Cz.1_ GENETYKA_Laboratorium_2013
Teoria
I. Podłoża mikrobiologiczne.
Podłoże mikrobiologiczne jest to sztucznie stworzone środowisko do hodowli
drobnoustrojów. Zawierają w postaci przyswajalnych związków, pierwiastki uczestniczące w
tworzeniu masy komórkowej. Mikroorganizmy do wzrostu wymagają z
ródła energii i węgla, siarki,
azotu, tlenu, soli mineralnych i czasem tzw. czynników wzrostowych. Czynniki wzrostowe to
substancje odżywcze, takie jak witaminy, aminokwasy czy zasady purynowe i pirymidynowe.
Substancje te wchodzą w skład komórek, ale nie wszystkie organizmy potrafią je syntetyzować.
Organizmy wymagające do wzrostu takich dodatkowych czynników nazywają się
auksotrofami ( np. auksotrof uracylu), w odróżnieniu do prototrofów, które nie są
uzależnione od dodatkowych substancji odżywczych.
Ze względu na skład, podłoża dzielimy na a) minimalne, b) pełne c) wzbogacone.
Podłoża a) minimalne zawierają tylko z
ródło energii, węgla i sole mineralne oraz czasem
pojedyncze czynniki wzrostowe (dla drożdzy jest to np. podłoże SD, syntetic dextrose) . Odmianą
podłoża SD jest tzw. SC, czyli minimalne z dodatkiem mieszaniny aminokwasów, lub bez
określonego czynnika (np. SC-leu, bez leucyny) .
Podłoża b) pełne zawierają wszystkie substancje niezbędne do dobrego wzrostu
drobnoustrojów (z
ródło węgla, azotu, sole mineralne, wiele czynników wzrostowych), (dla drożdży
jest to np. podłoże YPD, yeast peptone-dextrose).
Podłoża wzbogacone stosuje się do hodowli drobnoustrojów słabo rosnących in vitro,
wymagających dodatkowych substancji odżywczych. Jako czynniki wzbogacające podłoża stosuje
się: krew, surowicę, płyny wysiękowe, wyciąg wątrobowy, mleko, żółtko jaj, sok z pomidorów.
Przykładowe pożywki drożdżowe:
Podłoże pełne YPD:
Podłoże minimalne SD:
Bacto-Ekstrakt drożdżowy 10 g
Zestaw soli mineralnych 6,7 g
Bacto-Pepton 20 g
Glukoza 20 g
Glukoza 20 g
Woda destylowana 1000 ml
Agar 20 g
Woda destylowana 1000 ml
PYTANIA
1. Jak nazwiemy szczep który rośnie na podłożu minimalnym
2. Jak nazwiemy szczep który nie potrafi syntetyzować leucyny?
3. Czy wyrośnie on na podłożu a) SD b) Sc-leu, c) YPD d) SD+leu
II. Drożdże Saccharomyces cerevisiae, genetyczny organizm modelowy
Drożdże Saccharomyces cerevisiae są modelowym organizmem eukariotycznym. Cechują się:
niewielkim genomem (zawierającym około 6 tyś. genów), małą liczbą chromosomów, oraz krótkim
1
czasem podziału komórkowego (w warunkach optymalnych 90 min). Są mikroorganizmami łatwymi do
hodowli (można je zamrażać, są niewielkich rozmiarów itp.) i manipulacji genetycznych. Nie formują
grzybni, rozmnażają się wegetatywnie przez pączkowanie. Ogromną zaletą drożdży jest możliwość
utrzymywania ich zarówno jako haplo- bądz
diploidów. Haploidy mogą występować jako dwa typy
kojarzeniowe: a lub ą. Różnią się od siebie genetycznie locus MAT, określającym typ kojarzeniowy.
Występują dwa allele tego locus: MATa i MATą. Szczep MATa kojarzy się ze szczepem MATą poprzez
kompleksowy proces cytoplazmatycznej i jądrowej fuzji dzięki czemu powstaje komórka 2n (a/ą).
