Metodyka standardowych procedur
laboratoryjnych dla prób makrobezkręgowców
wodnych dla celów monitoringu ekologicznego
zgodnego z założeniami RDW
Autor opracowania:
Barbara Bis
Katedra Zoologii Bezkręgowców i Hydrobiologii
Uniwersytet A
ódzki
2006 1
Główny Inspektorat Ochrony Środowiska
Spis treści
1. Standardowe procedury laboratoryjne dla prób makrobezkręgowców wodnych
według wytycznych RDW.................................................................................................... . 3
2. Procedura przygotowania podprób i sortowania ............................................................. . 3
2.1. Sprzęt laboratoryjny potrzebny do przeprowadzenia poboru podprób ................. . 3
2.2. Pobór podrób ................................................................................................................ . 4
2.3. Przygotowanie zawartości podrób do sortowania ............................................................ ..7
2.4. Przebieranie podprób ..................................................................................................... ..9
3. Literatura ............................................................................................................................. 11
4. Aneks I. Schemat techniczny narzędzia do poboru podprób
2006 2
Główny Inspektorat Ochrony Środowiska
1. PROCEDURY LABORATORYJNE DLA PRÓB MAKROBEZKR
GOWCÓW
WODNYCH
Próby bezkręgowców wodnych powinny być przygotowywane w laboratorium w
kontrolowanych warunkach dla poszczególnych etapów pracy - zgodnie ze standardowymi
procedurami wymaganymi przez RDW. Odstępstwo od rekomendowanej metodyki
procedur laboratoryjnych - wpływając bezpośrednio na otrzymane wyniki  zmienia
wartości miar biologicznych i końcową indeksację.
Wszystkie etapy prac laboratoryjnych, do których należą: (1) przygotowanie podprób i
przesiewanie; (2) przebieranie oraz (3) identyfikacja organizmów - z uwagi na zastosowany
podczas konserwowania prób alkohol - powinny być wykonywane w pomieszczeniach z
właściwym dostępem powietrza, tj. klimatyzacją lub dygestorium.
2. PROCEDURA PRZYGOTOWANIA PODPRÓB I SORTOWANIA
Najważniejszą procedurą laboratoryjną dotyczącą wstępnego przygotowania prób jest
prawidłowe pobranie podprób (ang. sub-sampling)  wyodrębnionych z jednej, całkowitej
próby siedliskowej (m.in. Hasse & Sundermann, 2004).
Standardowe przygotowanie podrób z całości pobranego materiału:
zapewnia znaczną redukcję nakładu pracy związaną z rekomendowanymi
procedurami sortowania i identyfikacji materiału biologicznego;
gwarantuje właściwą reprezentatywność podprób dla całości pobranej próby
siedliskowej;
prowadzi do niższych nakładów czasowych związanych z obróbką materiału
biologicznego; i w konsekwencji
zmniejsza łączne koszty monitoringu biologicznego tej grupy organizmów, przy
zachowaniu reprezentatywności prób, poprawności analitycznej indeksacji i końcowej
ocenie stanu ekologicznego w oparciu o zespoły fauny dennej.
2.1 Sprzęt laboratoryjny potrzebny do przeprowadzenia poboru podprób
Do pobierania podprób zalecane jest zastosowanie narzędzia składającego się ze specjalnie
wykonanych do tego celu dwóch kuwet (tj. jedna kuweta umieszczana jest wewnątrz drugiej
- Ryc.1):
zewnętrzna kuweta - jest wodoodporna i wykonana z plastyku (plexiglass) lub
metalu i jest pomocna w procesie homogenizacji próby;
wewnÄ™trzna kuweta - to zmodyfikowane sito do podpròb o powierzchni 30 x 36
cm i Å›rednicy oczek 500 µm. Siatka sita jest podzielona na 30 kwadratów; każde
pole o powierzchni 6 x 6 cm (Ryc. 1). Poprzeczne i podłużne linie pól (5 x 6 linii)
zaznaczone są na krawędziach kuwety-sita. W rezultacie - poszczególne pola są na
jednej krawędzi kuwety ponumerowane od 1 do 5, i na bocznej krawędzi - od 1 do 6
(Ryc.1). W rezultacie, każde pole sita do podprób jest dokładnie oznaczone
dwoma cyframi - co umożliwia dokładny pobór - wytypowanych losowo - podprób.
