Biochemia dla Biologii nr ETCS
Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek
ZADANIE 1
TYTUA
: REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE AMINOKWASÓW I BIAA
EK
Forma zaliczenia: Kolokwium z części teoretycznej do ćwiczeń oraz praktyczne zaliczenie
ćwiczeń
Materiały i urządzenia:
" Materiały
1. białko jaja kurzego
2. roztwory przykładowych aminokwasów
3. CuSO4 10%
4. NaOH 10%
5. etanol
6. ninhydryna
7. NaNO2 10%
8. CH3COOH 2M
9. stężony kwas azotowy
10. odczynnik Millona
11. Pb(CH3COO)2
12. roztwór nitroprusydku sodu2%
13. stężony HCl
14. kwas mrówkowy 20%
" UrzÄ…dzenia
1. probóki
2. palniki
3. zlewki
4. pipety
INFORMACJE TEORETYCZNE:
Reakcja biuretowa jest charakterystyczna dla wiązań peptydowych w białkach i
peptydach (zbudowanych z co najmniej trzech aminokwasów). Nazwa reakcji wywodzi się od
dajÄ…cego jÄ… zwiÄ…zku o wiÄ…zaniach amidowych - biuretu H2N-CO-NH-CO-NH2. Z wiÄ…zaniami
tego typu jony miedziowe tworzą w środowisku zasadowym kompleksy o barwie fioletowej.
W środowisku zasadowym następuje tautomeryzacja ugrupowania przy wiązaniu
peptydowym, - CO-NH -, z wytworzeniem formy-C(OH)=N-, w której grupa enolowa jest
zdolna do dysocjacji. Z sąsiadującymi ze sobą ugrupowaniami tego typu jon Cu2+może
wytworzyć dwa wiązania jonowe (z grupami enolowymi) i cztery koordynacyjne (z atomami
azotu).
Aminokwasy ogrzewane w środowisku kwaśnym z nadmiarem ninhydryny ulegają
dekarboksylacji i oksydacyjnej deaminacji. W wyniku tego aminokwas przekształca się w
niższy (uboższy o jeden atom węgla w cząsteczce od wyjściowego aminokwasu) aldehyd,
uwalnia się CO2 i wydziela NH3. Równocześnie następuje redukcja ninhydryny. Z kolei
zredukowana ninhydryna wchodzi w reakcjÄ™ z nadmiarem ninhydryny niezredukowanej i
amoniakiem tworzÄ…c zwiÄ…zek o zabarwieniu niebieskim.
Aminokwasy pod działaniem kwasu azotowego (III) przechodzą w hydroksykwasy,
przy czym azot aminokwasu (grupy aminowej) i kwasu azotowego (III) wydziela siÄ™ w
postaci gazowej w ilości 1 cząsteczki na każdą grupę aminową i może być oznaczony
objętościowo:
1
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii Przedmiot prowadzony przez KatedrÄ™ Biochemii
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek
Aminokwasy aromatyczne ulegajÄ… reakcji nitrowania w czasie ogrzewania ze
stężonym kwasem azotowym, dając żółto zabarwione nitrowe pochodne (fenyloalanina
wymaga do nitrowania dodatku H2SO4). Po zalkalizowaniu powstałe związki nitrowe ulegają
redukcji do amin, przyjmując równocześnie zabarwienie pomarańczowe.
Reakcja Millona zachodzi pod wpływem odczynnika Millona, który zawiera w swym
składzie jony rtęciowe (I) i (II), azotowe (III) i (V). Powstające w wyniku reakcji czerwone
zabarwienie pochodzi od kompleksu rtęciowo fenolowo nitrozowego. Reakcję tę daje
zarówno wolna tyrozyna, jak i związana w bialku.
W roztworach alkaliów z grupy tiolowej cysteiny oraz ugrupowania dwusiarczkowego
cystyny odszczepia się siarka, która przechodzi do roztworu w postaci jonów siarczkowych
S2-. Obecność tych jonów można wykryć za pomocą reakcji z roztworem octanu ołowiu (II).
Powstaje wówczas siarczek ołowiu (II), który wytrąca się w postaci czarnego osadu. Reakcję
tę daje zarówno cystyna i cysteina w postaci wolnej, jak i związana w białku.
W przeciwieństwie do cysteiny i cystyny siarka zawarta w cząsteczkach metioniny nie
ulega uwolnieniu w środowisku alkalicznym. Metioninę wykrywa się przy użyciu
nitroprusydku sodu w obecności glicyny. Pojawiające się różowo- brunatne zabarwienie
świadczy obecności metioniny w roztworze.
