (zielony); c/ kwasowe (ró

ż

);

d/ zasadowe (niebieski)

AMINOKWASY

NATURALNE

kilkaset

SYNTETYCZNE

(NIENATURALNE)

BIAŁKOWE

(kilkadziesi

ą

t)

NIEBIAŁKOWE

PIERWSZORZ

Ę

DOWE

(kodowane, 20 lub 21)

substraty w syntezie

rybosomalnej

DRUGORZ

Ę

DOWE

wynik postrybosomalnej

modyfikacji

TRZECIORZ

Ę

DOWE

modyfikacje

postrybosomalne z

niepeptydowymi

wi

ą

zaniami

kowalencyjnymi

ENDOGENNE

EGZOGENNE

C

O

OH

C

NH

2

R

H

aminokwas

α−

background image

2



background image

3


Aminokwasy:

- niepolarne, hydrofobowe, np.:

Leu

,

Ile,

Pro,

Val

, Ala,

Trp

,

Phe

,

Met

- polarne, nienaładowane, np.: Gly, Ser, Asn, Cys,

Thr

, Tyr…

- kwa

ś

ne, np.: Asp, Glu;

- zasadowe, np.:

Arg

,

Lys

,

His

.

20 Aaa kodowanych,

8 Aaa

niezb

ę

dnych

(nie syntezowanych przez dojrzałego człowieka)


21 Aaa – selenocysteina (

Sec

) NH

2

-CH-COOH

1986 r.

|

CH

2

-Se


rekodowanie kodonu terminalnego UGA; Sec bardziej nukleofilowa vs Cys

enzymy

background image

4


22 Aaa – L-pyrrolysine

B. Hao, W. Gong, T.K.Ferguson, C.M. James, J.A. Krzycki, M.K. Chan, A new UAG-encoded residue
in the structure of a mathanogen methyltransferase,
Science 2002, 296, 1462

N

N

H

OH

O

O

NH

2

X

X = OH, NH

2

,CH

3

“Stop codon” UAG enzymatycznie reprogramowany do syntezy “pyrrolysine”. Nieoczekiwana

ż

norodno

ść

nowe enzymy o znaczeniu przemysłowym.?


Hydroliza białek

24 Aaa (dawniej - 22 Aaa) (kodowane + Cys-Cys + Hyp)

2R

SH

[O]

[H]

R

-S-S-

R


Nomenklatura i symbolika:

-

nazwa zwi

ą

zana z: pierwsz

ą

izolacj

ą

[

ź

ródłem - Asp (łac. – asparagus), Cys (gr. – cystis

p

ę

cherz], sposobem wyodr

ę

bniania (Arg – w post. soli Ag, Trp – prod. degr. trypsyn

ą

),

podobie

ń

stwem do innych zwi

ą

zków (Val – od kw. walerianowego)

-

z wyj

ą

tkiem Trp, przyrostek

–ina lub –yna

-

reszty

(H

2

N-CHR-CO-) przyrostek

–ylo

[glutamylo- (Glu-), aspartylo-, glutaminylo- (Gln-),

asparaginylo-]

-

skróty trzyliterowe, konfiguracja w

ę

gla

α

zawarta w symbolu (L-alanina = Ala, A –

jednoliterowy skrót biochemiczny)

COOH

H

R

H

2

N

COOH

H

CH

2

OH

HO

L-aminokwas

aldehyd L-glicerynowy
(S)-2,3-dihydroksypropanal

-

allo

-L-izoleucyna – aIle,

hydroksy

lizyna –

Hy

l,

allo

-L-

hydroksy

prolina -

aHy

p

-

nor

walina –

N

va

-

grupa aminowa – A (kw.

