Biochemia dla Biologii nr ETCS
Kwasy nukleinowe cz.I
ZADANIE 3
TYTUA
: KWASY NUKLEINOWE CZ.I
Forma zaliczenia: Kolokwium z części teoretycznej do ćwiczeń oraz praktyczne zaliczenie
ćwiczeń
Materiały i urządzenia:
" Materiały
1. 0,1% roztwór DNA
2. 0,01 M bufor fosforanowy, pH=7,0
3. H2SO4 4M
4. etanol
5. NaOH 2M
6. HCl 2M
7. CuSO4 0,25M
8. nasycony NaHSO3
9. odczynnik Dischego
10. molibdenian amonu
11. reduktor metolowy
" UrzÄ…dzenia
1. probówki
2. palniki
3. zlewki
4. pipety
5. Å‚az
nie wodne
6. papierki lakmusowe
INFORMACJE TEORETYCZNE:.
Kwasy nukleinowe z powodu swojej wielkości tworzą w roztworach wodnych układy
koloidowe, a dzięki dużej zawartości reszt kwasu fosforowego mają odczyn kwasowy.
W efekcie tego dobrze rozpuszczają się w środowisku zasadowym, trudniej w wodzie
i rozcieńczonych kwasach. Silne obniżenie pH roztworu lub dodanie czynników
odwadniających doprowadza do odwracalnego wytrącania kwasów nukleinowych.
Hydrolizę kwasów nukleinowych przeprowadza się w podwyższonej temperaturze
w obecności odpowiednich kwasów, np. kwasu siarkowego, solnego lub nadchlorawego.
W tych warunkach zachodzi rozkład kwasów nukleinowych na podstawowe składniki: zasady
purynowe, zasady pirymidynowe, cukier (pentoza) i kwas fosforowy. W takich warunkach
znacznie łatwiej odszczepiają się zasady purynowe niż pirymidynowe, te ostatnie pozostają
w postaci nukleotydów. Można zastosować wyższą temperaturę, która sprzyja uwolnieniu
zasad pirymidynowych, ale jednocześnie powoduje rozkład zasad purynowych.
W środowisku kwaśnego siarczynu sodu NaHSO3 kationy miedzi (II) Cu2+, ulegają
redukcji do kationów miedzi (I) Cu+, które wytrącają żółtobiały osad nierozpuszczalnych soli
miedzi (I) zasad purynowych.
Reakcja Dischego polega na tworzeniu w środowisku kwaśnym przez 2-deoksyrybozę
z difenyloaminÄ… produktu kondensacji o barwie niebieskiej.
1
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii Przedmiot prowadzony przez KatedrÄ™ Biochemii
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Kwasy nukleinowe cz.I
Jony ortofosforanowe w środowisku kwaśnym reagują z molibdenianem amonu dając
fosforomolibdenian amonu o zabarwieniu żółtym. Jeżeli sól potraktuje się reduktorem,
np. metolem (siarczan metylo-p-aminofenolu) i siarczynem sodu, to następuje redukcja
molibdenianu związanego w soli kompleksowej do niższych tlenków molibdenu
z wytworzeniem błękitu molibdenowego. Reakcja tworzenia się błękitu molibdenowego
stanowi podstawę ilościowego oznaczania fosforu w materiale biologicznym.
Przebieg doświadczenia:
Podzadanie 1: rozpuszczalność kwasów nukleinowych w wodzie
a) Do 1 ml 0,1% roztworu DNA w 0,01M buforze fosforanowym o pH 7 dodać
kroplami 2M HCl. Zapisać obserwację i wyciągnąć odpowiednie wnioski.
b) Do powstałego osadu dodawać stopniowo 2M NaOH. Zapisać obserwację
i wyciągnąć odpowiednie wnioski.
Podzadanie 2: rozpuszczalność kwasów nukleinowych w alkoholu
Do 1 ml 0,1% roztworu DNA w 0,01M buforze fosforanowym dodać 2 ml zimnego
etanolu. Zapisać obserwację i wyciągnąć odpowiednie wnioski.
Podzadanie 3: hydroliza kwaśna kwasów nukleinowych
Do probówki odmierzyć 5 ml 0,1% roztworu DNA w 0,01M buforze
fosforanowym o pH 7. Dodać 5 ml 4M H2SO4. Probówkę wstawić do łaz
ni wodnej
o temperaturze 80°C na 45 minut. Wyjąć, oziÄ™bić i zachować do podzadania nr 4
i 6.
Podzadanie 4: wytrÄ…canie zasad purynowych
8 ml kwaśnego hydrolizatu 0,1% roztworu DNA z podzadania nr 3 zobojętnić 2M
NaOH do odczynu słabo kwaśnego (sprawdzić za pomocą papierka lakmusowego).
Ogrzać do wrzenia, a następnie dodać kilka kropli 0,25M roztworu CuSO4 oraz
ostrożnie kroplami nasycony roztwór NaHSO3. Zapisać obserwację i wyciągnąć
odpowiednie wnioski.
Podzadanie 5: wykrywanie deoksyrybozy - reakcja Dischego
Do 1 ml 0,1% roztworu DNA w 0,01M buforze fosforanowym o pH 7 dodać 2 ml
odczynnika Dischego. Zamieszać i wstawić do wrzącej łaz
ni na 10 minut. Zapisać
obserwację i wyciągnąć odpowiednie wnioski.
Podzadanie 6: wykrywanie deoksyrybozy - reakcja dischego
Do probówki wprowadzić 1 ml kwaśnego hydrolizatu 0,1% roztworu DNA
z podzadania nr 3. Dodać 3 ml roztworu molibdenianu amonu i ogrzać do wrzenia.
Zapisać obserwację i wyciągnąć odpowiednie wnioski. Po oziębieniu probówki
dodać 1 ml reduktora metolowego. Zapisać obserwację i wyciągnąć odpowiednie
wnioski.
2
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii Przedmiot prowadzony przez KatedrÄ™ Biochemii
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Kwasy nukleinowe cz.I
LITERATURA
1. Biochemia , L. Stryer, PWN, Warszawa 1997 i nowsze
2.  Biochemia Harpera , R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 1995 i nowsze
3. Cytobiochemia , L. KÅ‚yszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1995, 2002
4. Biochemia- Krótkie Wykłady , B. D. Hames i wsp., PWN, Warszawa 2002
5. Genomy, Brown., PWN W-wa 2001
6. Genetyka molekularna, Węgleński P, PWN W-wa 1995 i nowsze
7. Ćwiczenia z biochemii , L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1999, 2003
8. Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J wyd. ART. 1997
9. Ćwiczenia z biochemii, Logoń A. wyd. ART. 1997
3
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii Przedmiot prowadzony przez KatedrÄ™ Biochemii