Oznaczanie ogólnej liczby

drobnoustrojów

1. METODY BEZPOŚREDNIE

(mikroskopowe)

Metody te polegają na liczeniu drobnoustrojów

bezpośrednio pod mikroskopem. W cienkiej warstwie

płynu, w znanej objętości i na znanej powierzchni

szkiełka liczy się komórki żywe, martwe i uszkodzone.

Metody mikroskopowe obejmują liczenie

drobnoustrojów:

►

Za pomocą komór

►

Metodą Breeda

► Za pomocą komór

Komory do bezpośredniego liczenia

drobnoustrojów pod mikroskopem są to

zazwyczaj grubościenne szkiełka

przedmiotowe z wgłębieniem o znanej

głębokości i powierzchni podzielonej na

kwadraty lub prostokąty.

Używa się komór: Thoma, Howarda,

B

ürkera, Fuchsa-Rosenthala. W komorach

możliwe jest liczenie tylko większych

komórek, takich jak drożdże, zarodniki pleśni

i duże komórki bakteryjne.

Powszechnie jest stosowana komora Thoma

zwana też hemocytometrem

Widok z góry

Widok z boku Siatka kwadratów w powiększeniu

Komora Thoma

Komora Thoma

jest to grube szkiełko przedmiotowe z wgłębieniem

o głębokości 0,1 mm, podzielonym na 16 dużych kwadratów, z których
każdy składa się z 16 małych kwadracików o boku 0,05 mm. Na siatkę
komory nanosi się kroplę zawiesiny drobnoustrojów i przykrywa
szkiełkiem nakrywkowym. Pod mikroskopem, stosując obiektyw
powiększający 40x lub 60x, liczy się komórki w 40 lub 80 małych
kwadratach (w każdym kwadracie liczba komórek znajdujących się
wewnątrz pola plus połowa, znajdująca się na liniach) i oblicza się
średnią przypadającą na jeden kwadrat. Liczbę komórek w 1cm

3

badanego płynu oblicza się ze wzoru:

a x b x 4000 x 1000

gdzie:

a

– średnia liczba komórek przypadająca na jeden mały

kwadrat

b

– ewentualnie rozcieńczenie zawiesiny

► metoda Breeda

Na znanej powierzchni szkiełka przedmiotowego, rozprowadza się znana

objętośc zawiesiny. Preparat po utrwaleniu barwi się i liczy drobnoustroje

pod mikroskopem z użyciem obiektywu immersyjnego. Metoda ta

pozwala na oznaczenie liczby bakterii w badanym produkcie. Do

prawidłowego przeprowadzenia badania przygotowuje się trzy preparaty

z tej samej zawiesiny. W każdym preparacie oblicza się średnią z 20 pól

widzenia, a następnie średnią z trzech preparatów.

Liczbę bakterii w 1cm

3

oblicza się ze wzoru:

gdzie:

a

– średnia liczba bakterii w jednym polu widzenia

b

– powierzchnia preparatu

c

– objętość zawiesiny wprowadzonej na szkiełko przedmiotowe

r

2

– powierzchnia pola widzenia

2. METODY POŚREDNIE

Metody pośrednie oznaczania liczby bakterii polegają

głównie na liczeniu kolonii metodą płytkową. Ogólną zasadą

metod płytkowych jest posiew określonej objętości badanej

próbki na podłoże stałe, a po okresie inkubacji – stwierdzenie

liczby wyrosłych kolonii. Metodami tymi można z większym

lub mniejszym prawdopodobieństwie określić rzeczywistą

liczbę drobnoustrojów. Wyniki jednak są zawsze niższe,

ponieważ na płytkach liczy się tylko kolonie drobnoustrojów,

które są zdolne do wzrostu na danym podłożu i w danej

temperaturze. Ponadto niektóre bakterie, występujące

w skupiskach i łańcuszkach złożonych niekiedy

z kilkudziesięciu komórek, dają również jedną kolonię.

Metody pośrednie są oparte na:

• posiewie i liczeniu kolonii metodą

zalewową

• posiewie powierzchniowym
• oznaczeniu najbardziej

prawdopodobnej liczny
drobnoustrojów (NLP)

Posiew ilościowy metodą płytkową

Metoda płytkowa została wprowadzona przez Roberta
Kocha i oprócz liczenia znalazła zastosowanie do
izolowania czystych kultur i obserwacji morfologicznych
kolonii mikroorganizmów.

