PODSTAWY GENETYKI MEDYCZNEJ

II rok Wydziału Lekarskiego

Seminarium: „Podstawy cytogenetyki”

1.

Prawidłowe chromosomy człowieka:

1.1.

Budowa chromatyny (chromatyna to każde połączenie kwasu nukleinowego z białkami)
-

nukleosom: rdzeń histonowy (oktamer – po 2 cząsteczki histonów H2A, H2B, H3, H4) – na

nim ok. 2,5-krotnie nawinięta nić DNA;

-

nukleosomy tworzą tzw. włókno elementarne (koralikowe) – między nukleosomami

odcinek DNA długości ok. 80pz;

-

włókna elementarne zwijają się w spiralę – tzw. włókno chromatynowe – 30nm średnicy ;

-

dalsze zagęszczanie włókien chromatynowych z udziałem kwaśnych białek jądrowych –

euchromatyna (luźna, aktywna) i heterochromatyna (zbita, nieaktywna, zawiera histon H1).

1.2. Chromosomy – powstają jedynie dla potrzeb podziału komórkowego

-

budowa molekularna – kwaśny rdzeń białkowy + pętle włókien chromatynowych (Laemliego);

-

chromosomy: profazowe, prometafazowe, metafazowe (najbardziej skondensowane),

-

chromosomy metafazowe – podstawowy obiekt rutynowych badań cytogenetycznych –

wielkość: średnica: ok. 1,5µm, długość: 2-10µm, w późnej metafazie – dwie chromatydy;

-

budowa morfologiczna:

o

centromer (cen) – złożona struktura białkowa (antygeny centromerowe) +

niekodujące sekwencje powtarzalne DNA (zwł. tzw. sekwencja α);

o

ramiona krótkie (p) i długie (q);

o

telomery (tel) – zbudowane z niekodujących sekwencji powtarzalnych.

1.2.

Klasyfikacja chromosomów człowieka:
-

wg proporcji ramion: metacentryczne, submetacentryczne i akrocentryczne;

-

wg wielkości i proporcji ramion: 7 grup – A-G;

-

autosomy (pary 1-22) i heterochromosomy (chrom. płciowe) (XX u kobiet, XY u mężczyzn);

-

46 (2n) chromosomów w prawidłowej, diploidalnej komórce somatycznej;

-

23 (1n) chromosomy w prawidłowej, haploidalnej gamecie.

2.

Aberracje chromosomowe:

2.1.

Klasyfikacja aberracji chromosomowych

Aberracje liczbowe:

-

euploidie (wielokrotność haploidalnej liczby chromosomów)

o

poliploidie: triploidia (3n=69 chromosomów), tetraploidia (4n=92 chromosomy);

-

aneuploidie (każda inna liczba chromosomów, zwykle nadmiar lub niedobór pojedynczych

chromosomów)

o

monosomia (brakuje jeden chromosom danej pary) – np. 45,X (z. Turnera)

o

trisomia (jeden nadliczbowy chromosom danej pary) – np. 47,XY,+21 (z. Downa)

o

tetrasomia, pentasomia itd. (więcej nadliczbowych chromosomów)

Aberracje strukturalne:

-

zrównoważone (prawidłowa ilość materiału genetycznego) – np. translokacje

zrównoważone, inwersje

-

niezrównoważone (nadmiar lub/i niedobór materiału genetycznego) – np. translokacje

niezrównowazone, insercje, delecje, duplikacje, izochromosomy, chromosomy pierścieniowe)

2.2.

Fenotypowe skutki aberracji chromosomowych
-

niepowodzenia rozrodu (niepłodność, poronienia samoistne, ciąże obumarłe, martwe

urodzenia) – zwykle u nosicieli zrównoważonych aberracji strukturalnych, niepłodność
również u osób z aberracjami liczbowymi chromosomów płciowych;

-

zespoły wad wrodzonych u żywo lub martwo urodzonych dzieci, zwykle z opóźnieniem

rozwoju psychomotorycznego (niepełnosprawnością intelektualną) – u wszystkich dzieci z
liczbowymi i niezrównoważonymi aberracjami strukturalnymi w zakresie autosomów;

Fenotyp sugerujący niezrównoważenie kariotypu w zakresie autosomów obejmuje:

o

dystrofię wewnątrzmaciczną,

o

dysmorfię twarzy, dłoni, stóp, małżowin usznych;

o

mnogie wady narządów wewnętrznych (najczęściej serca) – zespół wad

wrodzonych;

o

opóźnienie rozwoju psychoruchowego (niepełnosprawność intelektualna).

