12. Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów
1. METODY BEZPOŚREDNIE (mikroskopowe)
Metody te polegają na liczeniu drobnoustrojów bezpośrednio pod mikroskopem. W cienkiej
warstwie płynu, w znanej objętości i na znanej powierzchni szkiełka liczy się komórki żywe,
martwe i uszkodzone.
Metody mikroskopowe obejmują liczenie drobnoustrojów:
•
Za pomocą komór
•
Metodą Breeda
Za pomocą komór
Komory do bezpośredniego liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem są to zazwyczaj
grubościenne szkiełka przedmiotowe z wgłębieniem o znanej głębokości i powierzchni podzielonej
na kwadraty lub prostokąty. Używa się komór: Thoma, Howarda, Burkera, Fuchsa-Rosenthala. W
komorach możliwe jest liczenie tylko większych komórek, takich jak drożdże, zarodniki pleśni i
duże komórki bakteryjne.
Powszechnie stosowana komora Thoma zwana też hemocytometrem.
Komora Thoma jest to grube szkiełko przedmiotowe z wgłębieniem o głębokości 0,1 mm,
podzielonym na 16 dużych kwadratów, z których każdy składa się z 16 małych kwadracików o
boku 0,05 mm. Na siatkę komory nanosi się kroplę zawiesiny drobnoustrojów i przykrywa
szkiełkiem nakrywkowym. Pod mikroskopem, stosując obiektyw powiększający 40x lub 60x, liczy
się komórki w 40 lub 80 małych kwadratach (w każdym kwadracie liczba komórek znajdujących
się wewnątrz pola plus połowa, znajdująca się na liniach) i oblicza się średnią przypadającą na
jeden kwadrat. Liczbę komórek w 1cm
3
badanego płynu oblicza się ze wzoru:
a x b x 4000 x 1000
gdzie:
a - średnia liczba komórek przypadająca na jeden mały kwadrat
b - ewentualnie rozcieńczenie zawiesiny
Metoda Breeda
Na znanej powierzchni szkiełka przedmiotowego, rozprowadza się znana objętość zawiesiny.
Preparat po utrwaleniu barwi się i liczy drobnoustroje pod mikroskopem z użyciem obiektywu
immersyjnego. Metoda ta pozwala na oznaczenie liczby bakterii w badanym produkcie. Do
prawidłowego przeprowadzenia badania przygotowuje się trzy preparaty z tej samej zawiesiny. W
każdym preparacie oblicza się średnią z 20 pól widzenia, a następnie średnią z trzech preparatów.
Liczbę bakterii w 1cm
3
oblicza się ze wzoru:
gdzie:
a - średnia liczba bakterii w jednym polu widzenia
b - powierzchnia preparatu
c - objętość zawiesiny wprowadzonej na szkiełko przedmiotowe
πr
2
- powierzchnia pola widzenia
2. METODY POŚREDNIE
Metody pośrednie oznaczania liczby bakterii polegają głównie na liczeniu kolonii metodą płytkową.
Ogólną zasadą metod płytkowych jest posiew określonej objętości badanej próbki na podłoże stałe,
a po okresie inkubacji - stwierdzenie liczby wyrosłych kolonii. Metodami tymi można z większym
lub mniejszym prawdopodobieństwie określić rzeczywistą liczbę drobnoustrojów. Wyniki jednak są
zawsze niższe, ponieważ na płytkach liczy się tylko kolonie drobnoustrojów, które są zdolne do
wzrostu na danym podłożu i w danej temperaturze. Ponadto niektóre bakterie, występujące w
skupiskach i łańcuszkach złożonych niekiedy z kilkudziesięciu komórek, dają również jedną
kolonię.
Metody pośrednie są oparte na:
•
posiewie i liczeniu kolonii metodą zalewową
•
posiewie powierzchniowym
•
oznaczeniu najbardziej prawdopodobnej liczny drobnoustrojów (NLP)
Posiew ilościowy metodą płytkową
Metoda płytkowa została wprowadzona przez Roberta Kocha i oprócz liczenia znalazła
zastosowanie do izolowania czystych kultur i obserwacji morfologicznych kolonii
mikroorganizmów.
