EKOFIZJOLOGIA MIKROORGANIZMÓW WODNYCH
DYNAMIKA WYBRANYCH PROCESÓW MIKROBIOLOGICZNYCH
DYNAMIKA WYBRANYCH PROCESÓW MIKROBIOLOGICZNYCH
I WA
AÅšCIWOÅšCI FIZYKO-CHEMICZNYCH WODY
I WA
AÅšCIWOÅšCI FIZYKO-CHEMICZNYCH WODY
W JEZIORZE MIKOA
AJSKIM
W JEZIORZE MIKOA
AJSKIM
ZMIANY PRZESTRZENNE I CZASOWE
ZMIANY PRZESTRZENNE I CZASOWE
III. Aktywność enzymatyczna mikroplanktonu
III. Aktywność enzymatyczna mikroplanktonu
ĆWICZENIA
ĆWICZENIA
Mikołajki: 10  20 czerwiec 2007
1
EKOFIZJOLOGIA MIKROORGANIZMÓW WODNYCH
DYNAMIKA WYBRANYCH PROCESÓW MIKROBIOLOGICZNYCH
DYNAMIKA WYBRANYCH PROCESÓW MIKROBIOLOGICZNYCH
I WA
AÅšCIWOÅšCI FIZYKO-CHEMICZNYCH WODY
I WA
AÅšCIWOÅšCI FIZYKO-CHEMICZNYCH WODY
W JEZIORZE MIKOA
AJSKIM
W JEZIORZE MIKOA
AJSKIM
ZMIANY PRZESTRZENNE I CZASOWE
ZMIANY PRZESTRZENNE I CZASOWE
Aktywność enzymatyczna
Aktywność enzymatyczna
mikroplanktonu
mikroplanktonu
Niniejszy program i opis metod opracowali:
Niniejszy program i opis metod opracowali:
Dr hab. Waldemar Siuda
Dr hab. Waldemar Siuda
Prof. dr hab. Ryszard J. Chróst
Prof. dr hab. Ryszard J. Chróst
Prowadzący ćwiczenia:
Prowadzący ćwiczenia:
Dr hab. Waldemar Siuda
Zakład Ekologii Mikroorganizmów
Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski
Warszawa 2007
2
Wprowadzenie
Wprowadzenie
Jezioro Mikołajskie jest środkową częścią kilkudziesięciokilometrowej rynny jeziorowej,
ciągnącej się z południa na północ, leży na obrzeżach Puszczy Piskiej, w sąsiedztwie Mazurskiego
Parku Krajobrazowego.
Mikołajskie od południa łączy się z Bełdanami, od południowego wschodu przez cieśninę
przy Dybowskim Rogu ze Śniardwami, północną granicą jeziora są mosty w Mikołajkach  za nimi
jezioro Tałty. Na plosie jeziora położone są trzy małe wyspy  dwie na pograniczu z Bełdanami,
trzecia (sztuczna, usypana w latach trzydziestych ub. stulecia) u północnych krańców zbiornika.
Linia brzegowa miernie rozwinięta, brzegi przeważnie wysokie i strome, zachodnie
zalesione (Puszcza Piska), północne i część wschodnich zajmują zabudowania Mikołajek, dalej ku
południowi brzegi wschodnie sa niskie, bezleśne, miejscami podmokłe, z łąkami i polami.
Jezioro Mikołajskie Roślinność jeziorowa dosyć skąpa. Makrofity
Gmina Mikołajki
wynurzone, reprezentowa-ne przez trzcinÄ™,
Dorzecze Pisa  Narew - Wisła
porastajÄ… wÄ…skim, poprzerywanym pasem brzegi
Wysokość npm 116,1 m
zachodnie i południową część wschodnich.
Powierzchnia jeziora 497,7 ha
Makrofity zanurzone również ubogie, choć
Powierzchnia wysp 1,3 ha
urozmaicone: moczarka, wywłócznik, rogatek,
Głębokość maksymalna 25,9 m
Głębokość średnia 11,2 m
ramienice, rdestnice, tworzą większe skupiska u
Długość maksymalna 5,75 km
wschodnich brzegów.
Szerokość maksymalna 1,6 km
Jezioro Mikołajskie, przed laty sielawowe, obecnie
15,1 km
silnie zeutrofizowane. W pogłowiu ryb dominują
Długość linii
leszcze, sandacze, szczupaki, okonie, niewiele
brzegowej
węgorzy.
