Katedra Andrologii i Endokrynologii
Płodności
Dr n. med. Katarzyna Marchlewska
Nasienie
q� plemniki
q� płyn nasienny (plazma nasienia)
- wydzielina pęcherzyków nasiennych (60-70%)
- wydzielina prostaty (ok. 30%)
- wydzielina jąder, najądrzy, gruczołów opuszkowo-cewkowych (5%)
q� komórki okrągłe (leukocyty, komórki spermatogenezy)
q� całkowita liczba plemników  odzwierciedla wydajność produkcji
plemników przez jądra oraz drożność dróg wyprowadzających nasienie
q� całkowita objętość płynu nasiennego  odzwierciedla aktywność
wydzielniczą gruczołów
Warunki wstępne badania nasienia:
q� Informacje dla pacjenta powinny być przekazane ustnie i umieszczone
w formie pisemnej w pokoju przeznaczonym do oddawania nasienia.
q� Do analizy musi być dostarczony cały ejakulat.
q� Wstrzemięz
liwość płciowa  co najmniej 48 h, ale nie dłużej niż 7 dni.
W przypadku powtarzania badania wstrzemięz
liwość płciowa powinna
być taka sama.
q� Badanie powinno być powtórzone przynajmniej dwukrotne w
odstępach nie krótszych niż 7 dni i nie dłuższych niż 3 tygodnie.
Różnice w całkowitej liczebności oraz koncentracji plemników w okresie 1,5 roku
u 5 zdrowych mężczyzn
Warunki wstępne badania nasienia:
q� Badanie powinno być rozpoczęte przeciągu 1 h od ejakulacji.
q� Nasienie powinno być oddawane w specjalnym pomieszczeniu
niedaleko od laboratorium, drogą masturbacji do pojemnika ogrzanego
do temp. 20-37 C
q� W przypadku gdy pacjent nie jest w stanie oddać nasienia drogą
masturbacji możliwe jest użycie specjalnych prezerwatyw
przeznaczonych do tego celu.
q� W przypadku badania mikrobiologicznego pacjent powinien:
�� oddać mocz
�� umyć ręce i penis mydłem
�� dokładnie wypłukać mydło
�� do wytarcia użyć jednorazowego ręcznika
�� oddać ejakulat do jałowego pojemnika
PODSTAWOWE BADANIE NASIENIA:
- Ocena makroskopowa nasienia
- Ocena mikroskopowa preparatów
ETAPY BADANIA NASIENIA
v� Przez pierwsze 5 minut od ejakulacji:
Pojemnik z próbką nasienia umieścić w inkubatorze
(37 C) na okres potrzebny do upłynnienia.
�� upłynnienie ocenić makroskopowo i mikroskopowo
�� w trakcie upłynniania umieścić pojemnik na mieszadle
rotacyjnym (temp. 20-37 C)
�� jeśli próbka nie upłynni się w przeciągu 30 min odczekać z
rozpoczęciem dalszych analiz kolejne 30 min.
ETAPY BADANIA NASIENIA
v�Po 30 nim ale przed upływem 60 minut od
ejakulacji:
- czas upłynnienia
- wygląd/kolor
- lepkość/konsystencja
- objętość
-pH
-preparat bezpośredni (ruchliwość i rozcieńczenie)
-żywotność (w przypadku niskiej ruchliwości)
-rozmaz do morfologii
-ocena liczby
ETAPY BADANIA NASIENIA
v�Po 30 nim ale przed upływem 60 minut od
ejakulacji:
- test MAR (mixed antiglobulin reaction)
- ocena komórek peroksydazo-pozytywnych
- immunobead test (preparat)
- odwirowanie nasienia
v� Przed upływem 3 godzin od ejakulacji:
- przesłanie próbki do badania mikrobiologicznego
v� Póz
niej ale tego samego dnia (lub następnego z
zamrożonej próbki):
- ocena markerów czynności gruczołów dodatkowych
- immunobead test
Upłynnianie nasienia:
Prawidłowe nasienie jest homogenne i upłynnia się w
przeciągu 60 min w temperaturze pokojowej pod wpływem
enzymów pochodzących z prostaty (PSA).
