Białka i kwasy nukleinowe
Notatki te z pewnością zawierają błędy i braki, więc jeżeli ktoś takowe zauważy prosiłbym by nie
zachowywał tego dla siebie, tylko dał mi znać na maila [e-mail], postaram się je
jak najszybciej poprawić/ uzupełnić.
Slajdy dostępne pod adresem http://www.biol.uw.edu.pl/zbm/wyklad/
hasło: mimoza
Wykład 11
Oddziaływania białko-białko:
SÄ… uniwersalne (w sensie powszechne).
Charakteryzują się różnymi poziomami swoistości/ stabilności. Rodzi to problem potrzeby
weryfikacji fizjologicznej prawdziwości zidentyfikowanych kompleksów, gdyż okazuje się, że w
badaniach interaktomicznych potrafią wychodzić kompleksy np. między białkami z innych
kompartmentów komórkowych.
Różnica siły wiązań to nawet dwanaście rzędów wielkości! np.
SÅ‚abe wiÄ…zanie kinazy ze swoimi substratami
Mocne wiązanie trypsyna ze swoim inhibitorem (do ich oddzielenia trzeba zdenaturować białka)
Bywają duże, wieloskładnikowe kompleksy w których siła oddziaływania różnych elementów jest
różna, jak np. w Polimerazie II RNA.
Średnio powierzchnia oddziaływań między białkami wynosi kilkanaście procent, jednak wariancja
jest tu bardzo duża, np. dla dimeru fosfatazy ? To 5% a dla represora Trp 30%.
Oddziaływania biorące w nich udział:
" Hydrofobowe  istotniejszy wpływ niż w układzie DNA-białko, często nieswoiste, ale
stabilizujące (o dużym wkładzie energetycznym) np. kieszonka Phe
" Wodorowe  też istotny wpływ energetyczny i bardziej specyficzne np. między glutaminami
" Mostki solne  np. między Lys i Glu
Powierzchnie oddziaływania zwykle są płaskie, chociaż bywają dopasowane zarówno kształtem,
jak rozkładem ładunków.
Struktury II rzędowe, zasadniczo wszystkie biorą udział.
Między helisami amfipatycznymi np. białka Fos, Jun, czy UHM. To ostatnie ma motyw RRM w
którym na platformie z ²-harmonijki ukÅ‚ada siÄ™ RNA, ale przyciskajÄ…ce dwie helisy oddziaÅ‚ujÄ… z
białkowym ligandem.
Białka Mago i Y14 są przykładem oddziaływania ze sobą dwóch różnych struktur II rzędowych, tu
2 helisy z Mago i ²-harmonijka z Y14.
Kompleksy zasadniczo dzielą się na obligatoryjne (tworzące strukturę IV rzędową) i fakutatywne
(oddziaływania mogą być regulowane).
Czynniki wpływające na oligomeryzację, to:
" pH, siła jonowa i temperatura (w komórce mało regulowane)
" stężenie podjednostek
" wiÄ…zanie ligandu
" modyfikacje posttranslacyjne (głowna kontrola)
np. bromodomena w białku p53 oddziałuje jedynie z acetylowanymi resztami histonów, albo białko
cdc25 dopiero po fosforylacji dimeryzuje.
Nietypowy zegar biologiczny sinic, nie opiera się na ekspresji genów a kontroli oddziaływań przez
fosforylacjÄ™.
Układ składa się z 3 białek:
KaiC  główne białko mające dwa zależne od siebie miejsca fosforylacji, na Ser i Thr.
Ufosforylowanie Thr pozwala na fosforylacjÄ™ Ser i defosforylacja Thr pozwala na defosforylacjÄ™
Ser.
KaiB  wiąże KaiA z KaiC, kiedy KaiC jest ufosforylowane na Ser.
KaiA  propaguje (?) fosforylacjÄ™ KaiC i hamuje jego defosforylacjÄ™.