Na północno-wschodnim i zachodnim brzegu jeziora Mikołajskiego położone jest miasto
Mikołajki (ok. 5,500 mieszkańców), obecnie centrum wypoczynku, żeglarstwa i sportów wodnych
na szlaku Wielkich Jezior Mazurskich, którego szczególnie dynamiczny rozwój i rozbudowa
nastąpiły w latach 90-tych ub. stulecia.
Ścieki komunalne z miasta Mikołajki podlegają procesowi oczyszczania metodą osadu
czynnego w dwustopniowej oczyszczalni biologicznej. W wyniku oczyszczania ze ścieków
usuwane sÄ… przede wszystkim zanieczyszczenia organiczne w procesie biologicznego utlenienia,
którego produktami końcowymi jest wiele związków mineralnych (m.in. eutrofogenne biogeny
azotu i fosforu). Ścieki oczyszczone odprowadzane są z oczyszczalni do zatoki w południowej
części jeziora Tałty. Zgodnie z kierunkiem przepływu wody południowej części Wielkich Jezior
Mazurskich (północ - południe) ścieki oczyszczone z zatoki jeziora Tałty przemieszczać się mogą
do północnej części jeziora Mikołajskiego i dalej wzdłuż wschodniego jego brzegu w kierunku
jeziora Åšniardwy (Rys. 1 A, B).
3
Plany jeziora i miasta
Plany jeziora i miasta
Rys. 1 A. Północna połowa jeziora Mikołajskiego
Rys. 1 B. Południowa połowa jeziora Mikołajskiego
4
Stacja Hydrobiologiczna
CBE PAN
5
Cel ćwiczeń
Cel ćwiczeń
Celem ćwiczeń jest zbadanie dynamiki różnorodności zmian przestrzennych
(horyzontalnych, wertykalnych) i czasowych wybranych właściwości mikrobiologicznych
(fitoplankton, bakterioplankton, heterotroficzne nanowiciowce) i parametrów fizyczno-
chemicznych środowiska wodnego jeziora Mikołajskiego.
W celu zbadania dynamiki i różnorodności zmian horyzontalnych próbki wody
powierzchniowej pobrane zostanÄ… z 4 stanowisk z jeziora:
1. stanowisko - północna część jeziora, dopływ wód z jeziora Tałty
2. stanowisko - jez. Mikołajskie, ploso, część centralna jeziora
3. stanowisko - jez. Mikołajskie, wypływ do jeziora Śniardwy
4. stanowisko - jez. Mikołajskie, wypływ do jeziora Bełdany
Wertykalna dynamika zmian zmian i różnorodność: próbki wody pobrane zostaną w
miejscu o największej głębokości jeziora (głęboczek) w centralnej jego części z trzech warstw
kolumny wody:
1. warstwa fotyczna
2. górna warstwa profundalu
3. warstwa wody przydennej (1 m nad dnem)
Dynamika zmian czasowych: próbki wody pobrane zostaną w miejscu największej
głębokości jeziora (głęboczek) z dwóch warstw kolumny wody: warstwa powierzchniowa (0-1 m)
oraz przydenna (1 m nad dnem) o różnej porze doby:
1. godz. 6:00
2. godz. 12:00
3. godz. 18:00
We wszystkich pobranych próbkach wody oznaczone zostanie szereg analiz ilościowych i
jakościowych głównych komponentów tworzących mikrobiocenozy jeziorne, zmierzone zostaną
także wybrane procesy aktywności enzymatycznej. Ponadto bezpośrednio w jeziorze określone
zostaną wartości wybranych parametrów fizyko-chemicznych wody in situ (tlen, temperatura,
przewodnictwo elektrochemiczne, pH, mętność wody, autofluorescencja, natężenie światła,
zawartość chlorofilua).
Na zakończenie zajęć eksperymentalnych poszczególne zespoły badawcze przedstawią (w
formie prezentacji komputerowej Power-Point) wyniki pomiarów i analiz próbek wody, podadzą
ich interpretację wraz z przedstawieniem wniosków finalnych i podsumowaniem literaturowym.
