Ćwiczenie 5. Spektroskopia w podczerwieni w badaniu struktury   

biomakromolekuł 

Metody spektroskopowe polegają na obserwacji oddziaływania promieniowania 

elektromagnetycznego z materią. Można je podzielić na metody: emisyjne, w których 
uzyskujemy informacje na temat promieniowania emitowanego przez próbkę; absorpcyjne, 
gdzie informacje uzyskiwane są na podstawie tej części promieniowania, która została 
zaabsorbowana oraz metody polegające na analizie promieniowania rozproszonego przez 
próbkę (spektroskopia Ramana). Spektroskopia w podczerwieni bada absorpcję 
promieniowania związaną ze wzbudzeniem poziomów oscylacyjnych cząsteczek. 

5.1. Spektroskopia w podczerwieni – podstawy teoretyczne 

W widmie promieniowania elektromagnetycznego zakres podczerwieni znajduje się 

pomiędzy promieniowaniem widzialnym i mikrofalowym. Najbardziej istotny z punktu 
widzenia spektroskopii biocząsteczek jest zakres podstawowy podczerwieni 4000 – 400 cm

-1

, 

otoczony przez bliską (powyżej 4000 cm

-1

) i daleką podczerwień (poniżej 400 cm

-1

).  

Energia wewnętrzna cząsteczek występuje w różnych formach, m. in.: (a) energii 

translacji, związanej z nieuporządkowanym ruchem molekuł; (b) energii rotacyjnej, 
wynikającej z wirowania cząsteczek wokół własnych osi; (c) energii oscylacyjnej, związanej 
z oscylacjami wokół położeń równowagi atomów cząsteczek oraz (d) energii elektronowej, w 
której skład wchodzi energia kinetyczna ruchu elektronów w cząsteczce oraz energia 
potencjalna oddziaływania elektronów z jądrami oraz sąsiednimi elektronami. Absorpcja 
promieniowania podczerwonego powoduje zmiany energii oscylacyjnej i rotacyjnej 
cząsteczki. Kształt widm w tym zakresie promieniowania w przypadku ciał stałych i cieczy 
zależy głównie od wzbudzeń oscylacyjnych, ponieważ rotacje cząsteczek są w tym przypadku 
częściowo lub całkowicie hamowane przez oddziaływania międzycząsteczkowe. Widma ciał 
stałych i cieczy są w związku z tym nazywane widmami oscylacyjnymi, natomiast widma 
cząsteczek w fazie gazowej noszą nazwę widm oscylacyjno-rotacyjnych ze względu na dużą 
swobodę zarówno rotacji jak i oscylacji cząsteczek. Drgania molekuł wieloatomowych mają 
złożony charakter, można je jednakże przedstawić jako superpozycję pewnej liczby drgań 
prostych, zgodnych w fazie i o jednakowej częstości. Drgania te nazywane są  drganiami 
normalnymi. Wyróżniamy wśród nich drgania rozciągające związane ze zmianą  długości 
wiązań i drgania deformacyjne wynikające ze zmiany kątów płaskich pomiędzy wiązaniami 
podczas ruchu w płaszczyźnie lub poza płaszczyznę wiązań. Każdy z rodzajów drgań może 
być dodatkowo symetryczny lub niesymetryczny.  

 
 

 

H

2

O 

symetryczne 

rozciągające (ν

s

 OH) 

3652 cm

-1 

asymetryczne 

rozciągające (ν

as

 OH) 

3756 cm

-1

 

deformacyjne  

nożycowe (δ

s

 OH) 

1596 cm

-1

 

 

Rys. 1. Drgania normalne izolowanej cząsteczki H

2

O. 

Liczba stopni swobody cząsteczki jest równa sumie stopni swobody tworzących ją 

atomów. Każdy atom ma trzy stopnie swobody ruchu, odpowiadające współrzędnym 
kartezjańskim. Zatem cząsteczka składająca się z n atomów ma 3n stopni swobody. W 
przypadku cząsteczek nieliniowych trzy stopnie swobody dotyczą translacji, a trzy kolejne 
ruchu obrotowego. Pozostałe 3n-6 stopnie swobody opisują ruchy oscylacyjne i 
odpowiadające im drgania normalne. Cząsteczki liniowe mają tylko dwa rotacyjne stopnie 
swobody, więc ich drganiom odpowiada 3n-5 drgań normalnych. Przykładem nieliniowej 
drobiny jest cząsteczka wody, która składa się z trzech atomów, ma zatem 3·3 – 6 = 3 stopnie 
swobody oscylacyjnej. Odpowiadające im trzy drgania normalne przedstawiono na Rys. 1. 

