AMINOKWASY
związki dwufunkcyjne;
H
O
w naturze > 500, kodowane  ok. 20
ą-aminokwas
R C C
100 000 różnych białek
OH
NH2
SYNTETYCZNE
AMINOKWASY (NIENATURALNE)
NIEBIAA
KOWE
NATURALNE
kilkaset
TRZECIORZ
DOWE
modyfikacje
postrybosomalne z
BIAA
KOWE
niepeptydowymi
(kilkadziesiąt)
wiązaniami
kowalencyjnymi
PIERWSZORZ
DOWE
DRUGORZ
DOWE
(kodowane, 20 lub 21)
wynik postrybosomalnej
substraty w syntezie
modyfikacji
rybosomalnej
EGZOGENNE
ENDOGENNE
Inne podziały:
" Ze względu na pozycję grupy aminowej (ą �-, ł
ą-, � ł-& .aminokwasy)
ą � ł
ą � ł
NH2-CHR-(CH2)x-COOH x = 0,1,2& ; rzędowość gr. aminowej;
" glikogenne (przetwarzane w glukozę lub glikogen w przypadku niedoboru
węglowodanów: Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Asp, Glu, Arg, His, Met, Pro), ketogenne (keton
końcowym produktem przemiany np. Leu)
" Alifatyczne, aromatyczne, heterocykliczne&
" Obojętne, kwasowe, zasadowe
AMINOKWASY KODOWANE:
a/ niepolarne, hydrofobowe (łososiowy); b/ polarne nienaładowane (zielony); c/ kwasowe (róż);
d/ zasadowe (niebieski)
1
 2
Aminokwasy:
- niepolarne, hydrofobowe, np.: Leu, Ile, Pro, Val, Ala, Trp, Phe, Met&
- polarne, nienaładowane, np.: Gly, Ser, Asn, Cys, Thr, Tyr&
- kwaśne, np.: Asp, Glu;
- zasadowe, np.: Arg, Lys, His.
20 Aaa kodowanych, 8 Aaa niezbędnych (nie syntezowanych przez dojrzałego człowieka)
21 Aaa  selenocysteina (Sec) NH2-CH-COOH 1986 r.
|
CH2-Se
rekodowanie kodonu terminalnego UGA; Sec bardziej nukleofilowa vs Cys enzymy
3
22 Aaa  L-pyrrolysine
B. Hao, W. Gong, T.K.Ferguson, C.M. James, J.A. Krzycki, M.K. Chan, A new UAG-encoded residue
in the structure of a mathanogen methyltransferase, Science 2002, 296, 1462
X
NH2
O
OH
N
H
O
N
X = OH, NH2,CH3
 Stop codon UAG enzymatycznie reprogramowany do syntezy  pyrrolysine . Nieoczekiwana
różnorodność �! nowe enzymy o znaczeniu przemysłowym.?
Hydroliza białek 24 Aaa (dawniej - 22 Aaa) (kodowane + Cys-Cys + Hyp)
[O]
2RSH
R-S-S-R
[H]
Nomenklatura i symbolika:
- nazwa związana z: pierwszą izolacją [z
ródłem - Asp (łac.  asparagus), Cys (gr.  cystis 
pęcherz], sposobem wyodrębniania (Arg  w post. soli Ag, Trp  prod. degr. trypsyną),
podobieństwem do innych związków (Val  od kw. walerianowego)
- z wyjątkiem Trp, przyrostek  ina lub  yna
- reszty (H2N-CHR-CO-) przyrostek  ylo [glutamylo- (Glu-), aspartylo-, glutaminylo- (Gln-),
asparaginylo-]
- skróty trzyliterowe, konfiguracja węgla ą zawarta w symbolu (L-alanina = Ala, A 
jednoliterowy skrót biochemiczny)
COOH
COOH
H2N H
HO H
R
CH2OH
aldehyd L-glicerynowy
L-aminokwas
(S)-2,3-dihydroksypropanal
- allo-L-izoleucyna  aIle, hydroksylizyna  Hyl, allo-L-hydroksyprolina - aHyp
- norwalina  Nva
- grupa aminowa  A (kw. ą-aminomasłowy  Abu, ą-aminoadypinowy Aad)
dwie grupy aminowe  D (ą, ł-diaminomasłowy  Dbu)
położenia w pozycjach ą i � nie są uwzględniane w nazwie, inne tak (�-Ala)
N-metylowalina  MeVal
WA
AŚCIWOŚCI CHEMICZNE
Aminokwasy są związkami amfoterycznymi, tworzą sole obojnacze.
