B.20. RECESYWNE MUTACJE LETALNE ZWI
ZANE Z PA
CI
U DROSOPHILA
MELANOGASTER
1. METODA
1.1. WST
P
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.2. Definicje
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.3. Substancje kontrolne
Nie sÄ… stosowane.
1.4. Zasada metody badawczej
Badanie recesywnych mutacji letalnych związanych z płcią u Drosophila melanogaster (SLRL) wykrywa
występowanie mutacji zarówno punktowych, jak i małych delecji, w liniach komórek rozrodczych owadów.
Badanie jest testem na mutacje postępowe, który umożliwia wykrycie mutacji w ok. 800 loci na chromosomie X.
Odpowiada to ok. 80% wszystkich loci na chromosomie X. Chromosom X stanowi w przybliżeniu 1/5 całego
genomu haploidalnego.
Mutacje w chromosomie X u Drosophila melanogaster wyrażają się fenotypowo u samców posiadających
zmutowany gen. Kiedy mutacja jest letalna (w warunkach hemizygotycznych) o jej występowaniu świadczy
nieobecność jednej z dwóch klas samców potomnych, zwykle wydawanych przez heterozygotyczne samice.
Badanie SLRL opiera się na wykrywaniu obecności specjalnych markerów i zmienionych chromosomów.
1.5. Kryteria wiarygodności badań
Nie sÄ… stosowane.
1.6. Opis metody
1.6.1. Przygotowanie
1.6.1.1. Zwierzęta
Do badań używa się samców typu dzikiego i samic rasy Muller-5. Można również stosować samice innych ras
z wielokrotnymi inwersjami chromosomu X.
1.6.1.2. Substancja badana
Badane substancje powinny być rozpuszczone w wodzie. Nierozpuszczalne w wodzie substancje mogą być
rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednim nośniku (np. w mieszaninie alkoholu etylowego i Tween 60 lub
80), a następnie przed podaniem rozcieńczone w wodzie lub roztworze soli fizjologicznej. Nie powinno się
stosować dimetylosulfotlenku (DMSO) jako nośnika.
1.6.1.3. Liczba zwierzÄ…t
Badanie powinno być zaplanowane po wcześniejszym określeniu jego czułości i siły. Częstość występowania
mutantów spontanicznych obserwowana w odpowiedniej kontroli wpływa znacząco na liczbę chromosomów,
które muszą być poddane analizie.
1.6.1.4. Droga podania
Substancja może być podana doustnie, przez iniekcję lub przez ekspozycję na gazy lub pary. Karmienie badaną
substancją może odbywać się przez podanie jej w roztworze cukru. W razie konieczności substancje mogą być
rozpuszczane w 0,7% roztworze NaCl i wstrzyknięte do tułowia lub odwłoka.
1.6.1.5. Użycie kontroli dodatnich i ujemnych
218
Do badania powinno się włączyć kontrole dodatnią i ujemną (nośnik). Kontrole takie nie są konieczne, jeżeli
prowadzÄ…ce badania laboratorium dysponuje archiwalnymi wynikami kontroli.
1.6.1.6. Poziomy dawkowania
Powinno się użyć 3 poziomów dawkowania. Do wstępnej oceny można zastosować jeden poziom ekspozycji na
badaną substancję w maksymalnym tolerowanym stężeniu lub w stężeniu wywołującym oznaki toksyczności.
W przypadku substancji nietoksycznych można użyć maksymalnej dawki możliwej do osiągnięcia.
1.6.2. Opis postępowania
Samce typu dzikiego (3-5 dniowe) są poddawane działaniu badanej substancji i indywidualnie kojarzone
z występującymi w nadmiarze dziewiczymi samicami rasy Muller-5 lub z samicami innej rasy z odpowiednimi
markerami (wielokrotnie odwróconymi chromosomami X). Samice są zastępowane nowymi samicami
dziewiczymi co dwa, trzy dni, aby wykorzystać komórki rozrodcze we wszystkich fazach cyklu rozwojowego.
U potomstwa tych samic zlicza się obecność efektów letalnych odpowiadających skutkom działania badanej
substancji na komórki rozrodcze samców w stadium dojrzałych plemników, pośrednich, póz
nych lub wczesnych
spermatyd, spermatocytów i spermatogoniów.