Do przybliżonego opisu oddziaływania cząsteczki dwuatomowej z promieniowaniem 

elektromagnetycznych wykorzystuje się model oscylatora harmonicznego. Oscylatorem 
harmonicznym jest w tym przypadku układ dwóch mas (atomów lub rdzeni atomowych), 
drgających doskonale sprężyście wokół  środka masy układu. Częstość drgań  własnych 
takiego oscylatora (ν

osc

) wyraża się wzorem: 

r

osc

m

f

π

ν

2

1

=

, (1) 

gdzie f to stała siłowa, będąca miarą siły wiązania, natomiast m

r

 oznacza masę zredukowaną, 

równą iloczynowi mas obu atomów podzielonemu przez ich sumę.  

Energia mikrooscylatora jest kwantowana i dla poszczególnych poziomów 

energetycznych oscylacji wyraża się wzorem: 











 +

=

2

1

υ

ν

osc

osc

h

E

, (2) 

gdzie υ – oscylacyjna liczba kwantowa, która może przyjąć wartości υ = 0, 1, 2, 3, …   

Oddziaływanie promieniowania podczerwonego z oscylującymi cząsteczkami jest 

możliwe tylko wtedy, gdy spełnione są pewne warunki nazywane regułami wyboru. Zgodnie 
z pierwszą regułą, energia fotonu promieniowania elektromagnetycznego, która może zostać 
pochłonięta przez cząsteczkę musi odpowiadać różnicy energii poziomów energetycznych 
cząsteczki (dla spektroskopii oscylacyjnej ∆E

osc

 = hν). W przypadku oscylatora 

harmonicznego dozwolone są tylko przejścia absorpcyjne lub emisyjne, dla których 
oscylacyjna liczba kwantowa zmienia się o ∆υ = ±1.  

Przedstawiony model oscylatora harmonicznego wyjaśnia występowanie tak zwanych 

pasm podstawowych, czyli intensywnych pasm absorpcyjnych w widmach cząsteczek 
heteroatomowych, którym towarzyszy zmiana oscylacyjnej liczby kwantowej ∆υ = 1. W 
widmach obserwowane są również pasma o niskiej intensywności i o częstościach zbliżonych 
do wielokrotności częstości pasma podstawowego, są to tzw. nadtony. Ich występowanie 
wyjaśnia model oscylatora anharmonicznego. Najważniejszą konsekwencją zastosowania 
tego modelu jest rozszerzenie reguły wyboru dotyczącej zmiany liczby kwantowej oscylacji – 
dozwolone stają się przejścia, dla których oscylacyjna liczba kwantowa zmienia się o kilka 
jednostek (∆υ = ±1, ±2, ±3, …). Warunek ten stanowi drugą regułę wyboru obowiązującą w 
spektroskopii w podczerwieni. Z trzeciej reguły wyboru wynika natomiast, że w podczerwieni 
można obserwować tylko te przejścia oscylacyjne, którym towarzyszy zmiana momentu 
dipolowego cząsteczki. Drgania te nazywa się drganiami aktywnymi w podczerwieni.  

Rzadko obserwuje się teoretyczną liczbę drgań normalnych tonów podstawowych, 

ponieważ nadtony i drgania złożone, czyli suma lub różnica kilku drgań, zwiększają liczbę 
pasm, natomiast inne zjawiska zmniejszają ich liczbę. Gdy dwa oscylujące wiązania mają 
wspólny atom, pomiędzy utworzonymi oscylatorami istnieje oddziaływanie mechaniczne i z 
tego względu rzadko zachowują się jak odrębne oscylatory, chyba że częstości ich drgań są 

bardzo różne. Sprzężenie dwóch drgań normalnych powoduje powstanie dwóch nowych 
drgań o częstościach wyższej i niższej niż ta, gdy oddziaływania nie zachodzą (rezonans 
Fermiego). Oddziaływania mogą pojawiać się również pomiędzy drganiami podstawowymi, 
nadtonami i drganiami złożonymi.  

W każdym drganiu normalnym biorą udział wszystkie atomy cząsteczek, ale amplitudy 

ich wychyleń mogą być różne. W wielu drganiach biorą udział przede wszystkim najbliższe 
atomy tworzące charakterystyczną grupę funkcyjną w cząsteczce, a pozostałe atomy mają tak 
małą amplitudę wychyleń, że praktycznie nie wpływają na drgania. Z wymienionych powyżej 
powodów wiele grup funkcyjnych wykonuje drgania o charakterystycznej częstości, 
zmieniającej się niewiele w różnych cząsteczkach.  