2006 3
Główny Inspektorat Ochrony Środowiska
Ryc.1. Sprzęt laboratoryjny do przeprowadzenia poboru podprób: narzędzie do selekcji i poboru podprób (A)
składające się z zewnętrznej kuwety plastykowej lub metalowej; kuwety wewnętrznej - sita, z zaznaczonymi
polami do poboru podprób; łyżeczki i/lub prostokątnej łopatki do wybierania podrób; oraz ramki do wycinania
powierzchni podpróby (6x6cm); zestaw do analiz laboratoryjnych: przesiewania i sortowania organizmów (B)
(foto: LAWA-Projekt, 2006).
W konsekwencji, do prawidłowego przeprowadzenia selekcji i poboru podprób potrzebny jest
następujący zestaw podstawowego sprzętu laboratoryjnego (Ryc. 1 i 2):
sito (kuweta wewnętrzna) do pobierania podprób (powierzchnia wewnętrzna 30 cm x
36 cm, Å›rednica oczek 500 µm) z wiÄ™kszÄ… kuwetÄ… zewnÄ™trznÄ… (schemat techniczny
narzędzia do poboru podrób - Aneks I);
łyżeczka i/lub łopatka do wybierania zawartości podpróby;
ramka do odcięcia powierzchni podpróby;
ok. 15 probówek/pojemniczków do organizmów(objętość 25 ml);
pęsety;
etanol (70 %, ok. ¾ litra);
licznik do organizmów;
etykiety;
dwie kostki do rzutów losowych dla liczb wskazujących numerację podprób lub
generator liczb losowych (oprogramowanie komputerowe);
sito do redukcji materiału organicznego i mineralnego o średnicy oczek 2mm (z
wiadrem lub kuwetą na redukowane podłoże).
2.2 Pobór podprób
Jeśli próba siedliskowa fauny dennej była przechowywana w więcej niż jednym
pojemniku, należy połączyć razem zawartość wszystkich pojemników danej
próby.
Materiał całej próby należy delikatnie rozprowadzić po powierzchni kuwety (sita
do podprób) i przelać wodą aby zredukować sedyment - jeśli na sicie znajdują się
większe cząstki materii organicznej np. gałązki lub duże liście, wtedy należy je
delikatnie przepłukać i usunąć z próby (rys. 2A). Ta część pracy powinna trwać nie
dłużej niż kilka minut.
2006 4
Główny Inspektorat Ochrony Środowiska
 Następnie, sito do podprób wraz z zawartością próby wstawia się do zewnętrznej
kuwety i zapełnia wodą, aby ułatwić procedurę homogennego rozmieszczenia
zawartości próby.
Materiał z próbą należy delikatnie równomiernie rozprowadzić po całej
powierzchni sita (rys. 2B). Należy przy tym uważać, aby kanty sita zostały także
równomiernie wypełnione materiałem. Potem, należy wyjąć sito do podprób z
zewnętrznej kuwety i pozwolić, aby część wody spłynęła (próba powinna cały czas
pozostawać lekko zanurzona w wodzie) i ponownie umieścić sito wraz z zawartością
próby w kuwecie zewnętrznej.
Ryc. 2. Procedura laboratoryjna wstępnego przemywania materiału z próby (A) oraz równomiernego
rozmieszczenia zawartości całej próby na sicie do poboru podprób (B) (foto: LAWA-Projekt, 2006).