6
Plan zajęć
Plan zajęć
GRUPA 1
GRUPA 1
GRUPA 1
Czerwiec (10 - 15) Treść zajęć
1500 - 1900 - przyjazd, zakwaterowanie
Niedziela
1930 - zebranie informacyjne
900 - 1300 - zajęcia
Poniedziałek
1500 > zajęcia
900 - 1300 - zajęcia
Wtorek
1500 > zajęcia
900 - 1300 - zajęcia
Åšroda
1500 > zajęcia
900 - 1300 - zajęcia
Czwartek 1500 > opracowanie wyników,
przygotowanie seminarium
900 - 1100 - SEMINARIUM
PiÄ…tek
1100 - 1200 - wyjazd ze Stacji
Każdego dnia pomiędzy 1300 - 1500 - przerwa obiadowa
7
Plan zajęć
Plan zajęć
GRUPA 2
GRUPA 2
GRUPA 2
Czerwiec (15 - 20) Treść zajęć
1500 - 1900 - przyjazd, zakwaterowanie
PiÄ…tek
1930 - zebranie informacyjne
900 - 1300 - zajęcia
Sobota
1500 > zajęcia
900 - 1300 - zajęcia
Niedziela
1500 > zajęcia
900 - 1300 - zajęcia
Poniedziałek
1500 > zajęcia
900 - 1300 - zajęcia
Wtorek 1500 > opracowanie wyników,
przygotowanie seminarium
900 - 1100 - SEMINARIUM
Åšroda
1100 - 1200 - wyjazd ze Stacji
Każdego dnia pomiędzy 1300 - 1500 - przerwa obiadowa
8
Aktywność enzymatyczna
mikroplanktonu
Uwagi ogólne
Aktywność ektoenzymów (m. inn. fosfatazy alkalicznej, aminopeptydazy, ²- i
ą-glukozydazy, N-acetylo-glukozaminazy), enzymów pozakomórkowych (extracellular
enzymes) oraz niektórych enzymów wewnątrzkomórkowych (m. inn. esterazy i
ureazy) jest, obok szybkości produkcji pierwotnej i wtórnej oraz tempa respiracji,
jednym z podstawowych parametrów charakteryzujących aktywność metaboliczną
mikroplanktonu.
Eksperymentalne określenie aktywności enzymu w wodzie polega na dodaniu
do badanej próbki jednego ze standardowych substratów enzymatycznych i pomiarze
tempa przyrostu w niej stężenia barwnego lub fluoryzującego produktu reakcji
uwalnianego przez badany enzym. Jednakże ze względu na dużą zmienność
fizykochemicznych i biologicznych naturalnych środowisk wodnych, ilości i jakości
enzymów wytwarzanych przez mikroorganizmy wodne, a także na nie zawsze
określone podobieństwo substratu standardowego do substratów naturalnych pomiar
rzeczywistej aktywności określonego enzymu in situ jest niezwykle trudny a czasem
wręcz niewykonalny. Dlatego też w badaniach ekofizjologicznych rutynowo określa
się przede wszystkim tzw. potencjalną aktywność maksymalną enzymu (Vmax).
Wartość ta charakteryzuje maksymalną aktywność enzymu w badanej próbce wody
w określonych warunkach pomiaru i przy całkowitym wysyceniu substratem
dodanym do badanej próbki centrum aktywnych enzymu.
Stężenie substratu wysycające badany enzym w badanej próbce wody jest
zwykle nieznane. Jego doświadczalne wyznaczenie, a przynajmniej oszacowanie, jest
warunkiem koniecznym dla ustalenia prawidłowych warunków pomiaru Vmax.
Zarówno ilość i jakość enzymu jak również pula jego naturalnych substratów
9
podlegają w środowiskach wodnych ciąłym i dynamicznym zmianom. Dlatego też
stężenie substratu konieczne do wysycenia badanego enzymu w próbkach pobranych
z różnych środowisk rzadko bywa podobne. W krańcowych przypadkach, może
wahać się ono nawet o rząd wielkości. W praktyce więc zbyt mała (niewysycająca)
ilość substratu dodanego do badanych próbek przed pomiarem zaniża w sposób
istotny wartość Vmax, zaś duży jego nadmiar może czasami znacząco hamować
aktywność niektórych enzymów.
Dokładne doświadczalne wyznaczenie stężenia standardowego substratu
wysycającego badany enzym umożliwia procedura opisana w rozdziale  Kinetyka
reakcji enzymatycznej .
10
Kinetyka reakcji enzymatycznej
Uwagi ogólne
Zasada pomiaru
Szybkość rozkładu enzymatycznego substratów przez większość enzymów
hydrolitycznych (np. fosfatazy, aminopeptydazy, itp) opisuje równanie Michaelis a-
Menten:
Vmax x [S]
V =
Km + [S]
Zależność opisaną wzorem obrazuje wykres przedstawiony na Rys. 1.