Kształt krzywej dzwonowej pasm absorpcyjnych jest charakterystyczną cechą 

oddziaływania substancji z promieniowaniem. Poszerzenie pasma wynika z kilku przyczyn 
naturalnych, takich jak zasada nieoznaczoności Heisenberga, efekt Dopplera. Pasma w 
podczerwieni faz skondensowanych są poszerzone ze względu na zatartą strukturę rotacyjną 
widma oscylacyjnego. Zdarza się również, że sąsiadujące ze sobą pasma w widmie nakrywają 
się tworząc wspólny kontur. 

Położenie maksimum pasm w widmie w podczerwieni jest najczęściej określane w skali 

liczb falowych, czyli liczby drgań przypadających na 1 cm drogi promieniowania (

ν

= 

1/λ, 

cm

-1

), rzadziej przy pomocy długości fali (λ, nm) lub częstości promieniowania (ν, Hz). 

Intensywność pasm jest natomiast wyrażona w skali transmitancji (T) lub absorbancji (A). 
Transmitancja jest to stosunek natężenia światła przepuszczonego przez próbkę do natężenia 
światła padającego na próbkę.  Absorbancja jest logarytmem dziesiętnym odwrotności 
transmitancji  A = log

10

(1/T). Pod pojęciem natężenia pasm rozumiemy pole powierzchni 

pomiędzy linią określającą kontur pasma a jego linią bazową. W niektórych przypadkach 
miarą natężenia pasma może być jego wysokość mierzona w maksimum. 

5.2. Aparatura pomiarowa 

Współczesne spektrometry zamiast widm rejestrują bezpośrednio tzw. interferogramy. 

Promieniowanie obejmujące określony zakres podczerwieni (np. 4000 – 400 cm

-1

) 

rozdzielane jest na dwie wiązki (Rys. 2). Jedna z nich przebiega drogę o stałej długości, a 
druga generowana jest przez interferometr z ruchomym zwierciadłem poruszającym się ze 
stałą prędkością. Zmieniająca się różnica długości dróg obu wiązek powoduje wzajemne 
interferencje i w wyniku tego powstaje interferogram. Zastosowanie transformacji Fouriera 
pozwala na przekształcenie takiego interferogramu z domeny czasowej na bardziej użyteczną 
domenę częstości, czyli widmo. Jedno przejście szerokopasmowego promieniowania przez 
próbkę pozwala na rejestrację całkowitego widma w podczerwieni, co znacznie skraca czas 
analizy. Zastąpienie tradycyjnych monochromatorów interferometrami znacznie polepszyło 
także czułość i rozdzielczość przyrządów. 

 
 

Przetwornik 

Komputer 

Detektor

Próbka

Dzielnik 
wiązki 

Zwierciadło

stałe 

Zwierciadło 

ruchome 

Źródło

 

 

 

 

 

Rys. 2. Schemat spektrometru podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR). 

5.3. Spektroskopia w podczerwieni w badaniach struktury i stabilności białek 

Spektroskopia w podczerwieni jest jedną z najbardziej wszechstronnych technik 

badawczych, pozwalających na obserwowanie struktury drugorzędowej białek oraz jej zmian 
wywołanych różnymi czynnikami zewnętrznymi. Jej niewątpliwą zaletą jest możliwość 
dostosowania warunków pomiarowych do konkretnego problemu. Dostępnych jest wiele 
odmian tej techniki (np. tradycyjna spektroskopia transmisyjna, spektroskopia ATR lub 
spektroskopia odbiciowa), umożliwiających pomiary roztworów białek o różnym stężeniu, 
żeli, cienkich filmów lub stałych preparatów.  

Popularnym problemem biochemicznym do którego wykorzystuje się spektroskopię 

FTIR jest analiza struktury drugorzędowej białek. Rozwój tej techniki eksperymentalnej w 
badaniach biochemicznych spowodowany jest wzrostem zainteresowania strukturą białek 
oraz ograniczeniami bardziej bezpośrednich technik, takich jak NMR i krystalografia 
rentgenowska. Wprawdzie za pomocą spektroskopii w podczerwieni nie można uzyskać 
informacji o absolutnej strukturze białka, to jednak, w przeciwieństwie do wymienionych 
wyżej technik, pozwala ona na analizę struktury białek trudno rozpuszczalnych, nie 
tworzących kryształu lub białek o masach cząsteczkowych powyżej kilkudziesięciu kDa.  