Posiewu można dokonać w dwojaki sposób:
•
przez wprowadzenie badanej próbki do płytki i zalanie jej upłynnionym podłożem stałym
(metoda zalewowa)
•
przez wprowadzenie próbki na powierzchnię zastygłego podłoża i rozprowadzenie za
pomocą głaszczki (metoda posiewu powierzchniowego)
Oznaczanie liczby drobnoustrojów metodą posiewu powierzchniowego
Przy ilościowym oznaczaniu określonych grup drobnoustrojów na podłożach wybiórczych stosuje
się posiew powierzchniowy na pożywki uprzednio rozlane i zestalone w płytkach. Najczęściej
posiewa się po 0,1 lub 0,5 cm
3
z odpowiednich rozcieńczeń próbki i natychmiast rozprowadza
równomiernie po całej powierzchni za pomocą specjalnie wygiętej jałowiej bagietki (głaszczki).
Metoda płytkowa Kocha doczekała się licznych udoskonaleń i modyfikacji oraz automatyzacji.
Określenie najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów
Metoda ta służy do oznaczania drobnoustrojów występujących w niewielkiej liczbie w produkcie
spożywczym. Polega ona na hodowli określonych grup bakterii na pożywkach selektywnych
(płynnych lub stałych) . Tego rodzaju podłoża sprzyjają namnożeniu się bakterii występujących w
niewielkiej liczbie. W metodzie używa się trzech lub pięciu probówek (lub płytek), zawierających
odpowiednio po 10cm
3
lub 15cm
3
podłoża, ustawionych w trzech rzędach, zależnie od kierunku
analizy i rodzaju produktu. Do pierwszego rzędu probówek posiewa się po 10cm
3
próbki z
rozcieńczenia wyjściowego (1:10) a następnie po 1 cm
3
z dwóch kolejnych rozcieńczeń
dziesiętnych. Jeśli posiewamy po 10cm
3
próby, w pierwszym rzędzie pożywka powinna być
podwójnie stężona. Po inkubacji, z odpowiednich tabel opartych na rachunku prawdopodobieństwa
odczytuje się najbardziej prawdopodobną liczbę bakterii.
•
metoda sedymentacyjna (tzw. metoda płytkowa Kocha) - polegającą na osiadaniu
drobnoustrojów na powierzchni zestalonego podłoża agarowego pod wpływem naturalnych
sił grawitacji. Zakłada się, że podczas 5 minut ekspozycji, na płytce Petriego o powierzchni
100cm
2
osiada tyle drobnoustrojów, ile znajduje się w 10 litrach powietrza. po inkubacji
policzyć wyrosłe kolonie, a liczbę bakterii i grzybów w 10 litrach powietrza (X) obliczyć ze
wzoru:
a - liczba kolonii wyrosłych na płytce
b - powierzchnia płytki (dla płytki o średnicy 10 cm pow. wynosi 78,5 cm
2
)
c - współczynnik czasu ekspozycji wynoszący 1 dla 5 min, 2-10min, 3-15min
•
metoda zderzeniowa - w której stosuje się wymuszone osiadanie drobnoustrojów na
powierzchni podłoża hodowlanego za pomocą aparatu, który zasysa określoną objętość
powietrza. Pozwala to na dokładne przeliczenie drobnoustrojów przypadających na
określoną objętość powietrza.
•
metoda filtracyjna - polegającą na przepuszczeniu określonej objętości powietrza przez
jałowy filtr membranowy lub płyn fizjologiczny. Filtr przenosi się na zestalone podłoże i
inkubuje, z płynu fizjologicznego wykonuje się posiew powierzchniowy na podłoże
agarowe
METODY WSKAŹNIKOWE
Metody wskaźnikowe pozwalają na stwierdzenie obecności drobnoustrojów na podstawie ich
aktywności biochemicznej. Metodami tymi określa się obecności drobnoustrojów które nawet w
niewielkich ilościach wskazują na stan sanitarny produktu, jednocześnie są trudne do wykrycia
metodami płytkowymi.
