Podstawy cytogenetyki człowieka

Wstęp

Cytogenetyka człowieka jest nauką młodszą od cytogenetyki innych organizmów,

gdyż o jej istnieniu mówić można dopiero od roku 1956, kiedy to po długich i
ciężkich badaniach komuś mądremu udało się wreszcie stwierdzić, że człowiek ma
nie 48, a 46(!) chromosomów, co jak wiemy wymagało zastosowania obliczeń o
wprost niewiarygodnym stopniu złożoności.

Z początku badania cytogenetyczne przeprowadzane były stosunkowo rzadko,

gdyż głównym źródłem komórek były punkcyjne nakłucia szpiku czy jąder, a
takowe nakłucia niosą ze sobą dość duże ryzyko dla pacjenta, a poza tym mało
który mężczyzna da sobie nakłuć… kość udową celem pobrania szpiku. Przełomem
na tym polu było opracowanie prowadzenia hodowli limfocytów krwi obwodowej,
co jest możliwe przy dodaniu do hodowli tzw. Fitohemaglutyniny, która to
powoduje odróżnicowanie limfocytów do form młodocianych, które zaczynają się
intensywnie dzielić. Hodowlę taką przeprowadza się na odpowiedniej pożywce z
zastosowaniem krwi heparynowanej, następnie dodaje się kolchicyny i odwirowuje
frakcję limfocytów z hodowli. Następnie komórki poddaje się obróbce,
prowadzącej do rozluźnienia odróżnicowanych limfocytów, co poprawia
widoczność chromosomów. Następnie barwi się preparaty met. Giemsy lub
innymi. Analizy dokonujemy na największym powiększeniu mikroskopu,
wykonując mikrofotografie, z których następnie wycina się kawałki zdjęcia z
poszczególnymi chromosomami i odpowiednio układa. Celem poprawienia
dokładności stosuję się metody radiograficzne, znakując nukleotydy pierwiastkami
promieniotwórczymi.

1.

Morfologia chromosomów metafazowych

Chromosom metafazowy jest najbardziej skondensowaną formą chromatyny

jądrowej. Heterochromatyna i euchromatyna, wchodzące w skład chromosomu
różnią się między sobą rodzajem DNA (w heterochromatynie występują krótkie
sekwencje tandemowe). Euchromatyna jest replikowana we wczesnej i średniej S.
Dekondensacja heterochromatyny zachodzi wyłącznie w późnej fazie S. w wyniku
kondensacji długość chromosomu wynosi zaledwie 10

-4

części długości

rozwiniętego DNA. Chromosom składa się z dwóch chromatyd połączonych w
miejscu przewężenia pierwotnego, zwanego centromerem, który jest także
miejscem przyczepu włókien wrzeciona podziałowego. W centromerze występują
różne sekwencje powtarzalne, w większości satelitarny DNA, ale także sekwencje
SINES i LINES. W chromosomach człowieka wyróżnia się 4 główne rodziny takich
sekwencji (p. nowy Drewa str. 433). Wymienione sekwencje łączą się ze
swoistymi białkami, tworząc wielowarstwową strukturę zwaną kinetochorem.
Współdziała on z mikrotubulami wrzeciona podziałowego, ułatwiając podział
chromatyd siostrzanych lub chromosomów w anafazie mitozy czy też mejozy. W
większości komórek kinetochor ma postać trójblaszkowej płytki złożonej z:

•

Zewnętrznej (gęstej)

•

Środkowej (mało wyraźnej)

•

Wewnętrznej

Centromer dzieli chromosom na ramiona długie (q) i krótkie (p). na podstawie

położenia centromeru chromosomy dzielimy na trzy grupy:

•

Chromosomy metacentryczne; centromer w środku chromosomu (p=q)

•

Chromosomy submetacentrzyczne; (p<q)

•

Chromosomy akrocentryczne; (p<<q)

•

Chromosomy telocentryczne; centromer na samym końcu chromosomu,
brak ramion długich (u człowieka takich nie ma)