Posiewu można dokonać w dwojaki sposób:
-

przez wprowadzenie badanej próbki do płytki i zalanie jej

upłynnionym podłożem stałym (metoda zalewowa)

-

przez wprowadzenie próbki na powierzchnię zastygłego

podłoża i rozprowadzenie za pomocą głaszczki (metoda
posiewu powierzchniowego)

Oznaczanie liczby drobnoustrojów metodą

posiewu powierzchniowego

Przy ilościowym oznaczaniu określonych grup

drobnoustrojów na podłożach wybiórczych stosuje się

posiew powierzchniowy na pożywki uprzednio rozlane

i zestalone w płytkach. Najczęściej posiewa się po 0,1 lub

0,5 cm

3

z odpowiednich rozcieńczeń próbki i natychmiast

rozprowadza równomiernie po całej powierzchni za pomocą

specjalnie wygiętej jałowiej bagietki (głaszczki). Metoda

płytkowa Kocha doczekała się licznych udoskonaleń

i modyfikacji oraz automatyzacji.

Określenie najbardziej prawdopodobnej liczby

drobnoustrojów

Metoda ta służy do oznaczania drobnoustrojów występujących w

niewielkiej liczbie w produkcie spożywczym. Polega ona na hodowli

określonych grup bakterii na pożywkach selektywnych (płynnych lub

stałych) . Tego rodzaju podłoża sprzyjają namnożeniu się bakterii

występujących w niewielkiej liczbie. W metodzie używa się trzech lub

pięciu probówek (lub płytek), zawierających odpowiednio po 10cm

3

lub

15cm

3

podłoża, ustawionych w trzech rzędach, zależnie od kierunku

analizy i rodzaju produktu. Do pierwszego rzędu probówek posiewa się po

10cm

3

próbki z rozcieńczenia wyjściowego (1:10) a następnie po 1 cm

3

z dwóch kolejnych rozcieńczeń dziesiętnych. Jeśli posiewamy po 10cm

3

próby, w pierwszym rzędzie pożywka powinna być podwójnie stężona. Po

inkubacji, z odpowiednich tabel opartych na rachunku

prawdopodobieństwa odczytuje się najbardziej prawdopodobną liczbę

bakterii.

 metoda sedymentacyjna

(tzw. metoda płytkowa Kocha) - polegającą na

osiadaniu drobnoustrojów na powierzchni zestalonego podłoża agarowego
pod wpływem naturalnych sił grawitacji. Zakłada się, że podczas 5 minut
ekspozycji, na płytce Petriego o powierzchni 100cm

2

osiada tyle

drobnoustrojów, ile znajduje się w 10 litrach powietrza.
po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie, a liczbę bakterii i grzybów w 10 litrach
powietrza (X) obliczyć ze wzoru:

a -

liczba kolonii wyrosłych na płytce

b -

powierzchnia płytki (dla płytki o średnicy 10 cm pow. wynosi 78,5

cm

2

)

c -

współczynnik czasu ekspozycji wynoszący 1 dla 5 min, 2-10min,

3-15min

 metoda zderzeniowa

– w której stosuje się wymuszone osiadanie

drobnoustrojów na powierzchni podłoża hodowlanego za pomocą aparatu,
który zasysa określoną objętość powietrza. Pozwala to na dokładne
przeliczenie drobnoustrojów przypadających na określoną objętość powietrza.

 metoda filtracyjna

– polegającą na przepuszczeniu określonej objętości

powietrza przez jałowy filtr membranowy lub płyn fizjologiczny. Filtr przenosi
się na zestalone podłoże i inkubuje, z płynu fizjologicznego wykonuje się
posiew powierzchniowy na podłoże agarowe.

METODY WSKAŹNIKOWE

Metody wskaźnikowe pozwalają na stwierdzenie

obecności drobnoustrojów na podstawie ich

aktywności biochemicznej.

Metodami tymi określa się obecności drobnoustrojów

które nawet w niewielkich ilościach wskazują na stan

sanitarny produktu, jednocześnie są trudne do

wykrycia metodami płytkowymi.

Do metod wskaźnikowych

zalicza się

• oznaczanie miana
• próbę reduktazową

Oznaczanie miana

Mianem określa się najmniejszą ilość

produktu, w której stwierdzono obecność

danego drobnoustroju.