-

zaburzenia determinacji płci (zwykle u osób z aberracjami chrom. płciowych).

2.3.

Częstość występowania aberracji chromosomowych – ogółem:
-

ok. 0,6% noworodków; ok. 4% rozpoznanych ciąż; ok. 15% wszystkich ciąż;

-

zdecydowana większość letalna w okresie życia wewnątrzmacicznego (prenatalnie);

-

aberracje letalne w okresie prenatalnym: poliploidie, wszystkie monosomie autosomów,

zdecydowana większość monosomii X i trisomii autosomów (zwł. częsta trisomia 16);

-

aberracje najczęściej stwierdzane u żywo urodzonych dzieci: trisomie chromosomów

płciowych, trisomia 21, trisomia, 18, trisomia 13, monosomia X;

2.4.

Poliploidie
-

triplodia – 3n=69 chromosomów – w 80% przypadków efekt podwójnego zapłodnienia

(dispermia), w 20% przypadków efekt zapłodnienia, nieprawidłowej, diploidalnej komórki
jajowej;

o

fenotyp: letalny, ciężkie wady wewnętrzne, nieproporcjonalna głowa, duże łożysko,

syndaktylia 3 i 4 palca dłoni

-

tetraplodia – 4n=92 chromosomy – efekt nieprawidłowego pierwszego podziału zygoty;

2.5.

Aneuplodie
-

najczęstsze: 47,XXY (1 na 500 urodzeń), 47,XYY i trisomia 21 (po 1 na 700 urodzeń);

-

rzadziej: 47,XXX, 45,X, trisomia 18, trisomia 21

-

podstawowy mechanizm powstawania: nondysjunkcja mejotyczna (nieprawidłowy rozdział

chromosomów homologicznych lub chromatyd siostrzanych), znacznie rzadziej – tzw.
opóźnienie anafazowe;

-

podstawowy czynnik ryzyka: zaawansowany wiek matki:

o

15-30r.ż. – ryzyko niemal niezmienne (np. trisomia 21: od 1:1400 do 1:1000 urodzeń);

o

30-35r.ż. – powolny wzrost (np. trisomia 21: od 1 na 1000 do 1 na 300 urodzeń);

o

powyżej 35r.ż. – szybki wzrost geometryczny (np. trisomia 21: 35r.ż. – 0,3-0,4%, ,

40r.ż. – 1,3%, 45r.ż. – 4,5%, 47r.ż – 7%.

2.6. Najważniejsze zespoły aberracji chromosomowych
2.6.1. Zespół Downa

-

60% ulega poronieniom; częstość populacyjna ok. 1 na 700 żywych urodzeń

-

fenotyp: cechy dysmorfii (skośno-górne ustawienie szpar powiekowych, epicanthus,

hiperteloryzm, plamki Brushfielda na tęczówce, duży język, płaski profil, niżej usadzone
małżowiny uszne, płaska potylica, bruzda poprzeczna, brachydaktylia, bruzda podeszwowa,
zwiększony odstęp palucha), wady wrodzone (wady serca, zarośnięcie dwunastnicy,
niedoczynność tarczycy), opóźnienie rozwoju/niepełnosprawnośc intelektualna;

-

postacie cytogenetyczne: trisomia 21 (95%), niezrównoważona translokacja robertsonowska

(3-4% - uwaga – trzeba zbadać kariotyp rodziców w kierunku nosicielstwa!), mozaika
trisomii 21 (1-2% - zwykle z udziałem prawidłowej linii komórkowej);

-

średnia długośc życia 40 lat.

2.6.2. Zespół Edwardsa

-

95% ulega poronieniom; częstość populacyjna ok. 1 na 3000 żywych urodzeń;

-

fenotyp: dystrofia wewnątrzmaciczna, wzmożone napięcie mięśniowe, zaciśnięte piąstki z

zachodzącymi na siebie palcami, wady stóp, wady serca, dysmorfia (wypukła potylica,
retrognatia, nisko osadzone małżowiny uszne, bruzdy poprzeczne);

-

cytogenetycznie: trisomia 18, niezwykle rzadko niezrównoważone translokacje

-

tylko 10% dzieci przeżywa 1 rok życia – wówczas głębokie upośledzenie.