Pod względem zmienności typu kojarzeniowego wyróżnia się drożdże stabilne
(heterotalliczne) i niestabilne (homotalliczne). Jest to uzależnione od genu HO, który odpowiada za
zmianę typu kojarzeniowego przy każdym podziale mejotycznym komórki. Naturalnie występujące
szczepy drożdży są diploidalne i mają funkcjonalny allel genu HO, powodujący spontaniczną
zmianę typu kojarzeniowego co każdy podział mitotyczny. Szczepy laboratoryjne mają
zmutowany/wydeletowany gen ho i dzięki temu mogą być utrzymywane jako szczepy o
niezmiennym typie kojarzeniowym. Komórka o stabilnym typie kojarzeniowym dzieląc się
mitotycznie produkuje komórki potomne o takich samych typie kojarzeniowym. Istnienie stabilnej
fazy haploidalnej jest wyjątkowo atrakcyjne dla genetyków ze względu na możliwość izolacji i
identyfikacji szczepów niosących recesywne mutacje. Istnienie stabilnego diploida jest również
bardzo korzystne dla genetyków. Pozwala na określenie recesywności lub dominacji nowej mutacji
lub na przeprowadzenie testu komplementacji (czy szczepy niosące po jednej mutacji niosą allele
tego samego genu czy są to mutacje w różnych genach). Gdy drożdże są wystawione na stres
np. niekorzystne warunki pokarmowych, komórki diploidalne przechodzą mejozę produkując
cztery komórki potomne, zwane askosporami: dwie typu kojarzeniowego a- i dwie typu
kojarzeniowego ą-Askospory tworzą tetradę, która jest zawarta w pojedynczej strukturze
2
zwanej ascus (worek). Gdy przywróci się odpowiednie warunki pokarmowe, każda z tych czterech
askospor wykiełkuje i zacznie się rozmnażać jako haploid.
Rys.1.Schemat cyklu życiowego Sacharomyces cerevisiae.(za F. Sherman)
PYTANIA
1. Podaj przynajmniej dwa powody dla których drożdże są dobrym organizmem a) do
pracy w laboratorium, b) dla genetyków
2. Jakie typy kojarzeniowe mają haploidalne askospory pochodzące z jednej tetrady?
III. Nomenklatura genetyczna
Akceptowane nazewnictwo chromosomalnych genów drożdży S. cerevisiae przedstawia
tabela 1. stosując ARG2 jako przykład. Nazwy genów, alleli lub loci pisane są kursywą.
symbol definicja
MATa Typ kojarzeniowy a
MATa Typ kojarzeniowy alfa
"HO delecja (usunięcie genu HO) kodującego endonukleazę i
umożliwiającego zamianę genów
ARG+ Wszystkie allele typu dzikiego kontrolujące syntezę argininy
ARG2 locus lub dominujący allel w szalku syntezy argininy
arg2 locus lub allel recesywny w szalku syntezy argininy haploidalny
arg2/arg2 locus lub allel recesywny w szalku syntezy argininy diploidalny
arg2-"1 specyficzne całkowite lub częściowe usunięcie arg2
ARG2 :: LEU2 Wprowadzenie funkcjonalnego genu LEU2 w locus ARG2. Gen ARG2
pozostaje działający i dominujący
PYTANIA
1. Co według ciebie oznacza zapis genotypu:
BY: Mata; ADE, his, LEU3, lys2
2. Jak zapisałbyś genotyp szczepu diploidalnego, prototrofa adeniny a auksotrofa
uracylu?
3
IV. Rekombinacja genetyczna i mapowanie mejotyczne (analiza tetrad)
Skutki rekombinacji genetycznej można zaobserwować gdy wśród genotypów potomstwa znajdą
się genotypy inne niż rodziców. Prostym przykładem rekombinacji jest krzyżówka:
F1: AA BB (czyli AB/AB) x aa bb (ab/ab)
Gamety1: AB ab
Zygota AaBb
Gamety 2: typ rodzicielski: rekombinanty:
ab Ab
AB aB
Pełna niezależność dwóch loci jest zapewniona, gdy umieszczone są one na osobnych
chromosomach, są to loci  w pełni nie sprzężone . Im dalej od siebie geny leżą na chromosomach
tym częściej zachodzi między nimi rekombinacja.
Jednostką odległości mapy genetycznej jest centymorgan (cM) liczony wg wzoru poniżej:
liczba rekombinantów
------------------------------------- x 100 = liczba cM
całkowita liczba potomstwa
1 cM to 1% rekombinacji (rekombinantów wśród potomstwa)
50 cM oznacza 50% rekombinacji; zachodzi gdy 2 geny leżą odpowiednio daleko na jednym
chromosomie lub na dwóch chromosomach.