Norma: do 60 min.
(zwykle 15 min.)
�� upłynnienie można ocenić makroskopowo i/lub mikroskopowo
�� w trakcie upłynniania zaleca się umieścić pojemnik na mieszadle rotacyjnym
(temp. 20-37 C)
�� jeśli próbka nie upłynni się w przeciągu 30 min. odczekać z rozpoczęciem
dalszych analiz kolejne 30 min.
Obecność pasm śluzu może utrudniać procedurę liczenia
plemników i sugeruje stan zapalny lub zaburzenia upłynnienia.
Nasienie nieupłynnione:
- dodanie równej objętości PBS w wersji Dulbecco
(Dulbecco s Posphate Buffered Saline) i wymieszanie pipetą
- mechaniczne mieszanie strzykawką z igłą o średnicy wewnętrznej
0.84  0.69 mm
- trawienie roztworem 10 IU/ml bromeliny w Dulbecco-PBS
UWAGA:
Należy odnotować w wyniku użycie określonej metody i
uwzględnić rozcieńczenie przy ocenie liczby plemników
Preparat o dużym stopniu nieupłynnienia
może upośledzać zdolność plemników do
zapłodnienia
Obecność ciałek żelatynowych
Lepkość:
podwyższona lepkość
Długość nitki nie powinna przekroczyć 2 cm
Prawidłowa lepkość
UWAGA
��Preparat o podwyższonej lepkości może utrudniać
- ocenę ruchu
- ocenę koncentracji /całkowitej liczby plemników
- wykrycie plemników opłaszczonych przeciwciałami
- pomiary markerów biochemicznych
W celu zmniejszenia lepkości próbki stosujemy takie same metody
jak przy próbce nasienia nieupłynnionego.
Wygląd / kolor:
Prawidłowe nasienie ma wygląd homogenny, nieprzezroczysty, szaro-opalizujący
Żółta:
Azoo/Oligozoospermia
Hematospermia
żółtaczka, używanie
niektórych witamin np.
z grupy B
Objętość:
Plazma nasienia produkowana jest głównie w gruczołach dodatkowych.
Większość wydzielana jest z pęcherzyków nasiennych a jedynie od 0,5
and 1 ml pochodzi z gruczołu krokowego.
v� Metoda wagowa:
Norma: 1,5 ml
�� Zważyć pojemnik przed oddaniem nasienia i zapisać masę
�� Zważyć pojemnik razem z nasieniem i zapisać masę
�� Obliczyć masę próbki
�� Obliczyć objętość próbki przy założeniu, że gęstość właściwa ejakulatu
wynosi 1 g /ml (1,043-1,102 g/ml)
v� Metoda objętościowa:
�� nasienie może być oddane do specjalnego cylindra
miarowego o szerokim otworze
�� objętość odczytuje się ze skali z dokładnością do 0,1 ml
UWAGA
Ocena objętości nasienia poprzez aspirację próbki nasienia do skalowanej
pipety/strzykawki, lub przelanie do skalowanego cylindra/probówki
nie jest zalecane !!!
Utrata próbki rzędu 0.3  0.9 ml !!!
Niska objętość ejakulatu:
- utrata części próbki
- zablokowanie dróg wyprowadzających nasienie
- wrodzony obustronny brak nasieniowodów (niedorozwój
pęcherzyków nasiennych)
- częściowy wytrysk wsteczny
- niedobór androgenów
Wysoka objętość ejakulatu:
- wysięk w przypadku aktywnego zapalenia gruczołów dodatkowych
pH:
P
CHERZYKI
GRUCZOA
KROKOWY
NASIENNE
Wydzielina kwaśna
Wydzielina zasadowa
Ocenę należy przeprowadzić po
upłynnieniu nasienia ale nie póz
niej
niż 60 min od ejakulacji
Jeśli pH < 7,0 przy azoosprmii może to
oznaczać obustronną niedrożność
nasieniowodów
Wartość referencyjna: 7,2
Zakres papierków wskaz
nikowych : 6.0 do 10.0 lub 6.5 do 10.0
Ocena mikroskopowa preparatów:
Preparat nasienia musi być bardzo dokładnie wymieszany przed
wykonaniem każdej analizy!!