Na końcach chromosomów znajdują się sekwencje telomerowe. Telomerowy
DNA nie jest upakowany w postaci nukleosomów; zamiast histonów występują
białka telomerowe. Połączenie DNA telomerowego z tymi białkami nazywamy
telosomem. telomery mają zwykle strukturę typu „spinka do włosów” o dużej
zawartości guaniny. Każdy chromosom ma 2 telomery, tak więc w komórce jest ich
92. telomer chroni koniec chromosomu przed uszkodzeniem, umożliwia replikację
całego chromosomu, nadzoruje ekspresję genów oraz wspomaga organizację
chromosomów podczas podziału. Ponadto jest swego rodzaju zegarem
biologicznym, skracając się z każdym podziałem nieuchronnie prowadzi do
zaprzestania w pewnym momencie podziałów komórki, co ma ogromny wpływ na
procesy starzenia. Ma to oczywiście pozytywne strony, w pewnym stopniu
chroniąc komórki przed transformacją nowotworową. W pewnych rodzajach
komórek występuje enzym telomeraza, zapobiegający temu skracaniu, co czyni je
niemal nieśmiertelnymi (np. komórki szpikowe). Enzym telomeraza posiada krótki
odcinek RNA, służący do odtwarzania brakującego kawałka telomeru.

Na końcach ramion p chromosomów akrocentrycznych mogą występować

satelity, które są fragmentami chromatyny oddzielonymi od ramion krótkich
chromosomu przez tzw. przewężenie wtórne (nitka satelitonośna). U człowieka
przewężęnie wtórne jest odcinkiem jąderkotwórczym chromosomów 13, 14, 15, 21,
22 (akrocentrycznych), zwany jest on inaczej organizatorem jąderkowym.
Jest to odcinek zawierający tandemowo ułożone geny rDNA dla kodowania rRNA.
W telofazie odcinki te biorą udział w formowaniu się jąderka. U człowieka
występuje 10 organizatorów.

2.

Kryteria klasyfikacji chromosomów

Chromosomy człowieka sklasyfikowano zgodnie z zasadami opracowanymi

na konferencjach w Denver, Londynie, Paryżu, Sztokholmie i Zabrzu (20??, ale
kiedyś na pewno do tego dojdzie). Celem tych konferencji było ujednolicenie
zasady klasyfikacji chromosomów. Dziś podstawą jest system nazewnictwa ISCN z
2005 i 2009r. za kryteria przyjęto:

•

Wielkość chromosomów

•

Położenie centromeru

•

Rozmieszczenie prążków w chromosomach

Na podstawie tych kryteriów wyodrębniono poszczególne pary chromosomów

somatycznych; oznaczone numerami 1 do 22 oraz chromosomów płci
wydzielonych jako odrębną parę. Autosomy podzielono na 7 grup- od A do G.

chromosom X zalicza się do grupy C, a chromosom Y do grupy G. Oceny kariotypu
dokonuje się pod mikroskopem świetlnym. Dla dokładniejszej analizy materiału
wykonuje się tzw. kariogram. Jest to zestaw chromosomów przedstawionych
graficznie według ścisłych zasad, który sporządza się, wykonując mikrofotografię
płytek metafazowych wybarwionych prążkowo. Z odbitek wycina się chromosomy i
układa w poszczególne pary homologiczne według wielkości, położenia
centromeru i wzorów prążkowych. Kariogram człowieka przedstawia się w
następujący sposób:

•

Do grupy A zaliczono pary 1-3; 1 i 3 to duże chromosomy
metacentryczne; 2 jest submetacentryczny.

•

Do grupy B parę 4 i 5; duże chromosomy submetacentryczne.

•

Do grupy C pary 6-12 oraz X; wszystkie submetacentryczne średniej
wielkości

•

Do grupy D pary 13-15; mogą zawierać nitki satelitonośne i satelity

•

Do grupy E pary 16-18 16 to małe i prawie metacentryczne, natomiast 17
i 18 to małe submetacentryki.

•

Grupa F obejmuje pary 19 i 20; najmniejsze chromosomy
metacentryczne.