Następnie, należy wybrać losowo pięć pól które będą stanowić podpróby z
przeznaczeniem do dalszej analizy laboratoryjnej (losowy wybór prób przeprowadzić
można np. za pomocą rzutów kostką lub komputerowego generatora liczb).
Ryc. 3. Pobór podprób za pomocą ramki odcinającej powierzchnię podpróby (A) oraz zawartość podpróby wraz
z etykietÄ… (B) (foto: LAWA-Projekt, 2006).
Materiał z pięciu pól pobiera się za pomocą ramki do odcinania pola powierzchni
kwadratu (6 x 6cm) i łyżeczki bądz
łopatki (Ryc. 2B). Materiał przekłada się do białej
2006 5
Główny Inspektorat Ochrony Środowiska
kuwety (Ryc. 3B). Jeśli materiał roślinny wychodzi poza powierzchnie pola, to
należy go delikatnie przeciąć nożyczkami. Jeśli jakiś organizm leży na granicy dwóch
pól to należy go przyporządkować do pola, na którym leży jego większa część.
Ryc. 3. Przykładowa selekcja podprób za pomocą ramki odcinającej powierzchnię podpróby.
Po poborze pięciu podprób reszta materiału powinna nadal pozostawać na sicie do
poboru prób - aż do momentu naliczenia minimalnej liczba organizmów, która jest
wymagana do reprezentowania danej próby.
Pobór podprób należy przeprowadzić na podstawie dwóch podstawowych
kryteriów:
- podpróba musi zawierać co najmniej 350 organizmów;
- podpróba powinna zawsze odpowiadać co najmniej 1/6 próby całościowej (tj.
5 pól z 30)  oznacza to że należy zawsze pobrać minimum 5 podprób - nawet
jeśli przekroczona jest wymagana liczba osobników.
Jeśli po analizie 5 podprób minimalna liczba organizmów nie zostanie uzyskana, to
należy przebrać odpowiednią większą ilość pól - do finalnej wyznaczonej liczby
minimum 350 osobników (wtedy dopiero należy usunąć pozostały materiał z sita).
Należy jednak pamiętać, że każde rozpoczęte pole powinno być przebrane do
końca, nawet jesli już na początku sortowania uzyska się 350 organizmów.
W trakcie przebierania podprób, należy zwrócić uwagę, aby pozostała zawartość
próby na sicie nie została przesuszona (dodawać wody i przykrywać zawartość
próby folią aluminiową).
Jeśli materiał z próby nie mieści się na jednej kuwecie, należy użyć odpowiednio
więcej kuwet i postępować wg opisanej procedury. tj. liczba pobranych podprób na
obu sitach powinna być jednakowa (min. 5 pól). Potem, materiał należy połączyć
razem i przebierać wg opisanej powyżej procedury.
2006 6
Główny Inspektorat Ochrony Środowiska
2.3 Przygotowanie zawartości podrób do sortowania
W celu lepszej jakości procedur przebierania prób oraz dla redukcji gruboziarnistych frakcji
żwiru i CPOM - materiał po pobraniu podrób należy przenieść na zestaw sit o wielkości
oczek 500 µm i 2 mm (Rys. 4) i przepÅ‚ukany. Po przeÅ‚ożeniu niewielkiej części
przepłukanego materiału do kuwety z woda należy rozpocząć sortowanie organizmów.
Ryc. 4. Pobór podprób za pomocą ramki odcinającej powierzchnię podpróby (A) oraz zawartość podpróby
wraz z etykietÄ… (B) (foto: M.Wenikajtys).
2.4 Przebieranie podprób
Podpróbę należy przebierać w specjalnej kuwecie przeznaczonej do sortowania materiału -
dodając wodę, nakładając małe porcje i równomierne rozkładając materiał na
powierzchni kuwety.
Należy starać się, aby materiał z próby pokrył najwyżej połowę kuwety do sortowania, wtedy
małe i ciemno zabarwione organizmy będą dobrze widoczne (Ryc. 5; w szczególności
dotyczy to materiału zawierającego duże ilości drobnocząsteczkowej materii organicznej).