2.6.3. Zespół Patau

-

ponad 95% ulega poronieniom, częstość populacyjna ok. 1 na 5000 żywych urodzeń;

-

fenotyp: wady OUN (holoprosencefalia), wady oczu (małoocze, hipoteloryzm, synoftalmia,

cyklopia), rozszczep wargi i podniebienia, wady nosa i uszu, wady skóry głowy, bruzdy
poprzeczne, polidaktylia zaosiowa, wady serca

-

cytogenetycznie: trisomia 13 (75%), niezrównoważona translokacja robertsonowska (20% -

uwaga - trzeba zbadać kariotyp rodziców w kierunku nosicielstwa!), mozaika trisomii 13
(5% - zwykle z udziałem prawidłowej linii komórkowej);

-

olbrzymia większość umiera w pierwszych miesiącach życia.

2.6.4. Zespół Turnera

-

99% ulega poronieniom, częstość populacyjna ok. 1 na 5000 żywo urodzonych

dziewczynek;

-

fenotyp: niski wzrost (zwykle 130-145cm), dysgenezja jajników (brak rozwoju wtórnych

cech płciowych, pierwotny brak miesiączki, niepłodność), obrzęk limfatyczny dłoni i stóp
(niemowlęta!), wady wrodzone (koarktacja aorty, wady układu moczowego), dysmorfia
(płetwista szyja, puklerzowata klatka piersiowa, koślawość łokci, niska tylna linia
owłosienia, skrócenie 4 kości śródręcza, wysokie podniebienie, nisko osadzone uszy,
hipoplazja paznokci)

-

uwaga! – nie ma niepełnosprawności intelektualnej (możliwe różne specyficzne deficyty

poznawcze)

-

cytogenetycznie: monosomia X (45,X – ok. 40-50% pacjentek), mozaiki z dominującą linią

45,X (ok. 25%), aberracje strukturalne jednego chromosomu płciowego (np. izochromosom
Xq, delecje Xp, chromosom pierścieniowy X, delecje Yp);

2.6.5. Zespół Klinefeltera

-

zwykle nie ulegają poronieniom, częstość populacyjna (1na 500-1000 żywo urodzonych

chłopców);

-

fenotyp: wysoki wzrost, smukła sylwetka ciała (u otyłych – eunuchoidalna), małe i twarde

jądra, słaby rozwój wtórnych cech płciowych, słabe owłosienie, ginekomastia, niepłodność,
częste: skolioza, cukrzyca, osteoporoza, nadciśnienie

-

rozwój intelektualny zwykle w granicach normy – możliwe trudności w nauce, zaburzenia

zachowania;

-

cytogenetycznie: 47,XXY (ok. 80-85%), mozaiki 47,XXY/46,XY (ok. 15-20%).

2.6.6. Zespoły 47,XYY i 47,XXX

-

występują z częstością ok. 1 na 1000 żywych urodzeń odpowiednio chłopców i

dziewczynek;

-

fenotyp zazwyczaj całkowicie prawidłowy, wysoki wzrost, zdrowe potomstwo

-

w zespole 47,XYY częste zaburzenia zachowania (w tym agresja, nadpobudliwość);

-

w zespole 47,XXX częste trudności w nauce (ok. 20% lekka niepełnosprawność

intelektualna).

2.6.7. Zespoły aberracji strukturalnych

-

na ogół bardzo rzadkie, nie mają swoich nazw (wyjątek: zespół krzyku kota – del5p i zespół

Wolffa-Hirschhorna – del4p);

-

dzieci z tym samym defektem cytogenetycznym prezentują jednak podobne fenotypy;

-

specyficzne fenotypy zespołów mikrodelecyjnych !

-

możliwość rodzicielskiego piętnowania genomowego (np. zespoły Pradera-Willi’ego i

Angelmana – del15q11-12);

UWAGA ! ROZPOZNANIE KAŻDEGO ZESPOŁU ABERRACJI CHROMOSOMOWEJ

MUSI BYĆ POTWIERDZONE WYKONANYM BADANIEM KARIOTYPU !