Do mieszania polecana jest jednorazowa pipetka Pasteura o szerokim ujściu
(1,5 mm). Należy delikatnie zaaspirowaś próbkę około 10 razy.
Nie stosować vortexu, ponieważ powoduje uszkodzenia plemników.
q� Wstępna ocena preparatu bezpośredniego (pow. 100x):
" występowanie pasm śluzu
" agregacja lub aglutynacja plemników
" obecność komórek innych niż plemniki tj. leukocytów,
niedojrzałych komórek spermatogenezy, komórek
nabłonkowych
Ocena ruchu plemników:
Kategorie ruchu:
PR - ruch postępowy (niezależnie od szybkości)
Głębokość 20�m
NP - ruch niepostępowy
IM - brak ruchu
10 �l
22 mm
Oceniamy 2 x przynajmniej 200 plemników
Wartość referencyjna:
40% PR + NP lub 32% PR
NP
Ocena ruchliwości:
200
200
PR  30% 50%
NP - 5% 15%
IM - 65% 35%
Średnia = (65+35):2 = 50
Różnica = 65  35 = 30
Wynik do
powtórzenia
200
200
PR  37% 28%
NP - 3% 6%
IM - 60% 66%
Średnia = (60+66):2 = 63
Różnica = 66  60 = 6
Wynik
prawidłowy
PR 32%; NP 4%; IM 63%
Żywotność plemników
��Żywotność plemników  ocena integralności błony komórkowej
powinna zawsze być wykonywana w próbkach nasienia z
nieprawidłowym ruchem plemników (<40% PR), ale może być
wykonywana rutynowo dla każdej próbki nasienia
Żywotność plemników:
- Test eozyna/nigrozyna
- Test eozynowy
- Test wodny (HOS Test)
X 1000
Wartość referencyjna:
58 % plemników żywych
X 400
Ocena:
Oceniamy 2 x przynajmniej 200 plemników
Test eozyna/nigrozyna
- zmieszać po 50 �l nasienia i roztworu eozyna-nigrozyna
- wykonać rozmaz
- oceniać od razu po wyschnięciu, lub póz
niej po zatopieniu w
odpowiednim (bezwodnym) medium, pod imersją (1000x)
Plemniki żywe
Plemniki nieżywe
- główki białe
- główki czerwone
- jasnoróżowe
- ciemnoróżowe
Test eozynowy
- pobrać po 5 �l (lub po 10 �l) nasienia i roztworu eozyny na szkiełko
mikroskopowe, dokładnie wymieszać
-przykryć szkiełkiem nakrywkowym (22x22mm) (lub 24x40 mm)
- po 30 min. oceniać pod powiększeniem 200 lub 400 x (najlepiej w
mikroskopie kontrastującym fazy)
Plemnik nieżywy
- główki czerwone
Plemniki żywe
- ciemnoróżowe
- główki niezabarwione
- jasnoróżowe
Test hipoosmotyczny (HOS test)
- alternatywa do testów barwionych
- używany gdy należy uniknąć barwienia plemników (plemniki do ICSI)
- pobrać po 100 �l nasienia i roztworu hipotonicznego
- inkubować w 37�C przez 5 min (ICSI) lub 30 min (badania nasienia)
- pobrać 10 �l na szkiełko, przykryć szkiełkiem nakrywkowym (22x22
mm) i oceniać pod powiększeniem 200x lub 400x najlepiej w
mikroskopie kontrastującym fazy
Plemnik nieżywy
Plemniki żywe
-brak efektu
- różne typy
puchnięcia witki
puchnięcia witki
komórka