4
OH
OH
NH3-CHR-COOH NH2-CHR-COO
NH3-CHR-COO
H
H
Ka,1
NH3-CH2-COOH
pKa,1 = 2.4 (wplyw NH3 )
NH3-CH2-COO
Ka,2
pKa,2 = 9.8 (NH3, a nie COOH)
NH2-CH2-COO
NH3-CH2-COO
pKa,2
pKa,1+
= pI
punkt izoelektryczny
2
max. stężenie jonu obojnaczego (minimalny
ładunek)
Gly - pI = � (2.4 + 9.8) = 6.1
pK1 pK2 pK3
NH3-CH-COO NH2-CH-COO
NH3-CH-COOH NH3-CH-COO
3.7 9.6
1.9
CH2COO
CH2COOH
CH2COOH
CH2COO
pI = � (1.9 + 3.7) = 2.8 (Asp)
pK2 pK3
pK1
NH3-CH-COOH H3N-CH-COO NH2-CH-COO NH2-CH-COO
9.0 10.5
2.2
(CH2)4NH3 (CH2)4NH2
(CH2)4NH3 (CH2)4NH3
pI = � (9.0 + 10.5) = 9.7 (Lys)
ŻRÓDA
A AMINOKWASÓW
1. Hydrolizaty białkowe
2. Metody mikrobiologiczne
3. Metody enzymatyczne
" rozdział racemicznych pochodnych Aaa
" synteza asymetryczna
4. Metody syntetyczne produkty achiralne/produkty chiralne
5
SYNTEZA
1. Bromowanie i aminowanie kwasów karboksylowych
Br2 NH3, H2O
CH3CH2COOH CH3CHCOOH CH3CHCOOH
PBr3
Br NH2
80%
(R,S)-Ala, 56%
Małe zastosowanie, zwykle niskie wydajności.
2. Synteza Gabriela (z ftalimidku potasu)
Alkilowanie anionu ftalimidowego (1,2-benzenodikarboksylowego). Czynnik alkilujący  produkt
bromowania malonianu dietylowego.
1. EtO Na, EtOH
2. RX
O
O
O
COOC2H5
COOC2H5
COOC2H5
N K +
HC Br
N CH CR
N
COOC2H5
COOC2H5 COOC2H5
O
O O
ester imidomalonowy
H, T
COOH
O
O
COOH
COOH
COOH
-CO2
NH3-CHR-COO
N CHR
N CR
COOH
O
O
3. Synteza Strecker a
Działanie amoniakiem i cyjanowodorem na aldehydy.
NH2
OH
O
R
-H2O HCN
NH3
R C CN
R C NH2 C NH
R C
H
H
H
H
aminonitryl
H, H2O, T
R-HC-COOH
NH2
4. Redukcyjne aminowanie ą-oksokwasów (laboratoryjny analog biosyntezy)
ą
ą
ą
O
NH3
H
H3C
H3C C COOH C COOH
NaBH4
NH2
kwasą-
ą-
ą-oksopropanowy
ą-
R,S-Ala
(pirogronowy)
6
5. Synteza amidomalonianowa
Najbardziej uniwersalna.