Spektroskopia w podczerwieni jest także wykorzystywana w badaniach nad stabilnością 

białek, nad mechanizmem ich denaturacji oraz do badania molekularnych podstaw ich 
funkcjonowania. Na Rys. 3 przedstawiono przykładową serię widm FTIR lizozymu z białka 
jaja kurzego zmierzonych w różnych temperaturach (rozpuszczalnikiem była woda ciężka). 
Zmiany w kształcie pasm można powiązać ze zmianami w strukturze drugorzędowej białka, 
pojawiającymi się wraz ze wzrostem temperatury. Na podstawie zależności wartości 
absorbancji przy liczbie falowej 1640 cm

-1

 od temperatury możliwe jest wykreślenie krzywej 

denaturacji (we wstawce), która może posłużyć do określenie temperatury denaturacji lub 
pomóc w określeniu mechanizmu denaturacji białka. 

1700

1650

1600

1550

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

30 40 50 60 70 80 90

1.4

1.5

1.6

1.7

pasmo amidowe II

 

Ab

sor

bancj

a

Liczba falowa (cm

-1

)

1.

2.

pasmo amidowe I'

A

bs

. @

 1640 c

m

-1

Temperatura (

o

C)

 

Rys. 3. Seria widm lizozymu z białka jaja kurzego zmierzonych w zakresie 
temperatur 30,4

o

C – 83,5

o

C. Strzałkami oznaczono kierunek najważniejszych 

zmian w natężeniu i położeniu pasm amidowych I’ oraz II, towarzyszących 
wzrostowi temperatury. Widma zmierzono w kuwecie transmisyjnej wyposażonej 
w okienka z CaF

2

 rozdzielone przekładkami teflonowymi o grubości 56 µm. 

Temperatura była regulowana za pomocą zewnętrznego kontrolera. We wstawce 
przedstawiono krzywą denaturacji, wyznaczoną dla liczby falowej 1640 cm

-1

. 

Wykorzystanie spektroskopii różnicowej lub czasowo rozdzielczej spektrofotometrii 

(ang.  time-resolved) z wykorzystaniem techniki zatrzymanego przepływu pozwala 

przykładowo na obserwowanie zmian w centrum katalitycznym enzymu. Często 
wykorzystuje się w tym zakresie technikę znakowania białek ciężkimi izotopami (

15

N) lub 

mutagenezę ukierunkowaną. Pozwala to na precyzyjne przypisanie określonych pasm 
widocznych w widmie białka konkretnym resztom aminokwasowym.  

5.3.1. Określanie struktury drugorzędowej białek 

Białka posiadają dziewięć charakterystycznych pasm, z których największe znaczenie w 

analizie struktury drugorzędowej mają przedstawione na Rys.4: pasmo amidowe I 
(odpowiadające głównie drganiom rozciągającym wiązania C=O, ok. 1700-1600 cm

-1

), pasmo 

amidowe II (odpowiadające sprzężonym drganiom zginającym wiązania N-H i rozciągającym 
wiązania C-N, ok. 1600-1500 cm

-1

) oraz w mniejszym stopniu pasmo amidowe III 

(odpowiadające głównie drganiom rozciągającym wiązania C-N i drganiom zginającym 
wiązania N-H, ok. 1340 - 1200 cm

-1

).  

2000

1750

1500

1250

0.00

0.03

0.06

0.09

0.12

0.15

Ab

so

rb

an

cj

a

Liczba falowa (cm

-1

)

pasmo amidowe III

pasmo amidowe II

pasmo amidowe I

 

Rys. 4. Charakterystyczne widmo czystego białka (lizozym z białka jaja kurzego) 
rozpuszczonego w wodzie wraz z zaznaczonymi najważniejszymi pasmami 
amidowymi, służącymi do analizy zmian w jego strukturze. Widmo jest wynikiem 
odjęcia zmierzonego widma ATR czystej wody od widma ATR roztworu białka. 
Wskaźnikiem prawidłowego odjęcia widm było uzyskanie płaskiego przebiegu 
linii bazowej widma wynikowego powyżej 1800 cm

-1

. 