α

-aminomasłowy – Abu,

α

-aminoadypinowy Aad)

dwie grupy aminowe – D (

α

,

γ

-diaminomasłowy – Dbu)

poło

ż

enia w pozycjach

α

i

ω

nie s

ą

uwzgl

ę

dniane w nazwie, inne tak (

β

-Ala)

N-metylowalina – MeVal

WŁA

Ś

CIWO

Ś

CI CHEMICZNE

Aminokwasy s

ą

zwi

ą

zkami amfoterycznymi, tworz

ą

sole obojnacze.

background image

5

NH

3

-CHR-COOH

NH

3

-CHR-COO

NH

2

-CHR-COO

OH

OH

H

H

NH

3

-CH

2

-COOH

NH

3

-CH

2

-COO

pK

a,1

= 2.4 (wplyw NH

3

)

K

a,1

NH

3

-CH

2

-COO

NH

2

-CH

2

-COO

pK

a,2

= 9.8 (NH

3

, a nie COOH)

K

a,2


punkt izoelektryczny


max. st

ęż

enie jonu obojnaczego (minimalny

ładunek)


Gly - pI = ½ (2.4 + 9.8) = 6.1




CH

2

COOH

NH

3

-CH-COOH

CH

2

COOH

NH

3

-CH-COO

CH

2

COO

NH

3

-CH-COO

pK

1

1.9

pK

2

CH

2

COO

NH

2

-CH-COO

pK

3

3.7

9.6

pI

= ½ (1.9 + 3.7) = 2.8 (Asp)

(CH

2

)

4

NH

3

NH

3

-CH-COOH

(CH

2

)

4

NH

3

H

3

N-CH-COO

(CH

2

)

4

NH

3

NH

2

-CH-COO

pK

1

2.2

pK

2

(CH

2

)

4

NH

2

NH

2

-CH-COO

pK

3

9.0

10.5


pI

= ½ (9.0 + 10.5) = 9.7 (Lys)



Ż

RÓDŁA AMINOKWASÓW

1. Hydrolizaty białkowe

2. Metody mikrobiologiczne

3. Metody enzymatyczne

rozdział racemicznych pochodnych Aaa

synteza asymetryczna

4. Metody syntetyczne

produkty achiralne/produkty chiralne


pK

a,1

+ pK

a,2

2

= pI

background image

6

SYNTEZA

1. Bromowanie i aminowanie kwasów karboksylowych

CH

3

CH

2

COOH

Br

2

PBr

3

CH

3

CHCOOH

Br

CH

3

CHCOOH

NH

2

NH

3,

H

2

O

(R,S)-Ala, 56%

80%

Małe zastosowanie, zwykle niskie wydajno

ś

ci.


2. Synteza Gabriela

(z ftalimidku potasu)

Alkilowanie anionu ftalimidowego (1,2-benzenodikarboksylowego). Czynnik alkiluj

ą

cy – produkt

bromowania malonianu dietylowego.

N K

O

O

+

HC

COOC

2

H

5

COOC

2

H

5

Br

N

O

O

CH

COOC

2

H

5

COOC

2

H

5

N

O

O

CR

COOC

2

H

5

COOC

2

H

5

1. EtO Na, EtOH
2. RX

H, T

N

O

O

CR

COOH

COOH

-CO

2

N

O

O

CHR

COOH

COOH

COOH

NH

3

-CHR-COO

ester imidomalonowy

3. Synteza Strecker’a

Działanie amoniakiem i cyjanowodorem na aldehydy.

R

C

O

H

C

OH

NH

2

H

R

C

NH

R

H

R

C

NH

2

CN

H

NH

3

-H

2

O

HCN

H, H

2

O, T

R-HC-COOH

NH

2

aminonitryl

4. Redukcyjne aminowanie

αααα

-oksokwasów

(laboratoryjny analog biosyntezy)

H

3

C

C

O

COOH

NH

3

NaBH

4

H

3

C

H

C

COOH

NH

2

R,S-Ala

kwas

αααα−−−−

oksopropanowy

(pirogronowy)

background image

7

5. Synteza amidomalonianowa

Najbardziej uniwersalna.

