Podstawy Cytogenetyki Klasycznej!

Cytogenetyka - nauka badająca chromosomy (liczbę i strukturę) oraz ich związek z dziedziczeniem cech

Badanie cytogenetyczne - wykonanie hodowli komórkowej oraz barwień chromosomów w celu sprawdzenia prawidłowości liczby i struktury chromosomów.

Badanie:

• Etap I - pobranie materiału

• Etap II - hodowla komórkowa

• Etap III - traktowanie hodowli i utrwalanie

• Etap IV - barwienie chromosomów

• Etap V - analiza cytogenetyczna

• Etap VI - analiza wyników

KREW OBWODOWA - do rutynowego badania cytogenetycznego, do celów medycznych, uzyskuje się chromosomy o najwyższej rozdzielczości, pobiera się u dorosłych i dzieci.

PŁYN OWODNIOWY - do rutynowego badania prenatalnego, otrzymywana rozdzielczość wyższa niż w przypadku trofoblastu, ale niższa niż w krwi.

TROFOBLAST - pobiera się do wczesnego badania prenatalnego, ale rozdzielczość chromosomów niska (9 - 11 tydzień ciąży) dla wykluczenia trisomii w przypadku ciąży wysokiego ryzyka.

FIBROBLASTY - pobiera się w przypadku prawidłowego wyniku z krwi, a podejrzenia mozaiki chromosomowej obecnej tylko w skórze lub narządach np. trisomia 8, mozaikowatość, najlepszy materiał do badań post mortem.

KREW I SZPIK CHORYCH NA BIAŁACZKĘ - kariotyp nieprawidłowej komórki ma duże znaczenie w rokowaniu i sposobie leczenia, rozdzielczość jest niska, ale udaje się rozpoznać znane aberracje np. chromosom Filadelfia.

Techniki hodowli komórkowej:

• Hodowla limfocytów

• Hodowla fibroblastów

• Hodowla amniocytów i komórek trofoblastu

• Hodowle tkankowe

Hodowla limfocytów krwi obwodowej (w zawiesinie):

ZAKŁADANIE HODOWLI IN VITRO

• Do badań, w zależności od liczby zakładanych hodowli, pobiera się od 5 do 10 ml krwi żylnej, do strzykawki zawierającej heparynę (0,5..). Tego samego dnia zakładamy hodowle.

• Strzykawkę z heparynizowaną krwią należy odstawić na dwie godziny w pozycji pionowej (igłą zgiętą pod kątem 45* do góry) pod wyciągiem biologicznym.

• Osocze wraz z limfocytami oraz kilkoma kroplami pozostałej frakcji zawierającej krwinki czerwone przenosimy na podłoże (np. RPMI 1640) wzbogacone następującymi składnikami:

• 10% surowicą płodową cielęcą (FBSI zawierającą czynniki wzrostowe

• 1% gentamycyną

• 1% L-glutaminy

• Hodowle poddaje się inkubacji w 37*C w cieplarce z nawiewem 5% CO2 w celu namnożenia w warunkach In vitro limfocytów z pobranego materiału i uzyskania komórek mitotycznych

PRZEDTRAKTOWANIE MATERIAŁU

• Po upływie wyznaczonego czasu trwania hodowli (dla hodowli standardowej 72h) limfocyty przedtraktuje się analogiem kolchicyny, kolcem idem, który determinuje demontaż wrzeciona kariokinetycznego, prowadząc w efekcie do nagromadzenie komórek w stadium metafazy. Po dodaniu kolcem idu materiał poddaje się 1h inkubacji.

• Jeśli zakładamy hodowle limfocytów celem uzyskania dużej rozdzielczości prążkowej chromosomów (HRB) wówczas po upływie 48h dodajemy do hodowli tymidynę bądź MTX, co pozwala na zwiększenie w hodowli liczby komórek w stadium profazy i wczesnej metafazy.

UTRWALANIE MATERIAŁU

• Wirowanie materiału w probówkach stożkowych

• Zawieszenie w roztworze hipotonicznym 75 mM KCL

• Inkubacja w 37*C 25 min

• Utrwalanie: zawieszenie w utrwalaczu (metanol : kwas octowy w stosunku objętościowym 3 : 1)

• Otrzymujemy zawiesinę jąder komórkowych i metafaz w utrwalaczu

• Utrwalony materiał przechowywać w zamrażalniku (-20*C)

PRZYGOTOWYWANIE PREPARATÓW:

• Szkiełka umyte ciepłą wodą i płynem wysuszyć

• Zanurzyć szkiełka w 96% etanolu i wytrzeć do sucha papierem

• Na suche szkiełko nakropić dwie krople czystego utrwalacza (powinien w równomierny okrąg się ułożyć)

• Na mokre miejsca nakropienie utrwalacza nakropić dwie krople materiału (odległość około 3cm)

• Suszyć pod wyciągiem

• Przechowywać w cieplarce 37*C (min. tydzień)

KONTROLA JAKOŚCI PREPARATU CYTOGENETYCZNEGO!

HODOWLA AMNIOCYTÓW Z PŁYNU OWODNIOWEGO - hodowla komórek adhezyjnych.