Vmax
60
50 1/2 Vmax
40
30
20
Km
10
0
0 50 100 150 200 250
[s] (µmol/L)
Rys. 1. Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu.
v = szybkość reakcji
11
v (nmol/L/godz)
Vmax = szybkość maksymalna reakcji zachodząca kiedy wszystkie centra
aktywne enzymu zostały wysycone substratem. Vmax zależy of ilości i
aktywności enzymu w badanych próbkach.
stężenie substratu, przy którym zachodzi połowiczna szybkość
Km =
maksymalna reakcji (1/2 Vmax). Km charakteryzuje powinowactwo
enzymu do substratu (im mniejsza wartośc tym większe
powinowactwo). Km nie zależy od ilości badanego enzymu w próbce;
na jego wartość może wpływać szereg warunków fizykochemicznych
środowiska reakcji enzymatycznej (np. obecność stymulatorów i/lub
inhibitorów enzymu)
[S] = stężenie substratu enzymatycznego
Parametry charakteryzujące powyższe równanie wylicza się na podstawie określonej
eksperymentalnie zależności szybkości reakcji enzymatycznej (v) od stężenia
substratu [S] dodanego do badanych próbek.
12
Aktywność L-Leucyno-Aminopeptydazy
Zasada oznaczania
Aktywność L-leucyno-aminopeptydazy może zostać określona z wykorzystaniem
sztucznego substratu L-leucyny-7-amido-4-metylkumaryny (LAMK), którego
hydroliza przez aminopeptydazÄ™ prowadzi do uwolnienia silnie fluorescencyjnego
rodnika 7-amino-metylkumaryny (AMK). FluorescencjÄ™ mierzy siÄ™ przy ekscytacji
380 nm i emisji 440 nm.
L-Leucyno-7-amido-4-metylkumaryna + AMP => L-leucyna + 7-amino-metylkumaryna
(silnie fluorescencyjna)
Odczynniki
1. Substrat: L-Leucyna-7-amido-4-metylkumaryna (LAMK; m.cz. 324.8)
2. Produkt reakcji: 7-amino-metylkumaryna (AMK; m.cz. 175.2)
3. Eter glikolu etylenowego (Cellosolve)
Przygotowanie odczynników i roztworów
1. Standard 10 nM AMK
Rozpuścić 17.52 mg AMK w 10 ml Cellosolve.
2. Roztwór substratu LAMK
Odważyć 16.240 mg L-leucyno-7-amido-4-metylkumaryny i w kolbce 25 ml
rozpuścić w alkoholu etylowym, dopełnić do kreski. 1 ml tak przyrządzonego
roztworu zawiera 2 µM substratu. Po dodaniu 0.1ml tego roztworu do 3.9 ml
próbki finalna koncentracja bÄ™dzie 50 µM.
13
Oznaczenie
Kalibracja
Roztwory kalibracyjne sporzÄ…dza siÄ™ dodajÄ…c do 3.9 ml wody destylowanej 0.1 ml
odpowiedniego stężenia AMK w eterze glikolu etylenowego (Cellosolve) tak aby
ostatecznie uzyskać stężenia 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 20, 50, 100, 200 nM. Roztwór
wyjściowy 2 mM.
Próbki wody
Należy przygotować serię 7-9 probówek i napełnić je 3.9 ml badanej wody. Przy
spektrofluorymetrze, z timerem w ręku, dodawać do kolejnych probówek po 0.1 ml
kolejnych stężeń (LAMK) tak aby uzyskać ostateczne stężenia substratu w próbkach
wynosiÅ‚y 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0 µM. Po dodaniu
substratu natychmiast wymieszać i mierzyć fluorescencję (ekscytacja 336, emisja
444 nm) w czasie T0 (Fp). Po 20 - 90 min. inkubacji w ciemności, z timerem w ręku
mierzyć fluorescencję próbek ponownie (Fb). Wyniki podać jako przyrost stężenia
AMK/godz.
Blank
Blank stanowi fluorescencja AMK (Fb) w badanych próbkach wody, w czasie T0
inkubacji.