Organizmy obecne w próbie powinny zostać całkowicie przebrane i rozdzielone na rzędy
(przechowywane w 70 % etanolu) do dalszej dokładniejszej identyfikacji. Podczas sortowania
należy dokładnie policzyć wszystkie organizmy  najlepiej za pomocą ręcznego licznika
(Rys. 5).
Nie należy wybierać z prób: form uskrzydlonych owadów imagines, wylinek oraz
osobników, które zostały mocno mechanicznie uszkodzone i nie nadają się do
dokładniejszych oznaczeń taksonomicznych. Nie należy liczyc także pustych domków larw
chruścików (jeśli przy sortowaniu domków chruścików są wątpliwości czy w środku jest
larwa, należy domek wybrać, jednak nie liczyć).
Nie liczy się organizmów w stadium poczwarki - z wyjątkiem poczwarek Blephariceridae i
Simuliidae (Diptera). Puste muszle i domki ślimaków wybiera się tylko w celu weryfikacji
póz
niejszych oznaczeń na kompletnych organizmach  ale nie powinny być liczone.
2006 7
Główny Inspektorat Ochrony Środowiska
Ryc. 5. Sortowanie materiału biologicznego (foto: LAWA-Projekt, 2006)
Liczbę pobranych podprób (pól) dla danej próby siedliskowej należy dokładnie
odnotować aby móc przeliczyć liczebność organizmów na całkowitą próbę oraz ma to także
znaczenie dla kontroli jakościowej.
Literatura
AQEM consortium. 2002. Manual for the application of the AQEM system. A comprehensive
method to assess European streams using benthic macroinvertebrates, developed for the
purpose of the Water Framework Directive. Version 1.0. www.aqem.de.
AQEM & STAR Site Protocol. 2002. www.eu-star.at. Protocols.
Furse, M., Hering, D., Moog, O., Verdonschot, P., Sandin, L., Brabec, K., Gritzalis, K.,
Buffagni, A., Pinto, P., Friberg, N., Murray-Bligh, J., Kokes, J., Alber, R., Usseglio-
Polatera, P., Haase, P., Sweeting, R., Bis, B., Szoszkiewicz, K., Soszka, H., Springe, G.,
Sporka, F. & Krno, I. 2006. The STAR project: context, objectives and approaches.
Hydrobiologia, 566:3-29; Theme: The Ecological Status of European Rivers: Evaluation
and Intercalibration of Assessment Methods.
LAWA-Projekt O 4.02. Handbuch zur Untersuchung und Bewertung von Fließgewässern auf
der Basis des Makrozoobenthos vor dem Hintergrund der EG-Wasserrahmenrichtlinie
www.fliessgewaesserbewertung.de [Stand Februar 2006], 108pp.
Hasse, P., Sundermann, A. 2004. Standardisierung der Erfassungs- und
Auswertungsmethoden von Makrozoobenthos-untersuchungen in Flie²gewässern.
Förderkennzeichen: O 4.02
Clarke, R., Davy-Bowker, J., Sandin, L., Friberg, N., Johnson, R.K., & Bis, B. 2006.
Estimates and comparisons of the effects of sampling variation using  national
macroinvertebrate sampling protocols on the precision of metrics used to assess
ecological status. Hydrobiologia, 566, 1: 477-503, Theme: The Ecological Status of
European Rivers: Evaluation and Intercalibration of Assessment Methods The EU
STAR project.
2006 8
Główny Inspektorat Ochrony Środowiska
Aneks I. Schemat techniczny narzędzia do poboru podprób
2006 9
Główny Inspektorat Ochrony Środowiska
2006 10
Główny Inspektorat Ochrony Środowiska
2006 11
2006 11
Główny Inspektorat Ochrony Środowiska
Główny Inspektorat Ochrony Środowiska