COOEt COOEt
COOEt COOEt
COOEt
COOEt
H3O
H3O
EtONa R-X
EtONa R-X
C COOEt R C COOEt
C COOEt R C COOEt
H C COOEt
H C COOEt
SN2
SN2
NH-CO-CH3 NH-CO-CH3
NH-CO-CH3 NH-CO-CH3
NH-CO-CH3
NH-CO-CH3
H3O
H3O
+ CO2 + 2EtOH + CH3COOH
+ CO2 + 2EtOH + CH3COOH
R-CH-COOH
NH2
6. Syntezy enancjoselektywne (asymetryczne)
Np.:
A. Użycie chiralnych katalizatorów otrzymanych na bazie metali przejściowych:
H
chiralny kompleks Rh
H3C
C COOH
H2C
C COOH
H2
H3COCHN
NHCOCH3
kwas 2-acetyloaminopropenowy
B. Biosynteza  redukcyjne aminowanie ą-oksokwasów:
NH2
O
dehydrogenaza
HOOCCH2CH2CHCOOH
HOOCCH2CH2CCOOH + NH4 + NADPH
glutaminianowa
kwas ą-
ą-
ą-ketoglutarowy
ą-
+ NADP + H2O
(ą-oksoglutarowy)
ą-
ą-
ą-
L-Glu
Escherichia coli  synteza wszystkich kodowanych; człowiek  prócz 9 egzogennych
L-Glu (prekursor) Gln, Pro, Arg
Większość Aaa  grupa ą-aminowa �! Glu
O
NH3
NH3
transaminaza
RCOCOOH +
+ R'CCOOH
R'CHCOO
H C COO
R
7. Rozdział racemicznych aminokwasów:
A. za pomoca deacylaz:
7
COO COOH
Ac2O deacylaza
+
R-CH-COO R-CH-COOH H3N C H H C NHAc
R R
NH3 NHCOCH3
+ CH3COOH
B. z użyciem chiralnych amin - (-)-chinina, (-)-strychnina, (-)brucyna lub kwasu (+) lub (-)
winowego
S-Aaa
sól S,R
COO NH2
COO
H C NH3 H3N C H Ph C H
+
R R
R
R-Aaa
sól R,R
(R)-1-fenyloetyloamina
racemiczny Aaa
C. HPLC z chiralnymi fazami stacjonarnymi (HPLC-CSP)
PEPTYDY
O R' O
H
N-koniec
C CH N C
C-koniec
H2N
CH N C CH OH
H
R O R"
Aaa3
Aaa1 Aaa2
A
ańcuch główny, łańcuchy boczne (R, R , R )
Dipeptyd, tripeptyd&
Sekwencja Aaa w łańcuchu peptydowym:
O
O
H3N-HC-C-NH-CH2-COO
H3N-H2C-C-NH-CH-COO
CH3
CH3
Ala-Gly
Gly-Ala
SYNTEZA W ROZTWORZE
"
Gly + Ala
Gly-Gly + Ala-Gly + Gly-Ala + Gly-Gly-Ala....
- H2O
8
aktywacja
P1Gly + AlaOP2 P1Gly-AlaOP2
HGly-AlaOH
I. Osłona grupy aminowej (gł. grupy uretanowe):
A. Grupa benzyloksykarbonylowa (Z, Cbz):
CH3
CH3
O
O
NaOH
C6H5CH2-O-C-Cl + NH3CHCOO
C6H5CH2-O-C NHCHCOOH
-NaCl
-HOH
Z-Ala
chloromrówczan benzylu
(Z-Cl)
O
H2, Pd
C6H5CH3 + CO2 + NH2-CHRCO-
C6H5CH2-O-C NHCH2RCO--
HBr
C6H5CH2Br + CO2 + NH3-CHR-CO-
B. Grupa tert-butoksykarbonylowa (Boc, BOC)
O
O
O
B
(CH3)3COC NHCHRCOOH
+ (CH3)3CO-C-O- C-O-C(CH3)3
NH3-CHR-COO
-CO2
diwęglan tert-butylowy
-(CH3)3COH
(Boc2O)
Zdejmowanie:
R O
O
HCl lub CF3COOH
+ CO2 + CH2=C(CH3)2
H3NCHC
(CH3)3COC NHCHRCO
C. Grupa fluorenylo-9-metoksykarbonylowa (Fmoc)
R
CH2 O R
NH
+ NH2-CH-COOH
O CNH C COOH
H
x C5H11N
CH2
Fmoc-Aaa
II. Osłona grupy karboksylowej: estry benzylowe, tert-butylowe, metylowe&
OBzl  H2/Pd
OtBu  TFA
OMe  NaOH
9
III. Aktywacja grupy karboksylowej:
Dicykloheksylokarbodiimid DCC, C6H11N=C=N-C6H11
C6H11
N-C6H11 O
NC6H11
N
O
R"-NH2
+
C R-C=O-C R-C-O-C
R C
OH
N
O N
NHC6H11
C6H11
H
C6H11
O
NC6H11
NHC6H11
O
+ O=C
R-C-O-C R-C
NH-R' NHC6H11
NH2 NHC6H11
DCU
R'
Synteza na nośniku stałym (Merrifield a)