 

Ograniczenia steryczne, hydrofobowy/hydrofilowy charakter reszt bocznych 

aminokwasów jak i samego szkieletu polipeptydowego, a także otaczający białko 
rozpuszczalnik powodują,  że białka przyjmują w roztworach wodnych ściśle określone 
konformacje geometryczne, zwane strukturami drugorzędowymi. Istotnym elementem każdej 
z nich jest charakterystyczna sieć wiązań wodorowych między atomami tlenu karbonylowego 
łańcucha polipeptydowego a atomem wodoru grupy aminowej, które spinają fragmenty 
łańcucha polipeptydowego, często znacznie oddalone od siebie. Każda ze struktur 
drugorzędowych białek posiada charakterystyczną geometrię sieci wiązań wodorowych, a co 
za tym idzie, także charakterystyczne zakresy częstości drgań wiązań zaangażowanych w ich 
tworzenie. Na Rys. 5 przedstawiono zakresy częstości drgań wiązań w zakresie pasma 
amidowego I, najczęściej wykorzystywanego do określania zawartości poszczególnych 
struktur drugorzędowych, przypisane poszczególnym strukturom drugorzędowym. Wartości 
te opierają się  głównie na danych eksperymentalnych oraz obliczeniach teoretycznych. 

Granice różnych zakresów są często dosyć szerokie, dlatego należy ostrożnie analizować 
uzyskane wyniki.  

W strukturze przestrzennej białek można najczęściej wyróżnić wiele różnych struktur 

drugorzędowych, dlatego też ich widma w podczerwieni mają  złożony charakter. Pasma 
amidowe składają się w wielu różnych, zachodzących na siebie pasm składowych, 
charakterystycznych dla poszczególnych struktur. Znacząco komplikuje to analizę widm. 
Jednak stosując techniki zwiększania rozdzielczości widm można jednak uzyskać informacje 
o ich położeniu i natężeniu, a czasem także o ich procentowym udziale w stosunku do 
wszystkich struktur drugorzędowych danego białka.  
 
 

1600

1610

1620

1630

1640

1650

1660

1670

1680

1690

1700

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

10

α-helisa

Pętle 

Agr

Agregat

βs

βs

β-kartki 

β 

Zakręty i pętle

Reszty AA 

Reszty AA 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Liczba falowa / cm

-1

 

Rys. 5. Zakresy absorpcji poszczególnych struktur drugorzędowych 
występujących powszechnie w białkach. Skróty i objaśnienia: β – β-kartki, βs – β-
spinki (β-kartki zbudowane tylko z dwóch łańcuchów), reszty AA – grupy boczne 
reszt aminokwasowych, Agr. – agregaty, 3

10

 – helisa 3

10

, Pętle – rozumiane jako 

długie pętle, lub struktura nieuporządkowanego polipeptydu (charakterystyczna 
dla białek zdenaturowanych); struktury, których pasma absorpcji przesuwają się 
pod wpływem wymiany protonowej oznaczone zostały strzałką, prostokątami 
przerywanymi oznaczono zakresy absorpcji tych struktur w wodzie ciężkiej.  

5.3.2. Izolacja i analiza widm biocząseczek w roztworach wodnych 

Widma biocząsteczek najczęściej mierzone są w roztworach wodnych i rzadko możliwa 

jest bezpośrednia analiza charakterystycznych pasm absorpcji. Ogólny schemat postępowania 
w takich sytuacjach przedstawia się następująco: 

a. Usunięcie udziału widmowego pary wodnej 

Pierwszym problemem we wstępnej obróbce danych widmowych jest usunięcie pasm 

absorpcji pary wodnej w zakresie pasma amidowego I i II. W dużym stopniu problem ten jest 
zmniejszany przez intensywne płukanie aparatu suchym azotem lub osuszonym powietrzem. 
Jednak nie zawsze jest to wystarczające rozwiązanie. Korekcja atmosfery opiera się 
najczęściej na takim dobraniu współczynnika odejmowania zmierzonego widma pary wodnej, 
aby uzyskać widmo w najwyższym stopniu pozbawione udziału tej pary. Procedura odbywa 
się metodą "prób i błędów", a kryterium jest ocena wizualna widma. 

b. Odejmowanie udziału widmowego wody  

Największym problemem w przygotowaniu widm do dalszej obróbki jest prawidłowe 

odjęcie widma wody (lub buforu), ponieważ nawet w bardzo stężonych próbkach natężenie 
pasma wody w zakresie amidu I jest od 5 do 10 razy większe, niż samego pasma amidowego 
I. Powszechnie stosowanym sposobem odejmowania widma wody od zmierzonego widma 

roztworu białka (zarówno uzyskanego metodą transmisyjną jak i ATR) jest wizualne odjęcie 
wcześniej zmierzonego widma wody aż do uzyskania na widmie wynikowym płaskiej linii w 
okolicy 2000 – 1800 cm

-1

.  