•

Grupa G obejmuje pary 21 i 22 oraz zbliżony do nich rozmiarami
chromosom Y. pary 21 i 22 to małe chromosomy, mogące zawierać nitki
satelitonośne i satelity. Chromosom Y satelit nie posiada nigdy.

Zestaw

chromosomów

występujących

w

komórce

somatycznej,

o

charakterystycznej liczbie i morfologii zwiemy kariotypem.

3.

Wskazania do analizy kariotypu

Badanie cytogenetyczne przeprowadza się tylko wtedy, gdy istnieje podejrzenie,

że obraz kliniczny choroby może być spowodowany obecnością aberracji
chromosomowej.

Wskazania do postnatalnego oznaczania kariotypu

1.

występowanie cech genotypowych charakterystycznych dla określonego
zespołu chromosomowego

2.

występowanie wad rozwojowych i/lub cech dysmorfii z wystąpieniem
opóźnienia psychoruchowego

3.

niepowodzenie rozrodu0 2 lub więcej poronienia samoistne w I trymestrze
lub urodzenie dzieci z wadami o nieznanej etiologii

4.

brak cech dojrzewania płciowego

5.

pierwotny lub wtórny brak miesiączki

6.

znaczny niedobór wzrostu o nieznanej etiologii u kobiet

7.

nieprawidłowa budowa zewn. Narządów płciowych, obojnactwo

8.

występowanie aberracji strukturalnych w rodzinie

Metody badania chromosomów

Najczęstszą metodą uzyskiwania chromosomów do badań cytogenetycznych jest

hodowla limfocytów krwi obwodowej zgodnie z metodą podaną we wstępie.
Obecnie w badaniach cytogenetycznych stosuje się metody wybarwiania
pozwalające stwierdzić na chromosomach prążki G, Q, R oraz C. praktyce
najczęściej bada się chromosomy metafazowe wybarwione na prążki G, których
liczba związana jest ze stopniem kondensacji chromatyny. W haploidalnej liczbie
chromosomów o średnim stopniu kondensacji wyróżnić można 300-400 prążków,
w chromosomach prometafazowych 550-580, a w profazowych nawet do 850.
metoda uzyskiwania chromosomów o zwiększonej rozdzielczości obrazu
prążkowego (prometafazowe i profazowe) nazywana jest HRT. Zmniejszenie
stopnia kondensacji osiąga się przy pomocy odpowiednich środkó9., jak na
przykład BrdU. W badaniach rutynowych stosowany poziom rozdzielczości nie
przekracza 550-580 prążków. Wartości liczbowe prążków przyporządkowane
ramionom krótkim i długim maleją w kierunku od cz. dystalnych do centromerów.
Odcinek najbliższy centromeru określa się cyfrą 1, następnie 2,3…

Prążki G; wybarwia się je najczęściej traktując preparaty enzymami

proteolitycznymi takimi jak trypsyna, czy pronaza, a następnie barwi metodoą
Giemsy. W wyniku otrzymuje się chromosomy barwione na prążki ciemne,
poprzedzielane jasnymi. Ciemne prążki G odpowiadają obszarom bogatym w pary
AT z późno replikującym DNA. Regiony te zawierają skondensowaną
heterochromatynę z nielicznymi aktywnymi genami. Od prążków jasnych różnią
się składem białek. Badania wykazały że ta chromatyna jest bogata w białka
zawierające mostki siarkowe, co cechuje występujące w chromosomach białka
niehistonowe. Prążki jasne to obszary bogate w GC, wcześnie replikujące,
zawierające euchromatynę. Wzór prążków G jest unikatowy dla każdej pary
chromosomów; odzwierciedlają one odmienną kondensację chromatyny.