Samice heterozygotyczne F z powyższych krzyżówek są przeznaczone do kojarzenia indywidualnie z braćmi (tj.
1
jedna samica w fiolce). W pokoleniu F każda hodowla jest analizowana pod względem braku samców typu
2
dzikiego. Jeśli okazuje się, że hodowla powstała z samic F przenoszących rodzicielski letalny chromosom X
1
(tzn. nie obserwuje się samców z omawianym chromosomem), powinno się sprawdzić, czy letalność pojawi się u
potomstwa córki tej samicy z takim samym genotypem.
2. WYNIKI
Wyniki powinny być zamieszczone w formie tabel i obejmować liczbę przebadanych chromosomów, liczbę
niepłodnych samców oraz liczbę letalnych chromosomów dla każdego zastosowanego stężenia i każdego okresu
kojarzenia eksponowanego samca. Powinno się przedstawić liczby rojów różnych wielkości w przeliczeniu na
samca. Wyniki te powinny być potwierdzone w oddzielnym eksperymencie.
Przyjmuje się możliwość użycia różnych metod statystycznych przy ocenie wyników badań recesywnych mutacji
letalnych związanych z płcią. Powinno się rozważyć i ocenić przy użyciu odpowiedniej metody statystycznej
mutacje recesywne pochodzÄ…ce od jednego samca.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. Sprawozdanie z badań
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
- rasę: stosowana rasa lub szczep Drosophila, wiek owadów, liczba eksponowanych samców, liczba samców
niepłodnych, liczba ustalonych hodowli F , liczba hodowli F bez potomstwa, liczba chromosomów
2 2
przenoszących mutację letalną wykrywaną w każdym stadium komórek rozrodczych,
- kryteria doboru wielkości grup narażanych,
- warunki doświadczalne: szczegółowy opis sposobu ekspozycji i pobrania materiału do badań, dawki, dane
na temat toksyczności, kontrole dodatnie i ujemne, jeśli je używano,
- kryteria zliczania mutacji letalnych,
- zależność dawka/odpowiedz
, jeżeli istnieje,
- ocenÄ™ statystycznÄ…,
- omówienie wyników,
- interpretację wyników.
3.2. Ocena i interpretacja
Przeprowadza się na podstawie przepisów Wstępu Ogólnego Części B.
219
B.21. TRANSFORMACJA KOMÓREK SSAKÓW IN VITRO
1. METODA
1.1. Wstęp
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.2. Definicje
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.3. Substancje kontrolne
Nie sÄ… stosowane.
1.4. Zasada metody badawczej
W celu wykrycia zmian fenotypowych w komórkach wywoływanych przez związki chemiczne indukujące
złośliwą transormację in vivo, można użyć komórek ssaków hodowanych in vitro. W testach opartych na
wykrywaniu zmian w morfologii komórek, tworzeniu skupisk lub zdolnościach do zakotwiczania w półpłynnym
agarze najczęściej stosuje się komórki C3H10T , 3T3, SHE, komórki szczurów rasy Fisher. Istnieją także
1/2
rzadziej używane metody, wykrywające innego rodzaju zmiany fizjologiczne lub morfologiczne w komórkach
eksponowanych na związki rakotwórcze. Żaden z parametrów ocenianych metodami in vitro nie odpowiada
w sposób bezpośredni mechanizmom powstawania nowotworów. Niektóre z tych metod mogą służyć do
wykrywania związków chemicznych o cechach promotorów. Cytotoksyczność danego związku może być
oznaczona poprzez określenie jego wpływu na zdolności komórek do tworzenia kolonii (zdolność klonowania)
lub na szybkość wzrostu kolonii. Pomiar cytotoksyczności służy potwierdzeniu, że ekspozycja na dany związek
jest uzasadniona pod względem toksykologicznym, ale nie może być użyta do obliczenia częstości transformacji
we wszystkich testach, ponieważ niektóre z nich mogą wymagać przedłużonej inkubacji i/lub przenoszenia na
nowe podłoża.
1.5. Kryteria wiarygodności badań
Nie sÄ… stosowane.
