ĆWICZENIE 3
AKTYWNOŚĆ
ENZYMATYCZNA
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UA
Ćwiczenie 3
3. ENZYMY  AKTYWNOŚĆ I CZYNNIKI WPA
YWAJ
CE NA NI

3.1. Podstawy teoretyczne
3.2. Wykonanie ćwiczenia
A. Wykrywanie aktywności pepsyny
Wykonanie ćwiczenia:
·ð Przygotować szereg kilku probówek (minimum 4; maxymalnie 6).
·ð Do jednej z nich odmierzyć 2 ml kwaÅ›nego roztworu kazeiny (w lodówce) i dodać
kilka kropel 10% roztworu AcONa (próba odniesienia).
·ð Do kolejnej probówki odmierzyć: 10 ml kwaÅ›nego roztworu kazeiny i 4 ml preparatu
Citropepsin; wstawić probówkę do łaz
ni wodnej o temperaturze 40°C.
·ð Po dwóch minutach pobrać pipetÄ… 2 ml hydrolizatu z probówki i natychmiast
dodawać kroplami 10% roztwór AcONa. Kolejną (ostatnią) próbę wykonać po 12
minutach lub opcjonalnie jeszcze maxymalnie 2 razy pomiędzy pierwszą i ostatnią.
Zapisać obserwacje w tabeli 1.
Rysunek 1
Przygotowanie sprawozdania (część pierwsza):
·ð WypeÅ‚nić tabelÄ™ 1 z obserwacjami.
·ð Napisać do jakiej klasy enzymów należy pepsyna i jaki proces katalizuje.
50
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UA
Ćwiczenie 3
SPRAWOZDANE (część pierwsza)
Obserwacje:
Tabela 1
Nr probówki
1 2 3 4 5
0 2 & & .. & & .. 12
Wnioski:
51
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UA
Ćwiczenie 3
B. Wykrywanie aktywności inwertazy
Przed przystąpieniem do ćwiczenia B należy przygotować:
Roztwór inwertazy z drożdży: Drożdże świeże (0.5g) rozetrzeć w moz
dzierzu
z piaskiem, dodać 200ml wody destylowanej, następnie przesączyć przez lejek.
Supernatant, zawierający inwertazę, stanowi materiał do ćwiczeń. Można również
wykorzystać roztwór inwertazy przygotowany przez grupę studentów wykonującą
ćwiczenie 4.
Wykonanie ćwiczenia:
·ð Przygotować szereg 6 probówek.
·ð W dwóch probówkach (A, B) umieÅ›cić po 3 ml 0.2 M roztworu sacharozy. Do
probówki B dodać 2 ml 10% roztworu NaOH.
·ð Do czterech kolejnych (1-4) wlać po 3 ml odczynnika Benedicta.
·ð Do pierwszej (1) z nich wlać 0.5 ml 0.2M roztworu sacharozy (próba odniesienia).
·ð Do probówek A i B dodać 4 ml roztworu inwertazy z drożdży.
·ð Po 3 minutach pobrać z probówki A 0.5 ml hydrolizatu i wprowadzić do probówki nr
2. Kolejną porcję hydrolizatu pobrać po 12 minutach i wprowadzić do probówki nr 3.
·ð Po 12 minutach pobrać 0.5 ml hydrolizatu z probówki B i wprowadzić do probówki
nr 4.
·ð Probówki 1-4 ogrzewać 3 minuty we wrzÄ…cej Å‚az
ni wodnej. Zanotować obserwacje
w tabeli 2.
52
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UA
Ćwiczenie 3
Rysunek 2
Przygotowanie sprawozdania (część druga):
·ð WypeÅ‚nić tabelÄ™ 2 z obserwacjami
·ð Do jakiej klasy enzymów należy inwertaza?? Napisz równania zachodzÄ…cych reakcji.
Jeśli reakcja jest  typowym procesem redoks napisz jej bilans jonowo-elektronowy.
W równaniu reakcji zaznaczyć, który produkt był obserwowany podczas
przeprowadzania eksperymentu.
·ð Jaki wpÅ‚yw na aktywność enzymu ma zmiana pH Å›rodowiska?
53
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UA
Ćwiczenie 3
SPRAWOZDANIE (część druga)
Obserwacje:
Tabela 3
Nr probówki
1 2 3 4
0 3 12 12
Wnioski:
54
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UA
Ćwiczenie 3
C. Wykrywanie aktywności ureazy
Przed przystąpieniem do ćwiczenia należy rozetrzeć kilka ziaren soi w moz
dzierzu.
Wykonanie ćwiczenia:
Ziarna soi umieścić w 4 probówkach zgodnie z informacjami zawartymi w Tabeli 3.