Agregacja  przyleganie (na zasadzie adhezji)
nabłonkowa
nieruchomych plemników do siebie oraz
przyleganie ruchomych plemników do pasm śluzu
ciałka
i innych nieruchomych elementów nasienia
resztkowe
plemniki
Aglutynacja  tworzenie zlepów poprzez przyleganie ruchliwych
plemniki do siebie w charakterystyczny sposób: główka-główka, witka-
witka i mieszany
2  średnia 3  duża
1  izolowana 4  masywna,
Stopień
10  50 > 50
<10 brak wolnych
plemników plemników
plemników plemników
Typ
1 2
3
4
A  główka do główki
B  witka do witki A
(główki wolne)
B
C  koniec witki do
końca witki
C
D  mieszana (razem
głowka-głowka i witka-
D
witka)
E  plątanina (główki i
witki zaplątane; głowki
E
w aglutynacie witek))
Ocena liczby plemników:
Badanie wstępne:
-Określenie właściwego rozcieńczenia (preparat bezpośredni)
4 nl
-Pow. 400x (HPF  high power field)
22 mm
50g NaHCO3+10ml 35% formaliny uzupełnić
wodą dest. do 1000ml
10 �l
1. Określenie właściwego rozcieńczenia
�� korzystamy z preparatu bezpośredniego używanego do oceny ruchu
�� oglądamy jeden z preparatów bezpośrednich
�� oceniamy liczbę plemników w polu widzenia na podstawie
przynajmniej 5 pól mikroskopu (HPF  high power filed; 200x lub 400x)
�� Jedno pole widzenia to zwykle
 ok. 16 nl objętości próbki nasienia przy powiekszeniu 200x
- ok. 4 nl objętości próbki nasienia przy powiększeniu 400x
4 nl
22 mm
10 �l pow. 400x
Kamera Neubauera
3 mm 1 mm
Głębokość 100 �m
4
5
4
25 nl
20 nl
500 plemników
100 plemników
4 nl 100 plemników
20 nl 500 plemników
4 nl
100 nl 2500 plemników
22 mm
Rozcieńczenie:
1:5 (1+4) 100 nl 500 plemników
Liczba plemników
Numery pól do
w polu widzenia Rozcieńczenie
zliczania plemników
(pow. 400x)
1:2
< 2 wszystkie 9 pól
(1 + 1)
1:2
2-15 pole nr 5,4,6
(1 + 1)
1:5
16-100 pole nr 5,4,6
(1 + 4)
1:20
> 101 pole nr 5,4,6
(1 + 19)
C = (N/n) x (1/20) x wsp. rozcieńczenia
N  liczba zliczonych plemników
C = (N/n) x (1/100) x 2
n - liczba rzędów
Przykład:
rozcieńczenie 1+4 (1:5)
C = (N/n) x (1/20) x 5
215
plemników
C = (N/n) x (1/4)
w 6 rzędach
Suma: 215 + 224 = 439
Różnica: 224  215 = 9
224
plemników
w 6 rzędach
C = (215 + 224) /(6 +6) x (1/4)
C = 9,1 x 106 /ml
Postępowanie w przypadku bardzo niskiej liczby plemników
Ok. 4 plemniki
< 1 mln/ml
4 nl
22 mm
< 0,5 mln/ml
Ok. 2 plemniki
rozcieńczenie 1+1 (1:2)
2x
C = (N/n) x (1/100) x 2
C = (N/n) x (1/50)
Gdzie N  liczba zliczonych plemników
n  liczba zliczonych siatek (9+9=18)
Postępowanie w przypadku bardzo niskiej liczby plemników
Jeśli w preparacie przyżyciowym nie znaleziono plemników należy:
�� próbkę odwirować przy 3000g przez 15 min.