Prążki Q; do ich wybarwienia używa się dwóch rodzajów fluorochromów:

•

zdolnych do jonowego wiązania się z DNA oraz interkalacji między
płaszczyzny zasad (e.g. oranż akrydynowy)

•

fluorochromy interkalujące do podwójnego łańcucha DNA, wykazujące
powinowactwo do pewnych zasad azotowych (e.g. atebryna [Q])

badania wykazują, że silnie fluoryzujące odcinki DNA są bogate w pary AT,
natomiast pary GC wygaszają fluorescencję. Niektóre odcinki chromosomów
człowieka wykazują bardzo silną fluorescencję. , np. okolice centromeru 3.
chromosomu (gr. A), satelity akrocentryków i dystalne odcinki ramion q
chromosomu Y.

Prążki C; wykrywa się dzięki nim regiony chromosomów zawierające

chromatynę konstytutywną. Barwią się barwnikiem Giemsy w obszarze
chromatyny centromerowej i przycentromerowej po uprzedniej inkubacji w r-rze
wodorotlenku Baru. Wybarwiają się rejony zbudowane z powtarzalnych sekwencji
satelitarnego DNA; silnie związane ze swoistymi białkami niehistonowymi, które
chronią DNA. Barwienie tą metodą u człowieka ukazuje na ciemno rejony

centromerów oraz okolice przycentromerowe. U człowieka wielkość chromatyny
przycentromerowej chromosomów pary 1, 9, 16 jest cechą polimorficzną.

Prążki R; są odwrotnością prążków G. ciemne prążki G reprezentują obszary

bogate w GC, natomiast jasne w AT. Barwienie to uzupełnia analizę kariotypu,
ukazują aberracje niedostrzegalne w wybarwieniu prążków G i Q.

Hybrydyzacja fluorescencyjna In situ (FISH); jest to metoda, pozwalająca

na lokalizowanie swoistych sekwencji DNA bezpośrednio w materiale
biologicznym. Stosuje się w niej sondy molekularne znakowane radioaktywnie
(metoda ISH), które obecnie są wypierane przez sondy fluorescencyjne (FISH).
Stosuje się sondy sprzężone z innymi cząsteczkami, wykazującymi powinowactwo
do DNA (np. biotyna). Metoda ta pozwala wykryć amplifikacje, Delecje lub
duplikacje oraz zmiany w liczbie i strukturze chromosomów, wykrywalne zarówno
w metafazie, jak i interfazie(!). do badań cytogenetycznych wykorzystuje się sondy
wiążące regiony centromerowi (sondy centromerowi) poszczególnych par
chromosomów w płytkach metafazowych, ale także w interfazowych jądrach
komórek.

Zastosowanie kliniczne FISH

•

diagnostyka zespołów mikrodelecyjnych

•

diagnostyka przyczyn niepełnosprawności intelektualnej

•

szybkie wykrywanie aneuploidii

•

diagnostyka nowotworów

podobna do FISH jest metoda hybrydyzacji porównawczej CGH. Specyficzną cechą
techniki jest to, że materiał pobrany od pacjenta jest hybrydyzowany do
prawidłowych chromosomów metafazowych w preparacie cytogenetycznym. Do
mieszaniny hybrydyzacyjnej dodaje się referencyjny DNA komórki prawidłowej
oraz DNA badany w równych ilościach. Wyznakowuje się je odpowiednimi
fluorochromami (czerwonymi i zielonymi). Następnie wyznakowane DNA
przyłącza się w procesie hybrydyzacji do chromosomów na preparacie kontrolnym.
Analiza wyników polega na pomiarze i porównaniu natężeń obydwu fluorescencji
(zieleń:czerwień) wzdłuż wszystkich chromosomów i odniesienia uzyskanych
profili do wzorców (ideogramów chromosomów). Profil fluorescencyjny w
przedziale 0.75-1.25 uznaje się za prawidłowy. Wartości poniżej lub powyżej tego
zakresu w określonym rejonie chromosomu wskazują na nieprawidłowe liczby
kopii sekwencji DNA. Wadą metody jest stosunkowo mała rozdzielczość oraz brak
możliwości wykrywania mozaikowatości chromosomowej. Metodę tą stosuje się do
diagnostyki aberracji niezrównoważonych w komórkach nowotworowych oraz jako
uzupełnienie cytogenetyki klasycznej.

Zapisywanie wyników badań cytogenetycznych

do doczytania w podręczniku.