O
O
R
+ Cl-CH2-
(CH3)3C-O-C NH-CH-C
OH
R
B
-CH2-
Boc-Aaa1 R
R. Bruce Merrifield  nN 1984 r.
TFA
R3N
Automatyczne syntezatory peptydów  1 Aaa  ok. 1 h
NH2-Aaa1-CH2- R
Synteza rybonukleazy (124 Aaa)  369 reakcji,
12 000 zautomatyzowanych kroków; � = 17%
Boc-Aaa2OH
DCC
(1 etap> 99%)
Boc-Aaa2-Aaa1-CH2- R
Biosynteza  150 Aaa w określonej sekwencji 1 min (!)
TFA
Et3N
Boc-Aaa3OH
DCC
Boc-Aaa3-Aaa2-Aaa1-CH2- R
HF
10
Aaa3-Aaa2-Aaa1-OH R
+ F-CH2-
STRUKTURA POLIPEPTYDÓW /BIAA
EK
Sekwencja Aaa w łańcuchu peptydowym  1� struktura peptydu/białka
Płaski układ wiązania peptydowego/amidowego:
O
R
H
O
R
H
HN C NH
HN C NH
C N C
C N C
H
H
R H
O
R H
O
Sekwencja insuliny wołowej:
Kiedyś  trzustka zabitych zwierząt; teraz  bakterie z genami ludzkiej insuliny.
Aspartam - Asp-Phe-OCH3 Glutation - ł-Glu-Cys-Cys
Płaskość wiązania amidowego, konfiguracja cis, oddziaływania między łańcuchami bocznymi �!
konfiguracja trans
Minimalizowanie oddziaływań sterycznych i maksymalizowanie elektrostatycznych, dyspersyjnych
i wodorowych �!
�!
�!
�!
11
2� Struktura peptydu/białka  lokalna konformacja łańcucha peptydowego
Charakterystyczne typy kształtu łańcucha polipeptydowego
wynikające z oddziaływania niedaleko leżących reszt Aaa �!
X-ray, 2D-NMR
�-Kartki (harmonijka �, pofałdowany arkusz �, �-sheet)  równoległa i antyrównoległa
�
�
�
(np. fibroina jedwabiu)
Wiązania wodorowe między dwoma łańcuchami peptydowymi.
Równoległa �-kartka:
12
Helisy
ą-Helisa, helisa3,613, (np. keratyna włosów) - wewnątrzcząsteczkowe w.wodorowe między C=O
ą
ą
ą
reszty n i NH (n+4); s = 5.4 �)
superhelisa
Lokalizacja reszt w globularnych białkach:
13
1. Reszty z niepolarnymi łańcuchami bocznymi (Val,Leu, Ile, Phe& )  wewnątrz białka,
ograniczony kontakt z wodnym środowiskiem;
2. A
ańcuchy boczne reszt polarnych (Arg, Lys, Glu, Asp)  zwykle na powierzchni;
3. Nienaładowane polarne łańcuchy boczne (Ser, Thr, Trp, Tyr, Asn)  często na powierzchni,
ale także, związane wodorowo - wewnątrz cząsteczki.
Konformacja statystycznego kłębka.
3� Struktura peptydu/białka  struktura trójwymiarowa wynikająca z dalszego fałdowania
łańcucha polipeptydowego.
Białka globularne (np. mioglobina, hemoglobina)  większe fałdowanie (ekspozycja grup
hydrofilowych do środowiska); odpowiedzialne za transport chemiczny i katalizę.