Alternatywnym rozpuszczalnikiem białek może być woda ciężka, D

2

O. Jej zaletą jest to, 

iż nie posiada silnych pasm absorpcji w zakresie pasma amidowego I. Zastąpienie atomów 
wodoru deuterem nie powoduje drastycznych zmian w kształcie pasma amidowego I’ (znak 
prim oznacza, że widmo zostało zmierzone w wodzie ciężkiej), zmiany te jednak pozwalają 
na rozróżnienie pasm absorpcji struktur α od struktur pętlowych, co w wodzie zwykłej (H

2

O) 

nie byłoby  łatwe. Niewielkiemu przesunięciu w stronę niższych liczb falowych ulegają też 
wartości absorpcji pozostałych struktur drugorzędowych (Rys. 5). Drastycznej zmianie ulega 
natomiast położenie pasma amidowego II. Wymiana protonowa powoduje przesunięcie 
maksimum tego pasma od ok. 1550 cm

-1

 do ok. 1450 cm

-1

 (to nowe pasmo nazywane jest 

pasmem amidowym II’). Tak duża zmiana jest podstawą dla eksperymentów mających na 
celu np. określenie stabilności hydrofobowego rdzenia białek.  

c. Zwiększanie rozdzielczości widm - uzyskiwanie informacji o pasmach składowych 

Stosuje się powszechnie kilka technik pozwalających określić liczbę i położenie pasm 

składowych, które można następnie przypisać konkretnym strukturom drugorzędowym. 
Wszystkie te techniki mają jednak poważną wadę – uzyskane wyniki są w dużym stopniu 
zależne od subiektywnych decyzji dokonywanych na kolejnych etapach obróbki widm i 
powinny być stosowane z ostrożnością. 

i) Druga pochodna widm. Minima na drugiej pochodnej widm biocząsteczek określają 

w przybliżeniu liczbę i położenie pasm składowych. Kształt drugiej pochodnej, w 
szczególności informacja o liczbie pasm składowych, zależy od jakości danych pierwotnych. 
Druga pochodna widm jest bardzo wrażliwa na wszelkie zakłócenia (np. szumy aparaturowe, 
nieskorygowane pasma absorpcji pary wodnej, itp), dlatego należy ostrożnie analizować jej 
kształt.  Na  Rys.  6  przedstawiono serię drugich pochodnych widm lizozymu z białka jaja 
kurzego zmierzonych w zakresie temperatury 35

o

C – 56

o

C. Minima drugich pochodnych 

wskazują prawdopodobne położenie pasm składowych, które można przypisać 
poszczególnym strukturom drugorzędowym. 

1700

1680

1660

1640

1620

1600

-0.006

-0.003

0.000

0.003

 

 D

ru

ga 

pochodna

Liczba falowa (cm

-1

)

β

α

+pętle

zakręty

 

Rys. 6.  Seria drugich pochodnych widm lizozymu z białka jaja kurzego, 
zmierzonych w zakresie temperatury 35

o

C – 56

o

C. Strzałką oznaczono kierunek 

zmian towarzyszących wzrostowi temperatury. Oznaczono także najważniejsze 
struktury drugorzędowe: α – α - helisy, β – β - kartki. 

 

ii) Rozkład pasma na składowe. Kształt złożonego pasma na widmie w podczerwieni 

przybliża się sumą sztucznie wygenerowanych pasm składowych, będących najczęściej 
funkcjami Gaussa i Lorentza, ich sumą lub iloczynem.  

1700

1680

1660

1640

1620

1600

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

 

1686
3%

1657
25%

1673
11%

1644
13%

1633
46%

Ab

so

rb

an

cja

Liczba falowa (cm

-1

)

1612
2%

 

Rys. 7.  Przykład rozkładu pasma amidowego I białka bogatego w β-kartki 
(świadczy o tym silne pasmo przy 1633 cm

-1

). Każdemu pasmu składowemu 

przypisano maksimum oraz procentowy udział zajmowanej powierzchni całego 
pasma. 

 

iii) Dekonwolucja z wykorzystaniem odwrotnej transformacji Fourier’a. Metoda ta 

służy przede wszystkim do zwiększenia rozdzielczości widma, a nie do samego określania 
liczby i położenia składowych, chociaż i w takim celu może być wykorzystana.  