Obliczenia
Aktywność aminopeptydazy przy określonym stężeniu substratu (v)wyliczyć wg
14
wzoru:
[(Fp  Fb)  b ] x 60
AMP (nmol/l/godz) =
a x t
Fp = fluorescencja próbki badanej po inkubacji
Fb = fluorescencja próbki badanej w czasie T0 inkubacji
a, b = współczynniki równania regresji liniowej fluorescencji r-rów
kalibracyjnych
t = czas inkubacji (min)
Ponieważ zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu w
badanych próbkach wody ma charakter funkcji hiperboli, aby wyliczyć Vmax i Km
analizuje się równanie regresji nieliniowej zależności v od [S] stosując odpowiedni
program komputerowy (np. Enzfitter, Biosoft). Na podstawie parametrów (Vmax i Km)
charakteryzujących kinetykę enzymatycznej hydrolizy badanych związków
organicznych wylicza się czas potrzebny do całkowitego ich rozkładu w próbkach
wody, tzw. "turnover time" (Tt):
Tt = Km/Vmax
Parametry kinetyczne hydrolizy LAMK przez aminopeptydazÄ™ (Km+Sn oraz Vmax)
mogą zostać określone np. metodą  direct plot z użyciem programu
komputerowego Enzpack (Biosoft, UK).
15
Aktywność alkalicznej fosfatazy (APA)
Zasada oznaczenia
Fosfataza alkaliczna (APA; fosfohydrolaza monoestrów fosforowych; E.C. 3.1.3.1.)
reagujÄ…c z susbtratem sztucznym fosforanem 4-metylumbelliferonu (MUFP)
powoduje jego hydrolizę enzymatyczną uwolniając do środowiska reakcji silnie
fluorescencyjny rodnik (7-metylumbelliferon), którego fluorescencję mierzy się
fluorometrycznie (ekscytacja 365 nm, emisja 460 nm) w środowisku alkalicznym (pH
= 10,2).
APA
4-metylumbelliferyl-PO43- + H2O 4-metylumbelliferon + PO43-
(nie fluorescencyjny) H20 (silnie fluorescencyjny)
Odczynniki
Substrat: 4-metylumbelliferyl-PO43- (MUFP; m.cz. 300.1)
1.
2. Produkt reakcji: 4-metylumbelliferon (MUF; m.cz. 194.2)
3. Eter glikolu etylenowego (Cellosolve)
Przygotowanie odczynników i roztworów
1. Roztwór substratu 0,4 mM MUFP
16
Rozpuścić 24 mg MUFP w 1-2 ml Cellosolve, po całkowitym rozpuszczeniu
roztwór uzupełnić woda destylowaną do objętości końcowej 20 ml.
Uzyskany roztwór rozcieńczyć 10x wodą destylowaną. 1ml tak uzyskanego r-ru
 roboczego zawiera 0,4 µmol MUFP, i po dodaniu 0.1 ml tegoż roztworu do
badanej próbki finalne stężenie MUFP w badanej próbce bÄ™dzie 10.0 µM.
Przygotowany roztwór roboczy, rozcieńczony wodą dejonizowaną użyć do
sporządzenia pozostałych roztworów  roboczych substratu.
2. Standard 20 µM MUF
Rozpuścić 19.4 mg MUF w 10 ml Cellosolve. Rozcieńczyć 5 00x (100x a
nastepnie 5x) wodÄ… dejonizowanÄ…. 1 ml tak przygotowanego roztworu zawiera 20
µmol MUF.
Oznaczenie
Kalibracja
Roztwory kalibracyjne sporzÄ…dza siÄ™ dodajÄ…c do 3.9 ml wody destylowanej 0.1 ml
odpowiedniego stężenia rozcieńczonego woda destylowaną standardu MUF tak, aby
ostatecznie uzyskać stężenia 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 20, 50, 100, 500 nM.
Próbki wody
Należy przygotować serię 7-9 probówek i napełnić je 3.9 ml badanej wody. Przy
spektrofluorymetrze, z timerem w ręku, każdą z probówek uzupełnić 0.1 ml
kolejnego roztworu  roboczego MUFP tak aby ostateczne stężenia substratu w
próbkach wynosiÅ‚y 0.1 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0, µM.
Po dodaniu substratu każdą z próbek natychmiast wymieszać i zmierzyć
fluorescencjÄ™ (ekscytacja 365, emisja 460 nm) w czasie T0 (Fb). Po 0.30 - 60 min.
inkubacji w ciemności, z timerem w ręku mierzyć fluorescencję próbek ponownie
(Fp). Wyniki podać jako przyrost stężenia MUF/godz.
17
Blank
Blank stanowi fluorescencja MUF (Fb) w badanych próbkach wody, w czasie T0
inkubacji.
