Spektrometria Mas
Analiza jakościowa i ilościowa benzokainy za pomocą
wysokorozdzielczego chromatografu gazowego sprzęgniętego ze
spektrometrem mas z jonizacjÄ… elektronami (EI)
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z techniką spektrometrii mas typu EI
(Elektron Impact,) interpretacją, obróbką komputerową widm masowych,
doborem mas do analizy ilościowej oraz sposobem identyfikacji substancji na
podstawie ich widm.
1. Analiza jakościowa
1.1 Analizie podany zostanie metanolowy roztwór benzokainy (ester
kwasu p-aminobenzoesowego, PABA) o wzorze sumarycznym
C H NO i masie molowej 165,19 g/mol.
9 11 2
Z otrzymanego roztworu dodaj dokładnie 1,5 ml do fiolki a
następnie szczelnie zakapsluj przy pomocy ręcznej kapslownicy.
Fiolkę umieść w odpowiednim gniez
dzie autosamplera
znajdujÄ…cego siÄ™ na obudowie chromatografu gazowego.
1.2 Ustaw program analizy chromatograficznej:
temperatura pieca: 50°C (2 min.), potem 15°/min.do 300°C,
wstrzymać 11 min.
temperatura komory nastrzykowej: 250°C, tryb: Splitless,
Ilość nastrzyku: 1µl, pÅ‚ukanie: dwa razy z fiolki A, dwa razy fiolki B,
powtórzyć po nastrzyku
Możesz skorzystać z gotowego programu sprawdzając powyższe
parametry.
1.3 Wejdz
na stronÄ™  Tune programu  TurboMass i sprawdz
czy
ciśnienie jest odpowiednie (zbyt mała próżnia spowoduje
zniszczenie emitera elektronów-żarnika). Następnie ustaw
parametry anlizy spektrometru masowego trybie  Full Scann w
zakresie mas od 40 do 180 m/z:
Mass start: 40 m/z
Mass end:180 m/z
Time (okno czasowe w którym wykonywane będzie skanowanie
wybranych mas): Start-0; End-23 min.
Method: centroid
Scan Time (określa czas trwania każdego skanu w sekundach): 0,5
Inter-Scan Deley (określa czas w sekundach pomiędzy
zakończeniem skanowania i rozpoczęciem następnego (ogólny czas
skanowania=Scan Time+ Inter-Scan Deley)): 0.1.
1.4 Zapisz swoją analizę w arkuszu analiz wyszczególniając metodę
chromatograficzną oraz metodę spektrometrii masowej, którą
utworzyłeś (pamiętaj o wpisaniu numeru gniazda autosamplera z
którego ma być pobrana analiza).
1.5 Sprawdz
szczelność systemu na stronie  Tune wpisując masy
helu(gazu nośnego) oraz gazów stanowiących główne składniki
atmosfery ziemskiej i porównaj proporcje tych pików.
1.6 Jeżeli ciśnienie (próżnia) jest wystarczające oraz nie stwierdzasz
przecieków-uruchom analizę.
1.7 Na podstawie wzoru strukturalnego oraz twojej wiedzy z zakresu
fragmentacji kationorodników oraz reguły parzystości zaproponuj
w poniższej tabeli teoretyczne metody fragmentacji, zaznaczając
masę danego fragmentu. Postaraj się nazwać każdy opisany przez
ciebie rodzaj fragmentacji np. przegrupowanie McLafferty ego,
fragmentacja Ä… inicjowana przez rodnik, fragmentacja Ä… inicjowana
przez ładunek itd. Pamiętaj, że produkty nie naładowane dodatnio
np. rodniki (w wyniku fragmentacji powstaje kation i rodnik) nie
ujawniajÄ… siÄ™ w widmie MS. Podczas opisywania reakcji
fragmentacji ładunek umieszcza się w miejscu o najniższym
potencjale jonizacji pamiętając, że w rzeczywistości jest on
rozproszony w obrębie całej cząsteczki. Pamiętaj, też o efekcie
indukcyjnym, który powoduje, iż czasami atom o niskim potencjale
jonizacji przyłącza elektron i tworzy obojętny rodnik. Posługuj się
kalkulatorami mas znajdujÄ…cymi siÄ™ w programie  TurboMass lub
dostępnymi za darmo w Internecie.
Proponowane typy fragmentacji
1.8 Po zakończeniu analizy obejrzyj chromatogram (w spektrometrii
masowej nazywany TIC (Total Ion Current), gdyż powstaje z
 ogólnego prądu spektrometrii mas). Przeskanuj cały TIC
znajdujący się w okolicach 10 min i porównaj czy znalazły się tam
masy fragmentów zaproponowane przez ciebie w tabelce powyżej.
1.9 Skorzystaj z dostępnej w programie biblioteki widm masowych, aby
potwierdzić czy wybrany pik chromatograficzny należy do
benzokainy, pamiętając o użyciu funkcji  Combine i odjęciu widma
mas tła.