1.6. Opis metody
1.6.1. Przygotowanie
1.6.1.1. Komórki
W zależności od używanego testu transformacji dostępne są różne rodzaje linii komórkowych lub komórek
pierwotnych. Badający musi się upewnić, że komórki testowane wykazują odpowiednie zmiany fenotypowe po
ekspozycji na znany związek rakotwórczy i że używany test w warunkach danego laboratorium posiada
udowodnioną ważność i niezawodność.
1.6.1.2. Podłoże hodowlane
Należy używać odpowiednich podłoży i warunków doświadczalnych do odpowiedniego testu transformacji.
1.6.1.3. Substancja badana
Badana substancja przed ekspozycją komórek może być przygotowana w medium hodowlanym lub rozpuszczona
bÄ…dz
zawieszona w odpowiednim nośniku. Końcowe stężenie nośnika w hodowli nie powinno wpływać na
żywotność komórek, szybkość ich wzrostu lub występowanie transformacji.
1.6.1.4. Aktywacja metaboliczna
220
Komórki powinny być eksponowane na badaną substancję zarówno w obecności, jak i bez odpowiedniego
układu aktywacji metabolicznej. Jeżeli komórki posiadają własną aktywność metaboliczną, jej rodzaj powinien
być znany, aby ją odpowiednio dostosować do grupy chemicznej testowanego związku.
1.6.2. Warunki doświadczalne
1.6.2.1. Użycie kontroli dodatnich i ujemnych
Dla każdego eksperymentu wykonujemy dwie kontrole dodatnie: z użyciem substancji bezpośrednio aktywnej
i związku wymagającego aktywacji metabolicznej. Zastosowany nośnik powinien stanowić kontrolę ujemną.
Przykłady substancji, które mogą być użyte jako kontrola dodatnia:
1) Substancje bezpośrednio aktywne (mutageny bezpośrednie):
- etylometanosulfonian,
- bð-propionolakton;
2) Substancje aktywne po zmetabolizowaniu (mutageny pośrednie):
- 2-acetyloaminofluoren,
- 4-dimetyloaminoazobenzen,
- 7,12-dimetylobenzantracen.
Dodatkowo jako substancja kontrolna dodatnia może być stosowana substancja z tej samej grupy chemicznej, jak
substancja użyta do testowania.
1.6.2.2. Stężenia stosowane w ekspozycji
Powinno się stosować kilka stężeń substancji badanej. Stężenia te powinny spowodować efekt toksyczny zależny
od dawki; najwyższe stężenie powinno wywołać efekt małej przeżywalności komórek, natomiast przeżywalność
komórek w niskim stężeniu powinna być zbliżona do wartości w kontroli ujemnej. Substancje słabo
rozpuszczalne w wodzie powinny być przetestowane w stężeniach, aż do granicy ich rozpuszczalności. Dla
wodnych roztworów substancji nietoksycznej, dobrze rozpuszczalnej, najwyższe stężenie powinno być określone
w zależności od potrzeb.
1.6.3. Opis postępowania
Komórki powinny być eksponowane przez wymagany okres czasu, w zależności od użytego układu
doświadczalnego, czemu może towarzyszyć ponawiana ekspozycja związana z wymianą podłoża (i, jeśli to
konieczne, z wymianą na świeży układ aktywacji metabolicznej), w przypadku jeżeli ekspozycja ta jest
wydłużona. Komórki bez wystarczającej własnej aktywności metabolicznej powinny być eksponowane na daną
substancję zarówno w obecności, jak i bez odpowiedniego układu aktywacji metabolicznej. Po ekspozycji
komórki należy przemyć, usuwając badaną substancję i kontynuować hodowlę w odpowiednich warunkach
mających na celu uwidocznienie zmienionego fenotypu. Następnie należy oznaczyć częstość transformacji.
Wszystkie wyniki muszą być potwierdzone w niezależnym eksperymencie.
2. WYNIKI
Wyniki należy przedstawić w tabelach, które mogą przybrać różną formę w zależności od używanego testu, np.
tabele przedstawiające liczbę płytek, liczbę płytek z wynikami dodatnimi lub liczbę komórek po transformacji.