Zegar działa następująco:
1. KaiC autofosforyluje się na Thr. Jako, że KaiA jest dostępne sprzyja temu.
2. Fosforylacja Thr pozwala na fosforylacjÄ™ Ser.
3. Ufosforylowana Ser powoduje wiÄ…zanie przez KaiB KaiA do KaiC
4. Wiązanie KaiA powoduje, że zwalnia fosforylacja i w końcu zaczyna się defosforylacja
5. Następuje defosforylacja Thr i wtórnie defosforylacja Ser
6. Prowadzi to do uwolnienia KaiB i KaiA i cykl rusza z pkt 1
Całość trwa 24h.
Przykład kontroli przez wiązanie ligandu  białka G.
Przyłączenie ligandu powoduje zamianę GDP na GTP, co obniża powinowactwo tej podjednostki,
która oddysocjowuje i będzie mogła być ponownie związana po pewnym czasie dzięki
wykazywanej aktywności wolnej GTPazy.
Helisa prolinowa  segment łańcucha polipeptydowego o specyficznej sekwencji występowania
proliny. Dużo Pro powoduje zwinięcie się w tę helisę (dzięki temu, że Pro ma ograniczoną ilość
kątów Ś), gdzie co trzecia reszta ma identyczne ułożenie jak pierwsza (1, 4, 7 etc.).
Prowadzi to do powstania regularnej, hydrofobowej ścieżki i regularnie ułożonych reszt aa i grup
karboksylowych w łańcuchy, co daje świetny materiał do oddziaływań białko-białko.
Często znajduje się ona znajduje się ona na końcu łańcucha i tam wystaje jako sztywne fragmenty.
Wydaje się, że oddziaływania białko-białko gwarantowane przez fragmenty bez Pro są szybsze,
jednak niespecyficzne i muszą być obecne inne elementy gwarantujące ową specyficzność.
Sporo kinaz wpływa na oddziaływanie białko-białko wpłaśnie przez fosforylację motywów
prolinowych, często w centrach aktywnych samemu takowe posiadając np. ERK i CDK
Domany oddziałujące z helisami prolinowymi to min. SH3 i WW
SH3  rozpoznaje motyw PXXP, jak widać rozpoznawana jest przez niego helisa Pro w obie strony
(symetrycznie) a specyficzność jest gwarantowana przez Glu i aa dodatnio naładowany położony
obok. Domena ta nie daje swoistości a szybkość rozpoznawania! Występuje w takich kinazach jak
Src, czy PI3K
domena WW [nazwa od dwóch kluczowych Trp]  również do szybkiego rozpoznawania, np. w
białku Nedd widać, że inne fragmenty gwarantują swoistość.
Acetocholinoesteraza ma domenę PRAD z ą-helisą, którą oddziałuje z helisą Pro białka ColQ
Należy pamiętać, że występują dwie energetycznie do siebie zbliżone konformacje przy Pro. 94%
cis i 6% trans, gdyż ciężko w siebie przechodzą co jest kontrolowane enzymatycznie (przez
izomeraza peptydyloprolylowÄ…).
Kinematyka powstawania kompleksów białko-białko  w czasie oddziaływania ligand dopasowuje
się do miejsca wiązania na podstawie  fałszywych połączeń i dlatego ważne są szybkie domeny do
 złowienia go. Taką samą zresztą funkcję pełnią motywy nieustrukturalizowane ( łowienie na
wędkę )
Istnieją białka o dużej ilości partnerów, pełniące funkcję  rusztowań np. domena WB w RbApA8,
albo w ²-arrestynie (wyÅ‚Ä…czanie receptorów), czy biaÅ‚kach Å‚Ä…czÄ…cych siÄ™ z biaÅ‚kami
rozkładającymi second massengery.
CDK zyskują specyficzność substratową dzięki łączeniu różnych cyklin (jeśli ktoś chce się
dowiedzieć, że to nieprawda polecam monograf  regulacja cyklu komórkowego w rozwoju i
nowotworzeniu )
Kontrola tak ważnego procesu jak apoptoza również opiera się na oddziaływaniach białko-białko.