C

COOEt

COOEt

NH-CO-CH

3

C

COOEt

COOEt

NH-CO-CH

3

R

R-X

S

N

2

EtONa

C

COOEt

COOEt

NH-CO-CH

3

H

H

3

O

H

3

O

+ CO

2

+ 2EtOH + CH

3

COOH

C

COOEt

COOEt

NH-CO-CH

3

C

COOEt

COOEt

NH-CO-CH

3

R

R-X

S

N

2

EtONa

C

COOEt

COOEt

NH-CO-CH

3

H

H

3

O

H

3

O

R-CH-COOH

NH

2

+ CO

2

+ 2EtOH + CH

3

COOH

6. Syntezy enancjoselektywne (asymetryczne)

Np.:

A.

U

ż

ycie chiralnych katalizatorów otrzymanych na bazie metali przej

ś

ciowych:

H

2

C

C

COOH

NHCOCH

3

C

COOH

H

3

COCHN

H

3

C

H

chiralny kompleks Rh

H

2

kwas 2-acetyloaminopropenowy

B.

Biosynteza – redukcyjne aminowanie

α

-oksokwasów:

HOOCCH

2

CH

2

CCOOH

O

kwas

αααα−−−−

ketoglutarowy

(

α

αα

α−−−−

oksoglutarowy)

+ NH

4

+ NADPH

dehydrogenaza

glutaminianowa

HOOCCH

2

CH

2

CHCOOH

NH

2

+ NADP + H

2

O

L-Glu


Escherichia coli – synteza wszystkich kodowanych; człowiek – prócz 9 egzogennych

L-Glu (prekursor)

Gln, Pro, Arg

Wi

ę

kszo

ść

Aaa – grupa

α

-aminowa

Glu

H

C

R

NH

3

COO

+ R'CCOOH

O

transaminaza

R'CHCOO

NH

3

RCOCOOH +

7. Rozdział racemicznych aminokwasów:


A.

za pomoca deacylaz:

background image

8

NH

3

NHCOCH

3

Ac

2

O

deacylaza

H

3

N

C

R

H

COO

H

C

R

NHAc

COOH

+ CH

3

COOH

+

R-CH-COOH

R-CH-COO


B.

z u

ż

yciem chiralnych amin - (-)-chinina, (-)-strychnina, (-)brucyna lub kwasu (+) lub (-)

winowego

H

C

R

NH

3

COO

H

3

N

C

R

H

COO

Ph

C

R

H

NH

2

racemiczny Aaa

(R)-1-fenyloetyloamina

+

sól S,R

sól R,R

R-Aaa

S-Aaa


C.

HPLC z chiralnymi fazami stacjonarnymi (HPLC-CSP)

PEPTYDY


CH

C

N

H

CH

C

H

N

CH

C

OH

O

O

O

R"

R'

R

H

2

N

C-koniec

N-koniec

Aaa

1

Aaa

3

Aaa

2

Ła

ń

cuch główny, ła

ń

cuchy boczne (R, R’, R”)

Dipeptyd, tripeptyd…

Sekwencja Aaa w ła

ń

cuchu peptydowym:

H

3

N-H

2

C-C-NH-CH-COO

O

CH

3

H

3

N-HC-C-NH-CH

2

-COO

O

CH

3

Gly-Ala

Ala-Gly

SYNTEZA W ROZTWORZE

Gly + Ala

- H

2

O

Gly-Gly + Ala-Gly +

Gly-Ala

+ Gly-Gly-Ala....

background image

9

P

1

Gly + AlaOP

2

aktywacja

P

1

Gly-AlaOP

2

HGly-AlaOH


I. Osłona grupy aminowej (gł. grupy uretanowe):

A. Grupa benzyloksykarbonylowa (Z, Cbz):

C

6

H

5

CH

2

-O-C-Cl

O

+ NH

3

CHCOO

CH

3

NaOH

-NaCl
-HOH

C

6

H

5

CH

2

-O-C

O

CH

3

NHCHCOOH

chloromrówczan benzylu
(Z-Cl)