Jedną probówkę ogrzewać przez kilka minut nad płaszczem grzejnym następnie
probówkę należy ostudzić. Do wszystkich probówek należy dodać jednocześnie po 5 ml
r-ru mocznika i dodać kilka (3-5) kropli fenoloftaleiny. Obserwuj zmianę intensywności
zabarwienia w czasie. Obserwacje zapisać w Tabeli 3.
Przygotowanie sprawozdania (część trzecia):
·ð Zapisać obserwacje w tabeli 3.
·ð Napisać do jakiej klasy enzymów należy ureaza oraz zapisać równanie katalizowanej
reakcji. Obecność jakich cząsteczek lub jonów jest odpowiedzialna za pojawienie się
zabarwienia roztworu w trakcie przeprowadzania doświadczenia.
·ð Jak na przebieg reakcji enzymatycznej wpÅ‚ynęło rozdrobnienie ziaren i ich prażenie.
Uzasadnij zmiany obserwowane zmiany.
55
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UA
Ćwiczenie 3
SPRAWOZDANIE (część trzecia)
Tabela 3
próba ziarna temp. barwa (intensywność)
30s 20 min 50min
A całe -
B roztarte -
C roztarte prażone
Wnioski:
56
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UA
Ćwiczenie 3
D. Wykrywanie oksydaz, peroksydaz i katalaz
Przed przystąpieniem do ćwiczenia C należy przygotować:
Wyciąg ziemniaczany: umytą i obraną połówkę ziemniaka utrzeć na tarce. Miazgę
umieścić w zlewce z 150 ml wody i łagodnie zamieszać. Roztwór należy przesączyć.
Supernatant stanowi materiał do ćwiczeń. Uwaga!!! Czynności opisane należy wykonać
sprawnie, a do doświadczenia należy stosować świeży roztwór (nie posiadający
ciemnego, brÄ…zowego zabarwienia)
Wyciąg z korzenia chrzanu: wysuszony i starty korzeń chrzanu (lub chrzan dostępny w
sklepie) umieścić w kolbie stożkowej ze szlifem zadać kilkoma ml wody, dokładnie
wytrząsnąć przez kilka minut. Roztwór przesączyć lub zdekantować. Supernatant
stanowi materiał do ćwiczeń.
Wykonanie ćwiczenia:
Należy przygotować zestaw probówek zawierający substancje wymienione
w Tabeli 4. Obserwować zmiany w probówkach w czasie. Należy zwrócić szczególną
uwagę na zmianę zabarwienia w czasie i wydzielające się gazowe produkty. Następnie
zapisać obserwacje w Tabeli 4.
Przygotowanie sprawozdania (część czwarta):
·ð WypeÅ‚nienie tabeli 4.
·ð Do jakich klas lub klasy enzymów należą okzydaza/peroksydaza/katalaza.
Napisz równania katalizowanych reakcji. Jakie produkty były obserwowane
w próbach przeprowadzonych z użyciem fenolu i pirokatechiny (z dodatkiem i
bez dodatku H O )?
2 2
·ð W jaki sposób na szybkość katalizowanej reakcji wpÅ‚ywa budowa substratu
(fenol lub pirokatechina)? Odpowiedz
uzasadnij.
·ð Jaki wpÅ‚yw na przebieg reakcji enzymatycznej ma dodatek Na S?
2
·ð WypeÅ‚nić tabelÄ™ 5.
57
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UA
Ćwiczenie 3
SPRAWOZDANIE (część czwarta)
Obserwacje:
Tabela 4
5ml 10 kropel kilka 10 uwagi obserwacje
kropel kropel
próba wyciąg z fenol Na S H O
2 2 2
A ziemniaka fenol - -
B ziemniaka pirokatechina - -
C ziemniaka fenol - + H O dodać
2 2
natychmiast po
dodaniu fenolu
D ziemniaka pirokatechina - +
E chrzanu fenol - + obserwuj barwÄ™
przed dodaniem
H O
2 2
F chrzanu pirokatechina - +
G ziemniaka - - +
H ziemniaka - + +
58
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UA
Ćwiczenie 3
Wnioski:
59
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UA
Ćwiczenie 3
Wnioski:
Tabela 5
obecny enzym
próba skład mieszaniny reakcyjnej
oksydaza/peroksydaza/katalaza
A
wyciÄ…g z ziemniaka + fenol
B
wyciÄ…g z ziemniaka + pirokatechina
C
wyciÄ…g z ziemniaka + fenol + H O
2 2
D
wyciÄ…g z ziemniaka + pirokatechina +H O
2 2
E
wyciÄ…g z chrzanu + fenol + H O
2 2
F
wyciÄ…g z chrzanu + pirokatechina + H O
2 2
G
wyciÄ…g z ziemniaka + H O
2 2
H
wyciÄ…g z ziemniaka + Na S + H O ----------
2 2 2
Enzymy obecne w wyciÄ…gu z ziemniaka:
Enzymy obecne w wyciÄ…gu z chranu:
60
Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku na Wydziale Chemii UA
Ćwiczenie 3
61