5.3.3. Technika tłumionego całkowitego odbicia 

Technika tłumionego całkowitego odbicia (ang. Attenuated Total Reflectance – ATR) 

jest obecnie coraz szerzej stosowaną odmianą spektroskopii odbiciowej, posiadającą wiele 
wspomnianych wcześniej zalet w stosunku do tradycyjnej techniki transmisyjnej pomiaru 
widm.  

 

fala zanikająca 

 

promień 
odbity 

promień  
padający 

próbka 
kryształ 
ATR 

θ 

 
 
 
 
 
 
 

 
 

Rys. 8. Przebieg promieni w krysztale ATR. 

Promień padający pod kątem  θ, większym od kąta granicznego, na powierzchnię 

kryształu ATR ulega całkowitemu odbiciu (Rys. 8). Materiały z którego wykonane są 
kryształy ATR charakteryzują się wysokim  współczynnikiem załamania  światła i są 
wykonane najczęściej z germanu, selnku cynku lub diamentu. Jeśli do powierzchni kryształu 

zostanie przyłożona próbka materiału absorbującego promieniowanie, to wiązka 
promieniowania wnika w głąb próbki (fala zanikająca) na bardzo małą głębokość, zależną od 
kąta padania wiązki i współczynników załamania  światła kryształu ATR i samej próbki. 
Część promieniowania może zostać zaabsorbowana przez próbkę, a mierząc intensywność 
promieniowania wiązki odbitej od powierzchni kryształu można uzyskać widmo 
charakterystyczne dla materiału próbki, tzw. widmo ATR. 

Widma ATR są  złożeniem widma refleksyjnego (odbiciowego) oraz absorpcyjnego. 

Korekcja ATR umożliwia wyodrębnienie części absorpcyjnej widma ATR. Korygowane są 
także efekty widmowe związane z niektórymi zjawiskami optycznymi, jak normalna lub 
anomalna dyspersja optyczna. W ich wyniku fale o różnych częstotliwościach penetrują 
warstwy próbki o różnej grubości, a co za tym idzie, są różnie przez nią absorbowane. 
Zjawisko to jest silnie zależne od współczynnika załamania  światła próbki, dlatego też nie 
można dokonywać operacji odejmowania lub dodawania widm ATR próbek o różnych 
współczynnikach załamania światła. 

W spektroskopii biocząsteczek najważniejszą zaletą techniki tłumionego wewnętrznego 

odbicia jest możliwość uzyskania widm roztworów, których składniki (przede wszystkim 
woda) posiadają bardzo silne pasma własne, uniemożliwiające uzyskanie widma samego 
białka metodą transmisyjną. Wadą tej techniki jest jednak konieczność stosowania dość 
wysokich stężeń biocząsteczek oraz konieczność korekcji tych widm, jeżeli mają one zostać 
poddane dalszej analizie.  

5.4. Eksperymenty 

Cel ćwiczenia 

Celem  ćwiczenia jest obserwacja zmian zachodzących w strukturze drugorzędowej 

lizozymu z białka jaja kurzego, spowodowanych obecnością w roztworze substancji 
denaturującej: soli metalu ciężkiego lub kwasu nieorganicznego. 

Przebieg ćwiczenia 

Przygotowanie roztworów 

Roztwory substancji denaturującej 

1. Za  pomocą biurety przygotować 12 roztworów substancji denaturującej o 

wzrastającym stężeniu. Rodzaj substancji oraz jej stężenia wskazuje osoba prowadząca 
zajęcia. Wszystkie rzeczywiste objętości roztworów wyjściowych oraz końcowych 
zapisać w tabeli wyników.  

Roztwory lizozymu 

1.  Do ponumerowanych probówek 1,5 ml odważyć na wadze analitycznej po ok. 50 mg 

wcześniej oczyszczonego i liofilizowanego białka. Masę białka w każdej z probówek 
zapisać w tabeli.  

2.  Do kolejnych probówek dodać odpowiedni roztwór denaturanta tak, aby końcowe 

stężenie białka wynosiło 100 – 150 mg/ml roztworu denaturanta (dokładne stężenie 
końcowe białka podaje osoba prowadząca). Wszystkie objętości zapisać w tabeli 
wyników.  

3. Każdą próbkę zworteksować i odwirować przez ok. 30 sekund przy 6 tys. 

obrotów/min.  

4. Próbki pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej. 

5. Po tym czasie rozpocząć pomiary spektroskopowe oraz równolegle zmierzyć 

współczynnik załamania  światła wszystkich próbek i roztworów substancji 
denaturującej,  n

D

25

. Wszelkie zmiany w wyglądzie próbek zanotować w tabeli 

wyników. 