Jeżeli jest to możliwe, przeżywalność komórek powinna być wyrażona w postaci procentu wartości uzyskanej
w hodowli kontrolnej, a częstość transformacji w postaci liczby komórek po transformacji przypadających na
liczbę komórek żywych. Wyniki należy ocenić przy użyciu odpowiedniej metody statystycznej.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. Sprawozdanie z badań
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
- rodzaj użytych komórek, liczbę hodowli komórkowych, metody utrzymywania hodowli,
- warunki doświadczalne: stężenie badanej substancji, użyty nośnik, czas inkubacji, długość i częstość
ekspozycji, gęstość komórek podczas ekspozycji, rodzaj zastosowanego, egzogennego układu aktywacji
metabolicznej, użyte kontrole dodatnie i ujemne, wyszczególnienie monitorowanego fenotypu, układ
selektywny (jeśli używano), uzasadnienie wyboru dawek,
- metodę zliczania komórek żywych i po transformacji,
221
- ocenÄ™ statystycznÄ…,
- omówienie wyników,
- interpretację wyników.
3.2. Ocena i interpretacja
Przeprowadza się na podstawie przepisów Wstępu Ogólnego Części B.
222
B.22. DOMINUJ
CE MUTACJE LETALNE U GRYZONI
1. METODA
1.1. Wstęp
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.2. Definicje
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.3. Substancje kontrolne
Nie sÄ… stosowane.
1.4. Zasada metody badawczej
Skutkiem dominujących mutacji letalnych jest śmierć zarodków lub płodów. Indukowanie dominującej zmiany
letalnej po ekspozycji na badaną substancję świadczy o oddziaływaniu tej substancji na komórki rozrodcze
badanego gatunku. Ogólnie uważa się, że dominujące mutacje letalne są wynikiem aberracji chromosomowych
(anomalii strukturalnych lub liczbowych), ale nie można również wykluczyć mutacji genowych i efektów
toksycznych.
Zasadniczo na badanÄ… substancjÄ™ eksponuje siÄ™ samce i kojarzy z nieeksponowanymi dziewiczymi samicami.
Różne stadia komórek rozrodczych mogą być badane oddzielnie poprzez zastosowanie przerw w kolejnych
kojarzeniach. Wzrost liczby martwych implantów przypadających na samicę w grupie doświadczalnej
w porównaniu z liczbą martwych implantów w grupie kontrolnej odzwierciedla stratę poimplantacyjną. Strata
przedimplantacyjna może być oszacowana na podstawie liczby ciałek żółtych lub przez porównanie całkowitej
liczby implantów na samicę w grupach doświadczalnych i kontrolnej. Całość efektu dominującej letalności
stanowi suma strat przed i poimplantacyjnych. Liczenie dominujących efektów letalnych jest oparte na
porównaniu liczby żywych implantów przypadających na samicę w grupie doświadczalnej z liczbą żywych
implantów przypadających na samicę w grupie kontrolnej. Spadek liczby implantów w pewnych przedziałach
może być wynikiem uśmiercania komórek (tj. spermatocytów i/lub spermatogonii).
1.5. Kryteria wiarygodności badań
Nie sÄ… stosowane.
1.6. Opis metody
1.6.1. Przygotowanie
Badane substancje powinny być rozpuszczane lub zawieszane w wodzie albo fizjologicznym roztworze soli.
Nierozpuszczalne w wodzie substancje chemiczne mogą być rozpuszczane lub zawieszane w odpowiednim
nośniku. Zastosowany nośnik nie może oddziaływać z badaną substancją ani wywoływać efektów toksycznych.
Powinno się stosować świeże roztwory lub zawiesiny badanej substancji.
1.6.2. Warunki badania
1.6.2.1. Droga podania
Na ogół podaje się badaną substancję jednorazowo. Na podstawie informacji toksykologicznych można
zastosować podanie wielokrotne. Podawanie zwykle odbywa się drogą pokarmową lub dootrzewnowo.
Dopuszczalne jest również podawanie innymi drogami.
1.6.2.2. Zwierzęta doświadczalne
Jako gatunki do badań polecane są szczury i myszy. Do grup doświadczalnych oraz kontrolnych wybierane są
losowo zdrowe, dojrzałe płciowo zwierzęta.
1.6.2.3. Liczba i płeć
223
Powinna zostać użyta odpowiednia liczba samców, biorąc pod uwagę spontaniczną zmienność ocenianych
parametrów biologicznych. Liczba zwierząt powinna być ustalona na podstawie wcześniejszego określenia
czułości wykrywania i znamienności. W typowym doświadczeniu przykładowa liczba samców w każdej z grup
powinna być wystarczająca do uzyskania od 30 do 50 ciężarnych samic w okresie kojarzenia.