Do metod wskaźnikowych zalicza się:
•
oznaczanie miana
•
próbę reduktazową
Oznaczanie miana
Mianem określa się najmniejszą ilość produktu, w której stwierdzono obecność danego
drobnoustroju. W celu oznaczenia miana, do rzędu probówek z podłożem płynnym posiewa się po
1cm
3
odpowiednich rozcieńczeń badanego produktu. Ostatnie rozcieńczenie, w którym stwierdzono
jeszcze dodatnią reakcję (wzrost, zmianę barwy pożywki czy wzrost i obecność gazu), przyjmuje
się jako miano.
Powszechnie stosuje się oznaczanie miana coli oraz miana enterokoków, a także bakterii
beztlenowych.
Miano coli
Najczęściej stosowanym oznaczeniem w ocenie sanitarno-higienicznej jest określenie miana coli.
Pałeczki z grupy okrężnicy występują w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt, stanowiąc
główny składnik mikroflory. Obecność bakterii coli w produkcie wskazuje na możliwość
zanieczyszczenia kałowego, a tym samym na możliwość zakażenia bakteriami chorobotwórczymi z
grupy drobnoustrojów jelitowych, które należą do tej samej rodziny, co pałeczka okrężnicy.
Do oznaczania miana coli stosuje się płynne pożywki wybiórcze. Dodatek pewnych związków,
takich jak fiolet krystaliczny czy zieleń brylantowa, hamuje wzrost pozostałych bakterii głównie
gram-dodatnich. Selektywność pożywki zwiększa dodatek kwasów żółciowych. Obecność pałeczek
z grupy coli stwierdza się na podstawie wytworzonego z laktozy gazu w trakcie fermentacji.
Hodowlę prowadzi się w temperaturze 37
0
C przez 24-48 godzin.
Oznaczenie miana coli metodą probówkowo- fermentacyjną daje wyniki orientacyjne. Dlatego też
w razie wyników dodatnich lub wątpliwych stosuje się badania potwierdzające. Próby dodatnie i
wątpliwe przesiewa się na podłoża wybiórcze które umożliwiają dalszą identyfikację pałeczek z
grupy okrężnicy.
Miano enterokoków
Enterokoki, głównie gatunki Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium, występują podobnie jak
Escherichia coli, w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt. Ich obecność w żywności świadczy
o zakażeniu kałowym. W odróżnieniu od pałeczek z grupy coli, enterokoki odznaczają się większą
odpornością na działanie czynników środowiskowych i charakteryzują się znacznie dłuższym
okresem przeżywania. Nadmierna ilość enterokoków w produktach spożywczych może być
przyczyną zatruć pokarmowych. Większość metod stosowanych do ich wykrycia wykorzystuje
azydek sodowy jako czynnik selektywny. Posiewu dokonuje się podobnie jak przy oznaczeniu
miana coli. O wyniku dodatnim świadczy, oprócz zmętnienia, zmiana barwy podłoża.
Miano beztlenowców
Oznaczenie beztlenowców, szczególnie ich komórek, jest trudne z uwagi na konieczność
przestrzegania warunków ściśle beztlenowych. Jak dotąd nie ma uniwersalnej metody ilościowego
oznaczania bakterii beztlenowych. Jako podłoża stosuje się zarówno pożywki stałe, jak i płynne.
Bardzo często jest to podłoże Wrzoska. Wynik dodatni wymaga potwierdzenia badaniem
mikroskopowym lub posiewem na podłoże selektywne.
Próba reduktazowa
Próba reduktazowa, stosowana w ocenie mleka surowego i pasteryzowanego, pozwala na ocenę
jego jakości i ilości zawartych w nim bakterii. Próba reduktazowa jest oparta na oznaczeniu
momentu wyczerpania tlenu rozpuszczonego w mleku przez bakterie. Czas, w jakim tlen zostanie
zużyty, zależy od ilości, rodzaju i aktywności rozwijających się drobnoustrojów. Po zużyciu tlenu
funkcję akceptora wodoru pełni dodany barwnik (błękit metylenowy, resazuryna). Błękit
metylenowy w wyniku zmiany potencjału oksydoredukcyjnego środowiska przechodzi z formy
barwnej w postać bezbarwną. Do bakterii zużywających tlen należą przede wszystkim bakterie
mlekowe oraz pałeczki z grupy coli.