Mapowanie oparte o analizę produktów mejozy jest tradycyjną metodą genetyki klasycznej
określenia kolejności i odległości genów. Drożdże szczególnie dobrze nadają się do zastosowania
tej metody ponieważ cztery haploidalne spory w ascus/worku są produktami jednego wydarzenie
mejotycznego. Genetyczna analiza takich tetrad pozwala na ustalanie wzajemnego położenia
genów obecnych w stanie heterozygotycznym diploidzie. Możliwe jest również mapowanie
położenia genu w stosunku do jego centromeru. W tym przypadku należy użyć krzyżówki
organizmów zawierających gen sprzężony z centromerem oraz drugi leżący w znanej odległości od
niego.
Izolacja czterech spor z ascus jest jednym z trudniejszych technik genetyki drożdży, wymagających
pracy na mikromanipulatorze i dużej praktyki. Analiza tetrad jest rutynowo wykonywana w
większości laboratoriów pracujących z drożdżami. Obecnie stosuje się te technikę nie do
mapowania genetycznego, lecz raczej do określania tempa mutacji odpowiadających za zmiany w
pojedynczym locus, do  tworzenia nowych szczepów i do badania interakcji genów.
Dla szczepu hybrydowego (AB x ab) który jest heterozygotyczny pod względem markerów istnieją
3 typy tetrad: PD (rodziców/parental ditype), NPD (bez rodziców/ nonparental ditype) i T (typ_tetra)
4
jak pokazano na rysunku poniżej. Na podstawie wzajemnego stosunku ilościowego tych tetrad
można wnioskować o sprzężeniach genowych i centromerowych
:
" Jeśli dwa geny są sprzężone to istnieje nadmiar tetrad typu PD w stosunku do NPD.
" Jeśli dwa geny znajdują się na różnych chromosomach, i są sprzężone ze swoimi centromerami
występuje mniejsza proporcja tetrad typu T.
" Jeśli oba geny leżą na różnych chromosomach, ale przynajmniej jeden z nich nie jest sprzężony
ze swoim centromerem, lub geny leżą na jednym chromosomie ale sa daleko od siebie (odległość
większa niż 50cM) to występują losowe proporcje rodzajów tetrad tj. PD: NPD: T wynosi 1: 1: 4.
Rys.2. Różne rodzaje tetrad pochodzących z krzyżowania szczepów AB x ab.
Częstość występowania tetrad typu: PD, NPD, i T mogą być stosowane do określenia odległości na
mapie w cM (centimorgany) między dwoma genami, wyliczanej wg. poniższego wzoru:
PYTANIA
3. Rozrysuj podane krzyżowanie podstawiając jakiś marker troficzny (np. ade 
możliwośc syntezy adeniny, leu  możliwość syntezy leucyny)
4. Jaki genotyp będą miały tetrady każdego z wymienionych typów?
Literatura
1. Schlegel Hans G.  Mikrobiologia ogólna . 1996. Wydawnictwo Naukowe PWN
2. Sherman F. An Introduction to the Genetics and Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae.
1998. Department of Biochemistry and Biophysics. University of Rochester Medical School, Rochester, NY
14642. http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/yeast/Index.html
3. Sherman F., Getting started with yeast, Methods Enzymol. 350, 3-41 (2002).
http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/startedyeast.pdf
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Opracowała: dr Dominika Włoch-Salamon
5
Cz.1_ GENETYKA_Laboratorium_2012
Ćwiczenia praktyczne
Dbaj o swoje miejsce pracy. Pozostaw go tak czystym jak go zastałeś. Jednorazowe
zużyte materiały wyrzuć, a materiały wielokrotnego użytku umyj.
Zadanie nr 1: Oznaczanie genotypu drożdży (wegetatywnych haploidów)
na podłożach selekcyjnych
Podłoża, na których będą przeprowadzane testy to podłoża syntetyczne (Sc-), czyli w pełni
zdefiniowane o dokładnie poznanym składzie, w których brakuje pojedynczego czynnika
wzrostowego, w tym wypadku są to poszczególne aminokwasy. Na takim podłożu mogą rosnąć
tylko te drożdże, które mają sprawny szlak syntezy danego aminokwasu. Gdy szlak ten jest
uszkodzony na jakimś etapie, drożdże na takim podłożu nie rosną i nazywane są aksotrofami tego
poszczególnego nutrientu, np. szczep nie rosnący na podłożu SC-ura to auksotrof uracylu.
Materiały:
- szalki z wyrośniętymi koloniami drożdży o nieznanym genotypie na podłożu pełnym bulionowym
YPD
- szalki z wykonanymi replikami (odbijaniem) na podłożach selekcyjnych
Procedura:
Na podstawie wyników wzrostu kolonii odbitych na szalkach testowych określ genotypy
poszczególnych szczepów drożdży.