Metody badań:
Wysokoprzepustowe badania interaktomiki  TAP (tandem affinity purification) i Y2H.
Wysokoprzepustowe badania proteomu  żele 2-D i spektroskopia mas.
Drożdżowy system dwuhybrydowy (Y2H)  rozdzielamy na dwie części czynnik transkrypcyjny
genu reporterowego i dofuzjowujemy do niego badane białko, sprawdzając czy będzie transkrypcja.
Zalety proste, szybkie, tanie
Wady bywa nieswoiste i nie wszystkie białka można tak badać, np. hydrofobowe, albo stopujące
transkrypcje
Inne metody:
" dwie części ubikwityny i po dimeryzacji przcięcie reportera
" dwie części fluorochromu
" FRET  przekazanie energii pomiędzy fluorochromami
Chromatografia powinowactwa  głównym problemem są niespecyficzne wiązania, więc często
dodaje siÄ™ swa tagi i i po pierwszej selekcji odcina siÄ™ pierwszy i selekcjonuje na drugi.
Koimmunoprecypitacja  przeciwciałami wyciągamy białko razem ze wszystkim z czym się wiąże
(oczywiście poza miejscem na które mamy przeciwciało). Potem puszczamy na żel i analizujemy na
MS.
PhD (Phage Display)  prezentacja fagowa. Mamy bibliotekę fagów, gdzie na powierzchni kapsydu
prezentowane są wszystkie możliwe kombinacje aa (zwykle fregmenty 7-12aa) i sprawdzamy które
są wiązane do naszego białka. Możemy przeprowadzić kilka cykli namnożeń i wiązań (dostajemy
specyficzność) a na końcu sekwencjonujemy.
Metoda wymiany deuter/ wodór  fizykochemiczna, dzięki temu, że możemy blokować kontrolując
pH i potem analizując na MS stwierdzać jej powierzchnie.
Metoda z unieruchamianiem białek na fazie stałej  Jako, że w trakcie łączenia możemy sprawdzać
jak zmieniają się właściwości optyczne układu w czasie rzeczywistym pozwala ona na określenie
parametrów kinematycznych.
Mikromacierze białkowe  wysokoprzepustowa, analogiczna do DNA.
Dobór metody zależy od etapu na jakim prowadzimy badania. Czy są one wysokoprzepustowe
(łowienie na wędkę), czy preparatywne (na fazie stałej). Niekture pozwalają lokalizować wewnątrz
komórki a inne dają informację o kinematyce.
Modelowanie kompleksów  proces analogiczny do modelowania białek i również
najskuteczniejsze okazujÄ… siÄ™ metody przez homologiÄ™
Wykład 12
Sieci interakcji:
Można je różnie korelować np. z występującymi kompleksami, albo z lokalizacją subkomórkową.
Jaki majÄ… sens?
1. Znajdowanie węzłów  widać, że ich stopień koreluje z letalnością mutantów
2. Znajdowanie szlaków metabolicznych
3. Znajdowanie uniwersalnego, powtarzalnego rdzenia między gatunkami/ genomami/
proteomami
4. Określanie istotności białka w jakimś procesie np. starzeniu się człowieka
Podstawową trudnością jest potrzeba filtrowania wyników uzyskanych metodami
wyokoprzepustowymi. Zwykle korzysta się z metod klasycznych i potem składa bioinforamtycznie
tworzÄ…c nowy obraz.
Istnieją różne rodzaje węzłów np. białka tworzące kompleksy wykluczające (z 1, albo z 2, albo z 3)
z jednej stron a białka platformowe (ze wszystkimi naraz) z drugiej.
Dlatego dla zwiększenia informacyjności sieci stworzono  legendy np. standard MIM (Molecular
Interaction Map) i zapisano w nim na slajdzie 12 sieć dla receptora EFG
Ostatnio aktualizowane: 2009r.