Wykonanie pomiarów 

1. Na godzinę przed planowanym rozpoczęciem pomiarów spektroskopowych rozpocząć 

płukanie aparatu suchym azotem. 

2. Uruchomić program OMNIC i w zakładce „Parametry pomiaru” ustalić następujące 

parametry: liczba skanów – 128, rozdzielczość widm – 4 cm

-1

, zakres liczb falowych – 

4500 – 500 cm

-1

.   

3. Rozpocząć pomiary od pomiaru widma tła klikając przycisk „Pomiar tła”. Widmo tła 

należy mierzyć przed każdą próbką, chyba że prowadzący wskaże inaczej. 

4.  Pomiary próbek rozpocząć od próbki o najniższym stężeniu substancji denaturującej. 

Próbki nanosić na kryształ przystawki ATR i rozpocząć pomiar  poprzez kliknięcie 
przycisku „Pomiar próbki”. Zacząć od serii roztworów substancji denaturującej, a 
następnie zmierzyć serię roztworów lizozymu. 

5. Po każdym pomiarze próbki kryształ przetrzeć 10% roztworem SDS i wodą.  
6. Po zakończeniu wszystkich pomiarów zmierzyć widmo atmosfery i zapisać wszystkie 

widma w formacie *.SPA.  

Opracowanie wyników 

1. Skorygować wszystkie widma próbek ze względu na obecność atmosfery. 
2. Na każdym widmie dokonać korekcji ATR, uwzględniając zmierzony współczynnik 

załamania światła, n

D

25

. 

3. Odjąć od każdego widma widmo czystego rozpuszczalnika. 
4.  Uzyskane wyizolowane widma białka sprowadzić do wspólnej linii bazowej oraz 

wyznaczyć ich drugie pochodne w zakresie pasma amidowego I. Wszystkie widma i 
ich drugie pochodne zapisać w postaci plików *.CSV. 

5. Uzupełnić wszystkie dane w tabeli wyników.  
6.  Wszystkie widma (w zakresie 1800 – 1500 cm

-1

) przedstawić na zbiorczym wykresie 

oraz omówić zmiany w kształcie widm lizozymu, towarzyszące zwiększającemu się 
stężeniu substancji denaturującej. 

7.  Na podstawie drugich pochodnych widm dla roztworów o skrajnych stężeniach 

substancji denaturującej określić precyzyjnie które struktury drugorzędowe są 
najbardziej wrażliwe na obecność substancji denaturującej.   

8.  Dla wskazanej przez osobę prowadzącą liczby falowej wykonać wykres natężenia 

pasma od stężenia substancji denaturującej oraz omówić uzyskaną zależność. 

Wielkości niezbędne do wyznaczenia danych w tabeli wyników

 

 

 

 

Stężenie roztworu wyjściowego denaturanta, C

r.wyj.

 

 

mol·dm

-3

 

Objętość końcowa przygotowywanych roztworów denaturanta, V

k.r.den.

 

 

ml 

Cząstkowa objętość właściwa lizozymu, υ 0,703 

cm

3

·g

-1

 

Masa molowa lizozymu z białka jaja kurzego 

 

g·mol

-1

 

Końcowe stężenie białka w roztworze denaturanta 

 

mg·(ml roztw. denaturanta)

-1

 

Końcowe stężenie białka w roztworze denaturanta 

 

mol·dm

-3

 

 

 

 

Tabela wyników 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Roztwory 

substancji 

denaturującej Roztwory 

lizozymu  

Nr V

r.wyj

 

V

wody

 

C

den.

 

n

D

25

 

r. den.

 

m

białka

 

V

r.den.

 

C

k.den.

 

n

D

25

r. białka

 Uwagi 

 [ml]  [ml] [mol·dm

-3

]  

[mg]  [

µl] 

[mol·dm

-3

]  

 

0 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

… 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

12 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

V

r.wyj

    

– objętość roztworu wyjściowego substancji denaturującej 

V

wody  

 

– objętość wody 

 

C

den.  

– stężenie substancji denaturującej w przygotowanych roztworach 

 

n

D

25

r. den.   

– współczynnik załamania światła roztworów substancji denaturującej

 

m

białka  

 

– masa białka odważona do probówki 1,5 ml

 

V

r.den.  

– objętość roztworu substancji denaturującej konieczna do uzyskania założonego stężenia 
końcowego białka

 

C

k.den.  

 

– stężenie końcowe substancji denaturującej w roztworze białka

 

n

D

25

r. białka  

– współczynnik załamania światła roztworów białka