Białka fibrylarne (np. miozyna  mięśnie, fibryna  skrzepy krwi, ą-keratyna - włosy) 
 superhelisa
Trzeciorzędowa struktura enzymów, białek transportujących  miejsce aktywne
Białka: fibrylarne, globularne, membranowe
4� Struktura białka - sposób w jaki kilka łańcuchów polipeptydowych (podjednostki; domeny) łączy
się w agregat.
Denaturacja  zniszczenie 3� struktury białka ( precypitacja, zniszczenie aktywności
katalitycznej& )
14
Określanie struktury 1� (sekwencjonowanie)
I. Oczyszczanie polipeptydów:
1. Dializa;
2. Chromatografia sączenia molekularnego (gel-filtration chromatography);
3. Chromatografia jonowymienna;
4. Elektroforeza (> 1000 białek w 1 eksperymencie!);
5. Chromatografia powinowactwa (affinity chromatography).
II. Badanie składu aminokwasowego: analizator aminokwasów lub MS
Analizator Aaa
a/ hydroliza (6 N HCl, 110 �C, 24 h);
b/ analiza aminokwasowa  kolumna z naładowanym ujemnie nośnikiem, wymywanie
buforami, po elucji  reakcja z ninhydryną.
O
O
O
OH OH
+ NH2CHCOOH
N
H2O
OH
R
O
O
O O
+ CO2
+ R
C
H
Absorbancja = f(t):
III. Sekwencjonowanie tradycyjne:
a/ Ustalanie aminokwasu N-terminalnego:
Degradacja Edman a:
Odczynnik Edmana = tiocyjanian fenylu
O
+ NH2-CH2-C-NH-CH-CO
N C S
CH(CH3)2
S
S
O
C NH
H, H2O
+
Ph-NH-C-NH-CH2-C-NH-CH-CO
N CH2
Ph
C
CH(CH3)2
O
N-fenylotiohydantoina glicyny
PTH(Gly)
1. PhN=C=S
+ NH2-CH-CO
PTH(Val) + skrócony peptyd
2. H, H2O
CH(CH3)2
15
Sekwenatory automatyczne - zwykle do 50 Aaa (nagromadzanie produktów ubocznych)
oznaczanie sekwencji w segmentach, inna hydroliza  oznaczenie ułożenia segmentów.
Trypsyna  hydroliza przy COOH Lys, His
Chymotrypsyna  po Phe, Trp, Tyr
b/ Sekwencjonowanie z użyciem rekombinacyjnej technologii DNA
c/ Oznaczanie reszty C-końcowej:
Inkubacja polipeptydu z karboksypeptydazą. Badania pojawiającego się Aaa. Peptyd z
nowym C-końcem  dalsza degradacja.
Karboksypeptydaza A (trzustka wołowa)  prócz Pro, Arg, Lys
Karboksypeptydaza B (trzustka wieprzowa)  tylko gdy C-terminalna Arg lub Lys
Karboksypeptydaza A + B  wszystkie prócz Pro
Karboksypeptydaza C (liście cytrusów)  wszystkie
Karboksypeptydaza Y (drożdże)  wszystkie
Strategia sekwencjonowania białek:
1. Gdy kilka łańcuchów polipeptydowych  rozdział (ekstremalne pH, 8M mocznik,
chlorowodorek guanidyny& ).
2. Rozerwanie mostków disiarczkowych:
Gdy S-S międzyłańcuchowe 2 1
modyfikacje reaktywnego SH:
16
3. Ustalanie składu aminokwasowego.
4. Identyfikacja reszty C- i N-końcowej (karboksypeptydazy, degradacja Edmana).
5. Hydroliza na mniejsze fragmenty, ustalanie ich sekwencji (trypsyna  po Arg, Lys,
chymotrypsyna  po aromatycznych Aaa, bromocyjan  po Met& ).
lakton homoseryny
CNBr w 70% HCOOH
niestabilny w wodzie
produkt posredni
6. P-kt 5 powtórzony po innej proteolizie, generowanie nakładających się fragmentów.
7. Rekonstruowanie sekwencji na podstawie nakładających się fragmentów/
determinacja sekwencji na podstawie MS.
8. Lokalizacja mostków S-S.
17