Reakcje na obecność tryptofanu są charakterystyczne dla występującego w nim układu
indolowego oraz jego reszt zawartych w różnych substancjach białkowych. Związki
zawierające ten układ dają w środowisku stężonych kwasów mineralnych z aldehydami
produkty kondensacji o zabarwieniu fioletowym.
Przebieg doświadczenia:
Podzadanie 1: reakcja na wiÄ…zania peptydowe (reakcja biuretowa)
Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać równą objętość 10% NaOH i parę kropli
1% CuSO4. Należy unikać nadmiaru CuSO4, ponieważ niebieska barwa
wodorotlenku miedziowego maskuje właściwy odczyn. Reakcję powtórzyć dla
dowolnego aminokwasu. Zapisz obserwacjÄ™ i wyciÄ…gnij odpowiednie wnioski.
Podzadanie 2: reakcja ninhydrynowa
Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego i do 1 ml 0,1% roztworu aminokwasu dodać
po 0,5 ml 0,1% roztworu ninhydryny w 50% etanolu. Probówkę ogrzać do wrzenia.
Zapisz obserwacjÄ™ i wyciÄ…gnij odpowiednie wnioski.
Podzadanie 3: reakcja van Slyke a z kwasem azotowym (iii) - dezaminacja
aminokwasów
Do 2 ml 10% NaNO2 dodać 2 ml 2M CH3COOH i 0,5 ml 0,5% roztworu glicyny.
Zapisz obserwacjÄ™ i wyciÄ…gnij odpowiednie wnioski.
Podzadanie 4: reakcja ksantoproteinowa
Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml stężonego kwasu azotowego.
Ogrzać w ciągu 30 sekund. Zaobserwować zmianę zabarwienia roztworu. Po
ostudzeniu wprowadzić w nadmiarze 30% NaOH (lub roztwór stężonego amoniaku
w ilości około 2-3 ml). UWAGA! Reakcja silnie egzotermiczna. Zapisz obserwację
i wyciągnij odpowiednie wnioski. Powtórz doświadczenie dla 0,1% roztworu
tyrozyny.
2
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii Przedmiot prowadzony przez KatedrÄ™ Biochemii
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek
Podzadanie 5: reakcja Millona  wykrywanie tyrozyny
Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli odczynnika Millona i
ostrożnie ogrzać nad płomieniem. Zapisz obserwację i wyciągnij odpowiednie
wnioski. Powtórz doświadczenie dla 0,1% roztworu tyrozyny.
Podzadanie 6: reakcja cystynowa  wykrywanie cysteiny i cystyny
Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml 30% roztworu NaOH i ogrzewać
do wrzenia przez kilka minut. Następnie wprowadzić kilka kropel roztworu
Pb(CH3COO)2 i ponownie ogrzać. Zapisz obserwację i wyciągnij odpowiednie
wnioski.
Podzadanie 7: wykrywanie metioniny metodÄ… mcCarthy- Sullivana
Do 2,5 ml 1% roztworu metioniny dodać 0,5 ml 30% NaOH, 3 krople 2% roztworu
nitroprusydku sodu oraz 0,5 ml 1% roztworu glicyny. Równocześnie w drugiej
probówce wykonać próbę ślepą używając wody destylowanej zamiast metioniny.
Obie probówki umieścić w łaz
ni o temperaturze 60°C i pozostawić na 10 minut.
Następnie oziębić i dodać 2 ml stężonego HCl. Zapisz obserwację i wyciągnij
odpowiednie wnioski.
Podzadanie 8: reakcja Adamkiewicza i Hopkinsa  wykrywanie tryptofanu
Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli 20% kwasu mrówkowego.
Po wymieszaniu, roztwór podwarstwić stężonym roztworem H2SO4. Zapisz
obserwacjÄ™ i wyciÄ…gnij odpowiednie wnioski.
LITERATURA
1. Biochemia , L. Stryer, PWN, Warszawa 1997 i nowsze
2.  Biochemia Harpera , R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 1995 i nowsze
3. Cytobiochemia , L. KÅ‚yszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1995, 2002
4. Biochemia- Krótkie Wykłady , B. D. Hames i wsp., PWN, Warszawa 2002
5.  Naturalne związki organiczne , A. Kołodziejczyk, PWN, Warszawa 2003
6. Biochemia kręgowców , W. Minakowski, S. Weidner, PWN, Warszawa 1998, 2004
7. Ćwiczenia z biochemii , L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1999, 2003
3
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii Przedmiot prowadzony przez KatedrÄ™ Biochemii