1.10 Obejrzyj widma masowe innych pików znajdujących się na
chromatogramie, zidentyfikuj je przy pomocy biblioteki widm i
zaproponuj od czego mogą pochodzić np.: adsorbent kolumny,
zanieczyszczenie benzokainy, produkt rozkładu benzokainy etc?
1.11 Przy pomocy funkcji  Display Mass sprawdz
czy pojawiajÄ…
się w chromatografie piki o masach występujących w benzokainie.
1.12 Oblicz (przy pomocy zainstalowanej aplikacji) wartość
stosunku sygnału do szumu. Określ możliwości analizy jakościowej i
ilościowej takiego stężenia benzokainy (pamiętając o efekcie
matrycy). Za granicę wykrywalności przyjmuje się wartość S/N=3 za
granicę oznaczalności S/N=8-10.
1.13 Wybierz i uzasadnij masy które będziesz skanował w trybie
SIM (Selected Ion Monitoring) podczas oznaczania benzokainy.
1.14 Wnioski dotyczące analizy jakościowej:
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & .....
............................................................................................................
2 Analiza ilościowa
2.1 Po wybraniu mass do wykonania analizy w trybie SIM (pamiętając,
że wybieramy masy charakterystyczne dla związku i najbardziej
intensywne) przejdz
do okna analizy MS w trybie SIM/SIR i ustaw
następujące parametry:
Mass: wpisz wybrane przez ciebie masy i dodaj do tabelki
Dwell czyli czas w sekundach, w których wybrana masa ma myć
monitorowana: najczęściej wybieramy dziesiąte części sekundy
Inter Chennel Delay czyli odpowiednik Inter-Scan Deley z analizy w
trybie Full Scan: standardowo ustawiamy 0.02
Span czyli okno mas, margines jaki ma być skanowany w obrębie
zadanej masy. Czym większa wartość tym mniejsze
prawdopodobieństwo  przeoczenia zadanej masy ale
jednocześnie mniejsza czułość analizy: standardowo ustawiamy tę
wartość na 0.2 ( czyli np.skanowana jest wartość powiedzmy 100
to w rzeczywistości skanowane są masy od 80-120 m/z)
2.2 SporzÄ…dz
5 roztworów wzorcowych stężeniach 20,40;80;120,160
mg/100ml i umieść po 1,5 ml w oznaczonych fiolach poczym
zakapsluj je.
2.3 Umieść w odpowiednich gniazdach autosamplera i wyznacz
warunki analizy w arkuszu analiz, zostawiajÄ…c metodÄ™
chromatograficzną taką jak w analizie jakościowej oraz zaznaczając
zaprogramowaną przez ciebie analizę w trybie SIM (pamiętaj o
zaznaczeniu odpowiednich gniazd autosamplera oraz wykonaniu
ponownej analizy badanej próbki w trybie SIM.
2.4 Po wykonaniu analiz, odnajdz
pik (TIC) znajdujÄ…cy siÄ™ przy czasie
retencji zidentyfikowanym (podczas analizy jakościowej) dla
benzokainy i wyznacz wartości S/N. Porównaj jak zwiększyła się ta
wartość i tym samym SIM wpływa na poprawę czułości analizy.
2.5 Pamiętając, że jest to tylko ogólne oszacowanie, wyznacz jakie
stężenia można by zidentyfikować a jakie oznaczyć w trybieSIM
(S/N=8-10-granica oznaczalności, S/N=3-granica wykrywalności).
2.6 Zintegruj pik chromatograficzny (TIC) zidentyfikowany jako
benzokaina i sporzÄ…dz
krzywÄ… regresji wyznaczajÄ…c parametry
regresji. Następnie oblicz zawartość benzokainy w badanej próbce.
W zależności jak postanowi prowadzący ćwiczenia analizę ilościową
wykonaj sporządzając ręcznie krzywą wzorcową i obliczając
zawartość lub skorzystaj z gotowej aplikacji (wymagającej napisania
jednak programu ilościowego) programu  TurboChrom.
2.7 Mimo, iż oznaczenie benzokainy wykonane było bez użycia wzorca
wewnętrznego opisz jakie korzyści daje użycie metody wzorca
wewnętrznego i jaki wzorzec mógłby być tu użyty.
2.8 Pod wnioskami dotyczącymi oznaczenia benzokainy umieść
wydruki widm masowych oraz chromatogramy użyte podczas
ćwiczeń.
2.9 Wnioski dotyczÄ…ce oznaczenia benzokainy:
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & ......................
Zakres wiedzy potrzebnej do przystąpienia do ćwiczenia:
-budowa spektrometru masowego z elektronowym z
ródłem jonizacji i pojedynczym kwadrupolem
- rodzaje fragmentacji kationów nieparzystoelektronowych
-interpretacja widm masowych (typ jonizacji EI)
y
ródła:
Wykłady dla studentów farmacji i oddziału analityki medycznej II roku prof. Z.J Kokot
Spektroskopia Mas E. de Hoffman, J Charette, V. Stroobant