2.7.Wskazania do badania kariotypu:

-

kliniczne rozpoznanie lub podejrzenie zespołu aberracji chromosomowej;

-

kliniczne rozpoznanie lub podejrzenie zespołu mikrodelecyjnego;

-

niepowodzenia rozrodu (2 poronienia lub martwe ciąże, 1 martwe urodzenie, niepłodność);

-

upośledzenie umysłowe o niejasnej etiologii, zwł. u chłopców;

-

zaburzenia determinacji i różnicowania płci;

-

znaczny niedobór wzrostu, zwł. u kobiet;

-

diagnostyka prenatalna u kobiet po 35 roku życia.

Uwaga! Ponadto wykonuje się badania cytogenetyczne w wybranych chorobach niebędących
aberracjami chromosomowymi, gdyż dostarczają one cennych danych diagnostycznych:

-

białaczkach – ocena rearanżacji chromosomowych jest niezbędna do oceny typu białaczki;

-

zespole łamliwego chromosomu X (upośledzenie umysłowe, zwykle u mężczyzn z

charakterystycznym fenotypem – zespół Martina-Bella, miejsce łamliwe Xq27);

-

zespołach wzmożonej łamliwości chromosomów (np. z. Fanconiego, z. Blooma, z.

Nijmegen)

3.

Metodyka badań cytogenetycznych :

W badaniach cytogenetycznych wykorzystuje się mikroskop świetlny i ocenia się liczbę i strukturę
chromosomów w komórce.
Do badań potrzebne są żywe komórki jądrzaste.
Hodowla komórkowa:

-

medium hodowlane: sól fizjologiczna, glukoza, surowica, bufory (zwykle dwuwęglanowe),

antybiotyk (zwykle kanamycyna), mitogen (zwykle fitohemaglutynina);

-

specjalne naczynia i warunki pełnej sterylności;

-

cieplarka, 37

o

C, 72 godziny;

-

zablokowanie mitozy w stadium metafazy (kolchicyna = kolcemid);

-

wstrząs hipotoniczny, utrwalanie, barwienie.

3.1. Rutynowe badanie kariotypu

-

limfocyty krwi obwodowej;

-

chromosomy metafazowe;

-

barwienie metodą GTG (trawienie trypsyną + fiolet Giemsy) – tzw. prążki G;

-

analiza liczby i struktury chromosomów z 15 mitoz;

-

rozdzielczość (pojedynczy prążek) – 5-10 Mpz

3.2. Modyfikacje badań cytogenetycznych w trudnych przypadkach

-

podejrzenie mozaikowości – analiza 50-100 mitoz lub druga analiza komórek pochodzących

z innego lista zarodkowego;

-

podejrzenie małych aberracji strukturalnych (np. mikrodelecji) – technika HRBT (ang. high

resolution banding technique) – analiza chromosomów prometafazowych (długie,
nitkowate) – rozdzielczość (jeden prążek) – 2-3 Mpz

-

wszystkie przypadki trudne diagnostycznie – technika FISH

3.3. Technika FISH (ang. fluorescence in situ hybridization) – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

-

wykorzystuje zjawisko hybrydyzacji in situ – zdolność jednoniciowego fragmentu DNA (tzw.

sondy molekularnej) do wyszukania komplementarnego odcinka DNA i połączenia się z nim;

-

dzięki fluorescencyjnemu wyznakowaniu sondy, można stwierdzić czy i gdzie sonda uległa

przyłączeniu (hybrydyzacji);

-

sondy malujące (mieszanina fragmentów pokrywająca cały chromosom) lub sondy

specyficzne (dla danego fragmentu chromosomu);

-

preparat cytogenetyczny wykonywany podobnie, ale dodatkowo: denaturacja DNA (70%

formamid w 70

o

C) i wytrawianie RNAzą.

-

rozdzielczość zależna od obiektu, do którego następuje hybrydyzacja:

o

chromosomy metafazowe: ok. 1 Mpz;

o

jądra interfazowe: do ok. 100 kpz (metoda b. szybka, bez hodowli komórkowej!)

o

rozciągnięte włókna chromatynowe: do ok. 10 kpz

-

zastosowanie: trudne przypadki diagnostyki aberracji chromosomowych (np. mikrodelecje,

chromosomy markerowe, translokacje, badania prenatalne), badania cytogenetyczne
nowotworów (zwł. białaczki), mapowanie genów i sekwencji DNA, badania eksperymentalne