• Zakładanie

• Płyn owodniowy wirujemy 1000 - 1250 r p m

• Odrzucamy supernatant (pozostawić około 3ml)

• Zakładamy hodowle In situ na szkiełkach w naczyniach typu falcon

• Podłoże do hodowli komórkowych, specjalnie gotowe lub przygotowywane, polecane przez większość laboratoriów - amniomax.

MONITOROWANIE WZROSTU HODOWLI

• Inkubacja 7 - 18 dni w 37*C 5% CO2

• Od dnia 5 monitorujemy wzrost komórek pod mikroskopem z odwróconą płytką

• W fazie intensywnego wzrostu traktujemy kolcem idem około 3 - 4h

TECHNIKI CYTOGENETYKI KLASYCZNEJ.

• TECHNIKI PRĄŻKOWE - techniki barwienia prążków euchromatynowych:

• Prążkowanie G

• Prążkowanie Q

• Prążkowanie R

PRĄŻKI CHROMOSOMOWE - chromosomy metafazowe i prometafazowe posiadają naprzemiennie ułożone jasne i ciemne prążki widoczne po odpowiednim wybarwieniu, odzwierciedlające różnice strukturalne w nagromadzeniu domen chromatynowych oraz określające regiony genomu różniące się właściwościami i funkcją.

• G => rutynowa technika służąca do analizy diagnostyczno - cytogenetycznej chromosomów celem oznaczenia kariotypu

• Umożliwia identyfikację poszczególnych chromosomów kariotypu oraz wykrywanie i rozpoznawanie anomalii chromosomowych (aneuploidalność, delecja czy translacja)

• Ciemne (pozytywne) prążki G odpowiadają regionom o dużej zawartości par AT, późno replikującym DNA i zawierającym nieliczne aktywne geny.

PROCEDURA BARWIENIA

• Trawienie - trypsyna (0,005%)/EDTA 30*C ok. 1 - 1'30

• Płukanie - woda wodociągowa

• Barwienie - barwnik Giemzy

• Płukanie - woda wodociągowa

• Suszenie

• Analiza

• Q => prążki Q powstają w wyniku traktowania chromosomów fluorochromem guinakryną, która wiąże się selektywnie z regionami AT i intensywnie je wybarwia

• Rozkład jasnych i ciemnych prążków Q o różnej intensywności fluorescencji, odpowiada wzorowi prążków G (jasne Q = ciemne G)

• Znajduje zastosowanie w identyfikacji oraz klasyfikacji wszystkich chromosomów kariotypu człowieka i ich aberracji

• R => barwienie odwrotne w stosunku do widocznego w prążkowaniu G i Q

• Chromatyna wiąże się z regionami bogatymi w pary GC i barwi je intensywnie, stąd prążki R cechuje największe nagromadzenie genów

• Technika stosowana do identyfikacji wszystkich chromosomów i ich aberracji, szczególnie tych umiejscowionych w dystalnych regionach chromosomów

• Techniki uzyskiwania prążków hetero chromatynowych:

• Prążkowanie C

• Barwienie DA/DAPI

• C => pozwala na uwidocznienie prążków chromosomowych odpowiadających heterochromatynie konstytutywnej (obszar centromerów, ramię q chromosomy Y)

• HCl depurynuje DNA, Ba(OH)2 powoduje pęknięcia w miejscach pozbawionych puryny, SSC wypłukuje fragmenty DNA. Powoduje to wypłukanie większości regionów za wyjątkiem heterochromatyny. GIEMZA - uwidacznia chromatyny konstytutywne

• Zastosowanie: rozpoznawanie wariantów morfologicznych heterochromatyny7 konstytutywnej chromosomów 1, 9, 16 i Y; rozpoznawanie chromosomów dicentrycznych; identyfikacja inwersji w obszarze heterochromatyny.
  Chromosom markerowy - może posiadać materiał z innych chromosomów, dodatkowy chromosom obok 46 prawidłowych.

• DA/DAPI => fluor ochrom DAPI barwi regiony heterochromatyny bogate w pary AT

• Dystamycyna wzmacnia specyficzne barwienia DAPI

• Barwienie DA/DAPI stosuje się do identyfikacji heterochromatyny okołocentromerowej chromosomów 1, 9, 16, oraz krótkiego ramienia 15 i długiego Y.

METODA SREBRZENIA - AgNOR

• Pozwala na wykrycie miejsc organizatora jąderka w chromosomach

• Umożliwia lokalizację tylko aktywnych loci rDNA

• Jonu Ag plus reagują z białkami obecnymi w regionach NOR, głównie z nukleoliną, numatryną i podjednostką polimerazy RNA 1.

ZASTOSOWANIE:

• Badanie chromosomów markerowych

• Badanie wariantów morfologicznych chromosomów akrocentrycznych

• Badanie translokacji obejmujących krótkie ramiona chromosomów akrocentrycznych

ANALIZA CYTOGENETYCZNA, niezbędny sprzęt:

• Tzw. England Finder - pozwala na odnalezienie obiektu na dowolnym mikroskopie

• Zestaw komputerowy do fotografii, obróbki i analizy obrazu

• Dobrej klasy mikroskopy świetlne 100x wys. aparatura

** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** **

---