Z-Ala

C

6

H

5

CH

2

-O-C

O

NHCH

2

RCO--

H

2,

Pd

C

6

H

5

CH

3

+ CO

2

+ NH

2

-CHRCO-

C

6

H

5

CH

2

Br + CO

2

+ NH

3

-CHR-CO

-

HBr

B. Grupa tert-butoksykarbonylowa (Boc, BOC)

NH

3

-CHR-COO

+ (CH

3

)

3

CO-C-O- C-O-C(CH

3

)

3

O

O

diw

ę

glan tert-butylowy

B

-CO

2

-(CH

3

)

3

COH

(CH

3

)

3

COC

O

NHCHRCOOH

(Boc

2

O)

Zdejmowanie:

(CH

3

)

3

COC

O

NHCHRCO

HCl lub CF

3

COOH

H

3

NCHC

R O

+ CO

2

+ CH

2

=C(CH

3

)

2


C. Grupa fluorenylo-9-metoksykarbonylowa (Fmoc)

CH

2

O

CNH

O

C

H

R

COOH

NH

CH

2

x C

5

H

11

N

+ NH

2

-CH-COOH

R

Fmoc-Aaa

II. Osłona grupy karboksylowej: estry benzylowe, tert-butylowe, metylowe…

OBzl – H

2

/Pd

OtBu – TFA
OMe – NaOH

background image

10

III. Aktywacja grupy karboksylowej:

Dicykloheksylokarbodiimid DCC, C

6

H

11

N=C=N-C

6

H

11

R

C

O

OH

N

C

N

C

6

H

11

C

6

H

11

+

R-C=O-C

N-C

6

H

11

N

C

6

H

11

O

H

R-C-O-C

NC

6

H

11

NHC

6

H

11

R"-NH

2

O

R-C-O-C

O

NH

2

NC

6

H

11

NHC

6

H

11

R'

R-C

O

NH-R'

+ O=C

NHC

6

H

11

NHC

6

H

11

DCU

Synteza na no

ś

niku stałym (Merrifield’a)







R. Bruce Merrifield – nN 1984 r.


Automatyczne syntezatory peptydów – 1 Aaa – ok. 1 h

Synteza rybonukleazy (124 Aaa) – 369 reakcji,

12 000 zautomatyzowanych kroków;

η

= 17%

(1 etap> 99%)

Biosynteza – 150 Aaa w okre

ś

lonej sekwencji 1 min (!)



(CH

3

)

3

C-O-C

O

NH-CH-C

O

OH

R

+ Cl-CH

2

- R

B

Boc-Aaa

1

R

-CH

2

-

TFA

R

3

N

NH

2

-Aaa

1

R

-CH

2

-

Boc-Aaa

2

OH

R

Boc-Aaa

2

-Aaa

1

-CH

2

-

TFA

Et

3

N

Boc-Aaa

3

OH

R

Boc-Aaa

3

-Aaa

2

-Aaa

1

-CH

2

-

HF

Aaa

3

-Aaa

2

-Aaa

1

-OH

+ F-CH

2

-

R

DCC

DCC

background image

11

STRUKTURA POLIPEPTYDÓW /BIAŁEK

Sekwencja Aaa w ła

ń

cuchu peptydowym –

1° struktura peptydu/białka

Płaski układ wi

ą

zania peptydowego/amidowego:

C

C

O

N

H

HN

C

NH

O

R

H

H

R

C

C

O

N

H

HN

C

NH

O

R

H

H R











Sekwencja insuliny wołowej:

Kiedy

ś

– trzustka zabitych zwierz

ą

t; teraz – bakterie z genami ludzkiej insuliny.