1.6.2.4. Użycie kontroli dodatnich i ujemnych
Na ogół do każdego doświadczenia powinno się dołączać równolegle przeprowadzone badane kontrole dodatnie
i ujemne (z użyciem nośnika). Jeżeli w laboratorium są dostępne archiwalne rzetelne dane kontroli dodatniej
z wcześniejszych doświadczeń, to wyniki te mogą być wykorzystane zamiast równoległej kontroli dodatniej.
Substancje w ramach kontroli dodatniej powinny być użyte w odpowiednich, niewielkich dawkach (np.
domięśniowo, dootrzewnowo, w dawce 10 mg/kg m.c.) w celu wykazania pożądanej czułości testu.
1.6.2.5. Poziomy dawkowania
Na ogół stosuje się trzy poziomy dawkowania. Najwyższa dawka powinna powodować wystąpienie objawów
toksyczności lub zmniejszać płodność w grupach narażanych. W niektórych przypadkach wystarczające może
być zastosowanie jednej wysokiej dawki.
1.6.2.6. Badanie wartości dawki granicznej
Substancje nietoksyczne powinny być badane w dawce 5 g/kg po jednorazowym podaniu dootrzewnowym lub
w dawce 1 g/kg/dzień przy podawaniu wielokrotnym.
1.6.3. Opis postępowania
Można zastosować kilka sposobów postępowania. Najczęściej stosuje się jednorazowe podanie badanej
substancji. Dopuszczalne są także inne sposoby podawania.
Poszczególne samce są kojarzone kolejno w odpowiednich, określonych wcześniej odstępach czasu z jedną lub
dwiema dziewiczymi samicami. Samice powinny być pozostawione z samcami na okres co najmniej jednego
cyklu estralnego albo do zapłodnienia, które można określić na podstawie obecności plemników w wymazie
pochwowym albo po stwierdzeniu czopa spermy w pochwie samic.
Liczba kojarzeń po ekspozycji jest podyktowana sposobem eksponowania i powinna zależeć od komórki
rozrodczej we wszystkich fazach cyklu rozwojowego.
Samice są zabijane w drugiej połowie ciąży, a macica jest badana w celu określenia całkowitej liczby implantów
oraz liczby żywych i martwych zarodków. Jajniki mogą być badane w celu określenia liczby ciałek żółtych.
2. WYNIKI
Wyniki powinny być zamieszczone w formie tabel zawierających liczbę samców, liczbę samic ciężarnych
i nieciężarnych. Wyniki każdego kojarzenia obejmujące identyfikację każdego samca i samicy powinny być
przedstawiane oddzielnie. Tydzień kojarzenia, dawki dla samców, liczby żywych i martwych implantów powinny
być przedstawione dla każdej samicy.
Wyliczenie całkowitego efektu dominującej letalności jest oparte na porównaniu liczby żywych implantów
przypadających na samicę w grupach narażanych z liczbą żywych implantów przypadających na samicę w grupie
kontrolnej. W celu określenia strat poimplantacyjnych analizuje się stosunek żywych implantów w grupie
narażanej w odniesieniu do takiego samego stosunku w grupie kontrolnej.
Jeżeli dane odnotowuje się w postaci wczesnych i póz
nych padnięć, należy to jednoznacznie zaznaczyć
w tabelach. Jeśli oceniono straty przedimplantacyjne powinno się to umieścić w sprawozdaniu. Strata
przedimplantacyjna może być obliczona jako różnica między liczbą ciałek żółtych a liczbą implantów lub jako
obniżenie średniej liczby implantów na samicę w porównaniu z grupą kontrolną.
Wyniki ocenia się przy użyciu odpowiedniej metody statystycznej.