�� cały osad rozprowadzić na szkiełku podstawowym
�� przykryć szkiełkiem nakrywkowym (zalecane 20 x 50 mm)
�� oglądać cały preparat w poszukiwaniu plemników.
Pow. 200x
Oceniamy ok.1200 pól widzenia
�� jeśli nie znaleziono żadnego plemnika jest to azoospermia
�� jeśli znaleziono plemniki jest to kryptozoospermia
Budowa morfologiczna plemników:
Norma:
Metody barwienia:
-Papanicolaou
4% o prawidłowej budowie
-Shorr
(Kruger strict criteria)
-Diff-quick
Budowa morfologiczna plemników:
region akrosomalny
40  70% powierzchni główki
Główka  regularny zarys, owalna z wyraz
nie
zaznaczonym akrosomem zajmującym od 40-
szerokość główki
70% powierzchni ; dopuszcza się obecność 2
2.5  3.5 um
długość główki 4  5
małych wakuoli w regionie akrosomalnym,
um
których powierzchnia nie przekracza 20%
szerokość wstawki
powierzchni główki; region postakrosomalny nie poniżej 1 um
długość wstawki
może zawierać wakuoli
ok. 5  7 um
Wstawka  smukła, regularna w zarycie o
podobnej długości jak główka; główna oś
wstawki powinna byś przedłużeniem długiej osi
główki; przywieszka cytoplazmatyczna nie
powinna przekraczać 1/3 wielkości główki
długość witki
ok. 45 um um
Witka  jednakowa grubość na całej długości,
cieńsza od wstawki, długość 45 m (ok. 10
długości główki); może wykazywać wygięcia,
jednak nie pod ostrym kątem sugerującym
złamanie witki
Prawidłowa budowa morfologiczna plemników:
Nieprawidłowości w budowie plemników:
Barwienie Papanicolaou
Komórka nabłonkowa
-
-
-
Makrofag degenerujący?
+
-
-
-
N
-
Granulocyt obojętnochłonny
-
-
Spermatyda
-
+ -
-
-
-
+
-
+
Granulocyt obojętnochłonny
-
Bakterie
spermatocyty
makrofag
cytoplazma
spermatyda
degenerujące
dzieląca się
spermatydy
spermatyda
degenerująca
spermatyda
spermatyda
dzielący się
spermatocyt
dzieląca się
spermatocyt
spermatyda
cytoplazma
fagocytujący
makrofag
monocyt
granulocyty
+
+
+
obojętnochłonne
+
+
+
+
+
+
+
+
+
degenerujący leukocyt
Ocena  komórek okrągłych :
Komórki nabłonkowe cewki moczowej
Komórki prostaty
Komórki spermatogenezy
Leukocyty
Leukocyty:
- neutrofile  50  60 %
- makrofagi  20  30 %
- limfocyty  2  5 %
Immunocytochemiczne barwienie
Komórki preoksydazo-dodatnie
na obecność antygenu CD45
(granulocyty obojętnochłonne)
(wszystkie leukocyty)
Wartości referencyjne w badaniu nasienia
WHO 2010
Objętość ejakulatu 1,5 ml 2 ml
pH 7,2
Koncentracja plemników 15 mln/ml 20 mln/ml
Całkowita liczba plemników 39 mln/ejakulat 40 mln/ejakulat
Ruch plemników 40% kat. PR+NP lub; 32 % kat. PR (WHO 2010)
50% kat. a i b lub; 25 % kat. a (WHO 1999)
Morfologia plemników 4 % o prawidłowej budowie (WHO 2010)
14 % o prawidłowej budowie (WHO 1999)
30 % o prawidłowej budowie (WHO 1992)
Żywotność plemników 58% żywych 50% żywych
1. WHO manual:
https://www.who.int/reproductivehealth/publications/infertility/
2. Cooper T i wsp., Human Reproductive Update, 2009
3. Asian Journal of Andrology, 2010, 12