Aspartam - Asp-Phe-OCH

3

Glutation -

γ

-Glu-Cys-Cys

Płasko

ść

wi

ą

zania amidowego, konfiguracja cis, oddziaływania mi

ę

dzy ła

ń

cuchami bocznymi

konfiguracja

trans


Minimalizowanie oddziaływa

ń

sterycznych i maksymalizowanie elektrostatycznych, dyspersyjnych

i wodorowych

background image

12

2° Struktura peptydu/białka –

lokalna konformacja ła

ń

cucha peptydowego

Charakterystyczne typy kształtu ła

ń

cucha polipeptydowego

wynikaj

ą

ce z oddziaływania niedaleko le

żą

cych reszt Aaa

X-ray, 2D-NMR



ββββ

-Kartki (harmonijka

β

, pofałdowany arkusz

β

,

β

-sheet) – równoległa i antyrównoległa

(np. fibroina jedwabiu)

Wi

ą

zania wodorowe mi

ę

dzy dwoma ła

ń

cuchami peptydowymi.


Równoległa

β

-kartka:

background image

13

Helisy

αααα

-Helisa,

helisa

3,6

13

, (np. keratyna włosów) - wewn

ą

trzcz

ą

steczkowe w.wodorowe mi

ę

dzy C=O

reszty n i NH (n+4); s = 5.4

)

superhelisa

Lokalizacja reszt w globularnych białkach:

background image

14

1. Reszty z niepolarnymi ła

ń

cuchami bocznymi (Val,Leu, Ile, Phe…) – wewn

ą

trz białka,

ograniczony kontakt z wodnym

ś

rodowiskiem;

2. Ła

ń

cuchy boczne reszt polarnych (Arg, Lys, Glu, Asp) – zwykle na powierzchni;

3. Nienaładowane polarne ła

ń

cuchy boczne (Ser, Thr, Trp, Tyr, Asn) – cz

ę

sto na powierzchni,

ale tak

ż

e, zwi

ą

zane wodorowo - wewn

ą

trz cz

ą

steczki.

Konformacja statystycznego kł

ę

bka.

3° Struktura peptydu/białka

struktura trójwymiarowa wynikaj

ą

ca z dalszego fałdowania

ła

ń

cucha polipeptydowego.


Białka globularne (np. mioglobina, hemoglobina) – wi

ę

ksze fałdowanie (ekspozycja grup

hydrofilowych do

ś

rodowiska); odpowiedzialne za transport chemiczny i kataliz

ę

.


Białka fibrylarne

(np. miozyna – mi

ęś

nie, fibryna – skrzepy krwi,

α

-keratyna - włosy) –

„superhelisa”

Trzeciorz

ę

dowa struktura enzymów, białek transportuj

ą

cych – miejsce aktywne


Białka: fibrylarne, globularne, membranowe

4° Struktura białka -

sposób w jaki kilka ła

ń

cuchów polipeptydowych (podjednostki; domeny) ł

ą

czy

si

ę

w agregat.

Denaturacja – zniszczenie 3° struktury białka (

precypitacja, zniszczenie aktywno

ś

ci

katalitycznej…)












background image

15

Okre

ś

lanie struktury 1° (sekwencjonowanie)

I.

Oczyszczanie polipeptydów:
1. Dializa;
2. Chromatografia s

ą

czenia molekularnego (gel-filtration chromatography);

3. Chromatografia jonowymienna;
4. Elektroforeza (> 1000 białek w 1 eksperymencie!);
5. Chromatografia powinowactwa (affinity chromatography).

II.

Badanie składu aminokwasowego: analizator aminokwasów lub MS

Analizator Aaa

a/ hydroliza (6 N HCl, 110 °C, 24 h);
b/ analiza aminokwasowa – kolumna z naładowanym ujemnie no

ś

nikiem, wymywanie

buforami, po elucji – reakcja z ninhydryn

ą

.

O

O

OH

OH

+ NH

2

CHCOOH

R

O

O

O

O

N

OH

H

2

O

+ R

C

O

H

+ CO

2

Absorbancja = f(t):

III.