224
3. SPRAWOZDANIE
3.1. Sprawozdanie z badań
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
- gatunek i szczep zastosowanych zwierząt, wiek i ciężar zwierząt, liczbę zwierząt każdej płci w grupie
doświadczalnej i kontrolnej,
- dane o badanej substancji, zastosowanym nośniku, dawkach i uzasadnienie ich wyboru, kontrole ujemne
(nośnik) i dodatnie,
- drogÄ™ podania i schemat ekspozycji,
- harmonogram kojarzenia,
- metody określające wystąpienie zapłodnienia,
- czas zabicia,
- kryteria liczenia dominujÄ…cych mutacji letalnych,
- zależność dawka/odpowiedz
, jeżeli wystąpiła,
- ocenÄ™ statystycznÄ…,
- omówienie wyników,
- interpretację wyników.
3.2. Ocena i interpretacja
Przeprowadza się na podstawie przepisów Wstępu Ogólnego Części B.
225
B.23. ABERRACJE CHROMOSOMOWE SPERMATOGONIÓW SSAKÓW
1. METODA
1.1. Wstęp
Badanie in vivo aberracji chromosomów spermatogoniów ssaków ma na celu wskazanie tych substancji, które
wywołują strukturalne aberracje chromosomów w komórkach spermatogoniów u ssaków 1). Istnieją dwa rodzaje
aberracji strukturalnych: chromosomowe i chromatydowe. Większość mutagennych związków chemicznych
wywołuje aberracje typu chromatydowego, chociaż pojawiają się również aberracje typu chromosomowego.
Niniejsza metoda nie została opracowana z myślą o pomiarze aberracji liczbowych i nie jest ona rutynowo
stosowana do tego celu. Mutacje chromosomów i związane z tym zjawiska są przyczyną wielu chorób
genetycznych u ludzi.
Test ten polega na pomiarze zmian chromosomów w komórkach spermatogoniów zarodków i dlatego można go
uznać za wskaz
nik wywoływania dziedzicznych mutacji w komórkach rozrodczych.
Rutynowo test ten przeprowadza siÄ™ na gryzoniach. Za pomocÄ… tego prowadzonego in vivo testu
cytogenetycznego wykrywane są aberracje chromosomów w mitozach spermatogonii. Metoda ta nie obejmuje
innych komórek docelowych.
W celu wykrycia aberracji chromatydowych w komórkach spermatogoniów należy zbadać pierwszy mitotyczny
podział komórek następujący po poddaniu działaniu badanej substancji, zanim uszkodzenia te znikną podczas
kolejnych podziałów komórek. Poddane działaniu badanej substancji potomne komórki spermatogoniów mogą
dostarczyć dodatkowych informacji uzyskanych w wyniku przeprowadzenia analizy chromosomów
mejotycznych na występowanie aberracji chromosomowych w fazie diakinezy metafazy I, kiedy poddane
działaniu badanej substancji komórki stają się spermatocytami.
Ten prowadzony in vivo test został opracowany z myślą o badaniu, czy mutageny komórek somatycznych
oddziałują również na komórki rozrodcze. Ponadto test spermatogoniów służy również do oceny zagrożenia
substancjami mutagennymi, gdyż umożliwia uwzględnienie czynników metabolizmu in vivo, farmakokinetyki
i procesów naprawy DNA.
W jądrze znajduje się wiele generacji spermatogoniów, które cechują się różną wrażliwością na działanie
substancji chemicznych. Dlatego też stwierdzone aberracje można uznać za ogólną reakcję poddanej działaniu
badanej substancji populacji komórek spermatogonii, w której przeważają zróżnicowane komórki
spermatogoniów. Zależnie od ich umiejscowienia w obrębie jądra różne generacje spermatogoniów mogą zostać
włączone lub nie do ogólnego obiegu, ze względu na fizyczną i fizjologiczną barierę komórek Sertoliego, barierę
krwiobiegu i ścianek jąder.
Metody tej nie należy stosować wtedy, jeżeli istnieją dowody na to, że badana substancja lub jej czynny
metabolit nie osiÄ…gnie tkanki krytycznej.
1.2. Definicje
1. Aberracja typu chromatydowego strukturalne uszkodzenie chromosomu wyrażone jako rozerwanie
pojedynczych chromatyd lub rozerwanie i ponowne połączenie chromatyd.
2. Aberracja typu chromosomowego strukturalne uszkodzenie chromosomu wyrażone jako rozerwanie lub
rozerwanie i ponowne połączenie obydwu chromatyd w tym samym miejscu.