Obliczenia
Fp = fluorescencja próbki badanej po inkubacji
Fb = fluorescencja próbki kontrolnej po inkubacji
a, b = współczynniki równania regresji liniowej fluorescencji r-rów
kalibracyjnych
t = czas inkubacji (min)
Szybkość reakcji enzymatycznej przy określonym stęzeniu substratu (v) oraz parametry kinetyczne
hydrolizy MUFP przez APA (Km+Sn ,Vmax oraz Tt) określić analogicznie jak w przypadku AMP.
18
Aktywność esteraz (EST)
Zasada oznaczenia
Ektoenzymy typu esteraz to grupa niespecyficznych enzymów hydrolizujących
wiązanie estrowe w szeregu zwiazków organicznych
reagujÄ…c z susbtratem sztucznym dwuoctanem fluoresceiny (FDA) powoduje jego
hydrolizę enzymatyczną uwolniając do środowiska reakcji silnie fluorescencyjną
fluoresceinę, której fluorescencję mierzy się fluorometrycznie (ekscytacja 365 nm,
emisja 460 nm) w środowisku obojetnym (pH = 7,2).
Odczynniki
Substrat: dwuoctan fluoresceiny (FDA; m.cz. 416.38)
1.
2. Produkt reakcji: fluoresceina (m.cz. 332.31)
3. 0.2 M roztwór Tris (m.cz.121.14)
0.2 M HCl (m. Cz. 36,5)
4.
Bufor Tris HCl 0.2 M, pH=7,2
5.
Aceton
6.
19
Przygotowanie odczynników i roztworów
1. Roztwór substratu 0,6 mM FDA
Rozpuścić 24,98 mg FDA w 10m1 acetonu, po całkowitym rozpuszczeniu
uzyskany roztwór rozcieńczyć 10x acetonem aby uzyskać r-r  roboczy FDA o
stęzeniu 0.6 mM. Po dodaniu 0.1 ml tegoż roztworu  roboczego do 3,9 ml próbki
uzyskamy stÄ™zenie finalne FDA w próbce 15.0 µM.Przygotowany roztwór
roboczy, rozcieńczony acetonem użyć do sporządzenia pozostałych roztworów
 roboczych substratu.
2. Standard 4 mM fluoresceiny
Rozpuścić 26.6 mg fluoresceiny w 20 ml acetonu. Rozcieńczyć 200x (100x a
nastepnie 2x) acetonem. 1 ml tak przygotowanego roztworu zawiera 20 µmol
fluoresceiny.
3. Bufor Tris HCl 0.2 M
Do 50 ml 0.2M roztworu Tris dodać, w 100 ml kolbce, 44,2 ml 0.2M HCl. Po
dopełnieniu wodą do 100 ml otrzymuje się bufor o stęzeniu 0,1 M i pH 7,2.
Oznaczenie
Kalibracja
Roztwory kalibracyjne sporzÄ…dza siÄ™ dodajÄ…c do 3.8 ml wody destylowanej 0,1 ml
1M buforu Tris HCl oraz 0.1 ml odpowiedniego stężenia rozcieńczonego acetonem
standardu fluoresceiny tak, aby ostatecznie uzyskać stężenia 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 20,
50, 100, 500 nM.
Próbki wody
Należy przygotować serię 7-9 probówek i napełnić je 3.8 ml badanej wody.
Wszystkie próbki uzupełnic 0.1ml buforu TrisHCl (pH 7.2) Przy
spektrofluorymetrze, z timerem w ręku, dodawać do kolejnych probówek po 0.1 ml
20
kolejnych stężeń substratu (FDA) tak aby jego ostateczne stężenia w próbkach
wynosiÅ‚y 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0 µM. W czasie T0,
natychmiast po dodaniu substratu, próbki wymieszać i zmierzyć ich fluorescencję
(ekscytacja 489, emisja 510 nm). Po 20 - 90 min. inkubacji w ciemności, z timerem w
ręku mierzyć fluorescencję próbek ponownie. Wyniki podać jako przyrost stężenia
fluoresceiny/godz.
Blank
Blank stanowi fluorescencja (Fb) mierzona w badanych próbkach wody, w czasie T0
inkubacji.
Obliczenia
Fp = fluorescencja próbki badanej po inkubacji
Fb = fluorescencja próbki kontrolnej po inkubacji
a, b = współczynniki równania regresji liniowej fluorescencji r-rów
kalibracyjnych
t = czas inkubacji (min)
21