W celu oznaczenia miana, do rzędu probówek

z podłożem płynnym posiewa się po 1cm

3

odpowiednich rozcieńczeń badanego produktu.

Ostatnie rozcieńczenie, w którym stwierdzono

jeszcze dodatnią reakcję (wzrost, zmianę

barwy pożywki czy wzrost i obecność gazu),

przyjmuje się jako miano.

Powszechnie stosuje się oznaczanie miana

coli

oraz miana

enterokoków,

a także

bakterii beztlenowych

.

Miano coli

Najczęściej stosowanym oznaczeniem

w ocenie sanitarno-

higienicznej jest określenie

miana coli.

Pałeczki z grupy okrężnicy

występują w przewodzie pokarmowym ludzi

i zwierząt, stanowiąc główny składnik

mikroflory. Obecność bakterii coli w produkcie

wskazuje na możliwość zanieczyszczenia

kałowego, a tym samym na możliwość

zakażenia bakteriami chorobotwórczymi

z grupy drobnoustrojów jelitowych, które należą

do tej samej rodziny, co pałeczka okrężnicy.

Do oznaczania miana coli

stosuje się płynne pożywki

wybiórcze. Dodatek pewnych związków, takich jak

fiolet krystaliczny czy zieleń brylantowa, hamuje

wzrost pozostałych bakterii głównie gram-dodatnich.

Selektywność pożywki zwiększa dodatek kwasów

żółciowych. Obecność pałeczek z grupy coli

stwierdza się na podstawie wytworzonego z laktozy

gazu w trakcie fermentacji. Hodowlę prowadzi się

w temperaturze 37

0

C przez 24-48 godzin.

Oznaczenie miana coli

metodą probówkowo-

fermentacyjną daje wyniki orientacyjne. Dlatego też

w razie wyników dodatnich lub wątpliwych stosuje

się badania potwierdzające. Próby dodatnie

i wątpliwe przesiewa się na podłoża wybiórcze które

umożliwiają dalszą identyfikację pałeczek z grupy

okrężnicy.

Miano enterokoków

Enterokoki, głównie gatunki Enterococcus faecalis

i Enterococcus faecium,

występują podobnie jak

Escherichia coli, w przewodzie pokarmowym ludzi

i zwierząt. Ich obecność w żywności świadczy

o zakażeniu kałowym. W odróżnieniu od pałeczek

z grupy coli

, enterokoki odznaczają się większą

odpornością na działanie czynników środowiskowych

i charakteryzują się znacznie dłuższym okresem

przeżywania. Nadmierna ilość enterokoków

w produktach spożywczych może być przyczyną zatruć

pokarmowych. Większość metod stosowanych do ich

wykrycia wykorzystuje azydek sodowy jako czynnik

selektywny. Posiewu dokonuje się podobnie jak przy

oznaczeniu miana coli.

O wyniku dodatnim świadczy,

oprócz zmętnienia, zmiana barwy podłoża.

Miano beztlenowców

Oznaczenie beztlenowców, szczególnie ich komórek,

jest trudne z uwagi na konieczność przestrzegania

warunków ściśle beztlenowych. Jak dotąd nie ma

uniwersalnej metody ilościowego oznaczania bakterii

beztlenowych. Jako podłoża stosuje się zarówno

pożywki stałe, jak i płynne. Bardzo często jest to

podłoże Wrzoska. Wynik dodatni wymaga

potwierdzenia badaniem mikroskopowym lub

posiewem na podłoże selektywne.

Próba reduktazowa

Próba reduktazowa, stosowana w ocenie mleka

surowego i pasteryzowanego, pozwala na ocenę jego

jakości i ilości zawartych w nim bakterii. Próba

reduktazowa jest oparta na oznaczeniu momentu

wyczerpania tlenu rozpuszczonego w mleku przez

bakterie. Czas, w jakim tlen zostanie zużyty, zależy od

ilości, rodzaju i aktywności rozwijających się

drobnoustrojów. Po zużyciu tlenu funkcję akceptora

wodoru pełni dodany barwnik (błękit metylenowy,

resazuryna). Błękit metylenowy w wyniku zmiany

potencjału oksydoredukcyjnego środowiska

przechodzi z formy barwnej w postać bezbarwną. Do

bakterii zużywających tlen należą przede wszystkim

bakterie mlekowe oraz pałeczki z grupy coli.