3. Endoreduplikacja proces, w którym po upływie okresu S replikacji DNA jądro nie przechodzi mitozy, lecz
rozpoczyna następny okres S. W wyniku tego procesu powstają chromosomy zawierające 4, 8, 16 chromatyd.
4. Przerwa niebarwiący się obszar uszkodzenia węższy niż jedna chromatyda z bardzo niewielkim zaburzeniem
liniowości chromatyd.
5. Indeks mitotyczny stosunek liczby komórek znajdujących się w metafazie do całkowitej liczby komórek
badanych w populacji komórek; wskaz
nik stopnia proliferacji danej populacji.
6. Aberracja liczbowa zmiana liczby chromosomów w porównaniu z normalną liczbą charakterystyczną dla
badanych komórek.
7. Poliploidalność wielokrotność liczby chromosomów haploidalnych (n) niebędąca liczbą chromosomów
diploidalnych (np. 3n, 4n itd.).
8. Aberracja strukturalna: zmiana struktury chromosomu wykrywalna w badaniu mikroskopowym podczas
okresu metafazy podziału komórkowego i obserwowana w postaci utraty części chromosomu, fragmentów
chromosomów, wymian fragmentów wewnątrz tego samego chromosomu lub pomiędzy chromosomami.
1 )
Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial
Chromosomes, Mutation Res., 52, pp. 207-209.
226
1.3. Zasada metody badań
Zwierzęta poddawane są działaniu badanej substancji z zachowaniem odpowiedniej drogi ekspozycji, a następnie
uśmiercane po upływie odpowiedniego czasu od chwili jej zakończenia. Przed uśmierceniem zwierzęta
poddawane sÄ… dziaÅ‚aniu czynnika zatrzymujÄ…cego metafazÄ™ (np. Colcemid® lub Kolchicyna). NastÄ™pnie
preparaty z komórek rozrodczych są barwione, a komórki w fazie metafazy analizuje się na obecność aberracji
chromosomów.
1.4. Opis metody badania
1.4.1. Przygotowanie
1.4.1.1. Wybór gatunku zwierząt
Zazwyczaj badanie prowadzone jest na samcach świnki morskiej lub myszy, jednak mogą być stosowane samce
innych odpowiednich gatunków ssaków. Należy stosować zdrowe młode osobniki powszechnie przyjętych
szczepów laboratoryjnych. W chwili rozpoczęcia badania zróżnicowanie zwierząt pod względem wagi nie
powinno przekraczać ą20% średniej wagi.
1.4.1.2. Warunki hodowli i karmienia
Należy stosować się do warunków ogólnych, o których mowa we Wstępie Ogólnym do Części B, przy czym
docelowa wilgotność powinna wynosić 50-60%.
1.4.1.3. Przygotowanie zwierzÄ…t
Młode zdrowe samce są losowo wybierane do grup kontrolnych i badanych. Klatki należy ustawić w taki sposób,
by do minimum ograniczyć skutki wynikające z ich ustawienia. Zwierzęta znakuje się w sposób umożliwiający
identyfikację każdego osobnika. Czas aklimatyzacji zwierząt do warunków laboratoryjnych powinien wynosić co
najmniej pięć dni.
1.4.1.4. Przygotowanie substancji
Badane substancje w postaci stałej należy rozpuścić lub sporządzić ich zawiesinę w odpowiednich
rozpuszczalnikach lub innym medium, odpowiednio rozcieńczyć przed poddaniem zwierząt ich działaniu. Płynne
badane substancje można podawać zwierzętom bezpośrednio lub rozcieńczyć przed podaniem. Należy stosować
świeże preparaty badanej substancji, chyba że dane o ich stabilności wskazują na dopuszczalność ich
przechowywania.
1.4.2. Warunki testu
1.4.2.1. Rozpuszczalnik/nośnik
Rozpuszczalnik/nośnik nie może wywoływać efektów toksycznych przy stosowanych poziomach dawek i nie
może być wchodzić w reakcję chemiczną z badaną substancją. Jeżeli charakterystyka stosowanego
rozpuszczalnika/nośnika nie jest dobrze znana, to decyzja o jego zastosowaniu powinna opierać się na danych
wskazujących na możliwość ich zamiany. Zaleca się, by woda była stosowana jako rozpuszczalnik/nośnik
w pierwszej kolejności. W przypadku badania substancji wykazujących niestabilność w kontakcie z wodą należy
stosować bezwodne rozpuszczalniki organiczne.