Zadanie nr 2: Oznaczanie genotypu askospor na podłożach selekcyjnych
Używając mikromanipulatora można rozdzielić askospory pochodzące z jednej tetrady. Uzyskuje się
w ten sposób haploidy będące produktem mejozy jednej komórki diploidalnej. Podczas tworzenia
spor większość genów segreguje do komórek potomnych wg. praw genetyki mendlowskiej.
Heterozygotyczny marker (np. HIS/his) będzie segregował zgodnie z wzorcem 2:2.(dwia szczepy
potomne są his a dwa HIS). W ten sposób można otrzymać szczepy o nowej kombinacji cech.
Doświadczenie ma na celu określenie genotypów askospor powstałych w wyniku sporulacji
diploidalnego szczepu drożdży, hetoryzygotycznego w każdym locus markerów troficznych oraz
określenie, czy askospory rzeczywiście pochodzą z jednej tetrady.
Materiały:
- szalka z wyrośniętymi koloniami powstałymi w wyniku rozłożenia za pomocą mikromanipulatora
nadtrawionych tetrad na pełnym podłożu YPD
- szalki z wykonanymi replikami na podłożach SC-lys, SC-ade, YPD+nat
Procedura:
Na podstawie wyników wzrostu kolonii odbitych na szalkach testowych określ genotypy
poszczególnych kolonii wyrosłych z pojedynczych askospor i określ na tej podstawie czy dana
tetrada jest tetradą prawdziwą czy fałszywą.
6
Zadanie nr 3: Mapa genetyczna (analiza sprzężeń genowych)
Skrzyżowano dwa szczepy:
Nr 1: haploid Y55 MAT a his4 leu2 lys2 ade1 ura3
nr. 2: haploid Y55 MATą, HIS4 LEU2 LYS2 ADE1 URA3
Otrzymany szczep diploidalny poddano sporulacji. Tetrady spor rozdzielono za pomocą
mikromanipulatora. Otrzymano 4 kolonie haploidalne o różnych genotypach (patrz zadanie 5.)
Celem zadanie jest analiza sprzężeń 2 par genów: leu i his; i ura i lys.
W każdym przypadku oceń ile jest określonych typów tetrad (rodzicielski, nie rodzicielskie, typ-tetra)
w twoim zestawie szalek eksperymentalnych.
Po zebraniu danych ze wszystkich zestawów (praca całej grupy) można zastosować wzór
(podany we wstępie) i oszacować odległość między genami w cM a tym samym czy geny są
sprzężone.
7
MIKROBIOLOGIA _2012 SPRAWOZDANIE
Imię i nazwisko _______________________________________
Data /Numer grupy _______________________________________
Zad.1. Oznaczanie genotypu drożdży wegetatywnych na podłożach selekcyjnych
Nr Zestawu & .. Podaj genotypy
ADE HIS LYS LEU URA
szczep nr 1:
szczep nr 2:
szczep nr 3:
szczep nr 4:
szczep nr 5:
Zad.5. Oznaczanie genotypu askospor na podłożach selekcyjnych.
Nr Zestawu & ..
Podaj genotypy, napisz czy a) tetrada była prawdziwa czy fałszywa i b) dlaczego?
tetrada nr 1 tetrada nr 2
1. 1.
2. 2.
3. 3.
4. 4.
prawdziwa/fałszywa prawdziwa/fałszywa
tetrada nr 3 tetrada nr 4
1. 1.
2. 2.
3. 3.
4. 4.
prawdziwa/fałszywa prawdziwa/fałszywa
tetrada nr 5 tetrada nr 6
1. 1.
2. 2.
3. 3.
4. 4.
prawdziwa/fałszywa prawdziwa/fałszywa
Tetrada jest  fałszywa jeśli& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
8
Zad.3. Mapa genetyczna (analiza sprzężeń genowych) (dla studentów biologii)
Nr Zestawu & ..Podaj rodzaj tetrady (PT, NPT, T,) dla wszystkich prawdziwych tetrad w twoim zestawie
pod względem 2 par genów: LEU i HIS oraz URA/LYS.
Ilości odpowiednich rodzajów tetrad zostaną wypisane w zbiorczej tabeli (na tablicy)
Oceń odległość par genów w cM, oceń czy są sprzężone (uzasadnij wniosek).
tetrada nr 1 tetrada nr 2 tetrada nr 3 tetrada nr 4 tetrada nr 5 tetrada nr 6
1. leu i his
2. ura i lys.
9