Sekwencjonowanie tradycyjne:

a/ Ustalanie aminokwasu N
-terminalnego:

Degradacja Edman’a:

Odczynnik Edmana = tiocyjanian fenylu

N

C

S

+ NH

2

-CH

2

-C-NH-CH-CO

O

CH(CH

3

)

2

Ph-NH-C-NH-CH

2

-C-NH-CH-CO

S

CH(CH

3

)

2

O

H, H

2

O

C

N

C

CH

2

NH

O

S

Ph

+

+ NH

2

-CH-CO

CH(CH

3

)

2

N-fenylotiohydantoina glicyny

PTH(Gly)

1. PhN=C=S

2. H, H

2

O

PTH(Val) + skrócony peptyd

background image

16

Sekwenatory automatyczne - zwykle do 50 Aaa (nagromadzanie produktów ubocznych)

oznaczanie sekwencji w segmentach, inna hydroliza – oznaczenie uło

ż

enia segmentów.

Trypsyna – hydroliza przy COOH Lys, His
Chymotrypsyna – po Phe, Trp, Tyr

b/ Sekwencjonowanie z u

ż

yciem rekombinacyjnej technologii DNA


c/ Oznaczanie reszty C
-ko

ń

cowej:

Inkubacja polipeptydu z karboksypeptydaz

ą

. Badania pojawiaj

ą

cego si

ę

Aaa. Peptyd z

nowym C-ko

ń

cem – dalsza degradacja.

Karboksypeptydaza A (trzustka wołowa) – prócz Pro, Arg, Lys
Karboksypeptydaza B (trzustka wieprzowa) – tylko gdy C-terminalna Arg lub Lys

Karboksypeptydaza A + B – wszystkie prócz Pro

Karboksypeptydaza C (li

ś

cie cytrusów) – wszystkie

Karboksypeptydaza Y (dro

ż

d

ż

e) – wszystkie

Strategia sekwencjonowania białek:

1. Gdy kilka ła

ń

cuchów polipeptydowych – rozdział (ekstremalne pH, 8M mocznik,

chlorowodorek guanidyny…).


2. Rozerwanie mostków disiarczkowych:

Gdy S-S mi

ę

dzyła

ń

cuchowe 2

1


modyfikacje reaktywnego SH:

background image

17

3. Ustalanie składu aminokwasowego.

4. Identyfikacja reszty C- i N-ko

ń

cowej (karboksypeptydazy, degradacja Edmana).


5. Hydroliza na mniejsze fragmenty, ustalanie ich sekwencji (trypsyna – po Arg, Lys,
chymotrypsyna – po aromatycznych Aaa, bromocyjan – po Met…).

lakton homoseryny

CNBr w 70% HCOOH

niestabilny w wodzie
produkt posredni


6. P-kt 5 powtórzony po innej proteolizie, generowanie nakładaj

ą

cych si

ę

fragmentów.


7. Rekonstruowanie sekwencji na podstawie nakładaj

ą

cych si

ę

fragmentów/

determinacja sekwencji na podstawie MS.

8. Lokalizacja mostków S-S.
















Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
01 Aminokwasy, peptydy, białka, enzymyid 3054 ppt
68 Aminokwasy peptydy i bialka(1)
68 Aminokwasy peptydy i bialka
Aminokwasy,peptydy,białka i inne
Aminokwasy, peptydy, białka
Chemia 6 Aminokwasy Peptydy i Białka
AMINOKWASY, PEPTYDY, BIAŁKA
Aminokw,peptydy,białka,enzymy
01 Aminokwasy, peptydy, białka, enzymyid 3054 ppt
Chemia 6 Aminokwasy Peptydy i Białka
Aminokwasy, peptydy, białka
Peptydy i białka
8 AMINOKWASY, PEPTYDY, BIA id 4 Nieznany (2)
Æwiczenie 7 Aminokwasy, peptydy i bia³ka
Peptydy i białka
AMINOKWASY I PEPTYDY

więcej podobnych podstron