227
1.4.2.2. Kontrole
W każdym badaniu należy prowadzić jednoczesną kontrolę pozytywną i negatywną
(z rozpuszczalnikiem/nośnikiem). Zwierzęta z grup kontrolnych (nienarażane na badaną substancję) powinny być
traktowane w sposób identyczny jak zwierzęta badane.
Kontrole pozytywne powinny wykazywać w komórkach spermatogoniów aberracje strukturalne in vivo przy
takich stężeniach ekspozycji, które dają wykrywalny wzrost aberracji w porównaniu z tłem.
Dawki stosowane w kontroli pozytywnej należy dobrać tak, aby wyniki były wyraz
ne, przy czym nie powinny
one umożliwiać natychmiastowej identyfikacji zakodowanych preparatów przez osobę dokonującą odczytu.
Dopuszczalne jest prowadzenie kontroli pozytywnej przy zachowaniu innej drogi podania, niż w przypadku
badanej substancji, przy czym próbki należy pobierać tylko jednorazowo. Można rozważyć celowość
zastosowania dostępnych związków chemicznych z grupy podobnej do związków stosowanych do kontroli
pozytywnej. Substancje stosowane w kontroli pozytywnej obejmują przykładowo:
Substancja Nr CAS Nr EINECS
Cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4
monohydrat cyklofosfamidu 6055-19-2
Cykloheksylamina 108-91-8 203-629-0
Mitomycyna C 50-07-7 200-008-6
Akryloamid monomeryczny 79-06-1 201-173-7
Trójetylenomelamina 51-18-3 200-083-5
Próbki kontroli negatywnych, poddawane działaniu jedynie rozpuszczalnika/nośnika, a poza tym traktowane
w sposób identyczny jak grupy poddane działaniu substancji, muszą być pobierane w każdym terminie
pobierania próbek, chyba że dostępne dane archiwalne wskazują na dopuszczalny poziom zmienności
i częstotliwości występowania aberracji chromosomów wśród zwierząt. Ponadto należy również stosować
badanie grupy kontrolnej, chyba że istnieją dane archiwalne lub dane opublikowane, które dowodzą braku
działania mutagennego lub delecyjnego ze strony wybranego rozpuszczalnika/nośnika.
1.5. Sposób postępowania
1.5.1. Liczba zwierzÄ…t
Każda grupa badana i kontrolna powinna obejmować co najmniej pięć analizowanych samców.
1.5.2. Harmonogram podawania badanej substancji
Wskazane jest podawanie badanych substancji jednorazowo lub dwukrotnie (zwierzęta są poddawane raz lub
dwa razy działaniu badanej substancji). Badane substancje można również podawać w dawce podzielonej, to jest
dwa razy dziennie w odstępie nieprzekraczającym kilka godzin, aby ułatwić podawanie materiału o dużej
objętości. Inne sposoby dawkowania należy naukowo uzasadnić.
W grupie otrzymującej najwyższą dawkę stosowane są dwa terminy pobierania próbek po zakończeniu
ekspozycji. Badana substancja może wpływać na dynamikę cyklu komórkowego, dlatego należy stosować dwa
terminy pobierania próbek: wcześniejszy po upływie 24 godzin od zakończenia ekspozycji i póz
niejszy po
upływie 48 godzin. Dla innych dawek należy przyjąć termin pobierania próbek wynoszący 24 godziny lub równy
1,5 czasu trwania normalnego cyklu komórkowego od chwili podania badanej substancji, chyba że wskazany jest
inny termin pobierania próbek w celu wykrycia skutków jej działania 1).
Można również stosować inne terminy pobierania próbek. Przykładowo, w przypadku substancji, które mogą
wywołać opóz
nienie chromosomów lub, które mogą wywoływać skutki niezależne od fazy S, wskazane może
okazać się przyjęcie wcześniejszych terminów pobierania próbek 2).
Zasadność powtórzonego podawania badanej substancji musi być każdorazowo potwierdzona. W przypadku
powtórnego podania badanej substancji zwierzęta należy zabić po upływie 24 godzin (1,5 czasu trwania cyklu
komórkowego) po ostatnim terminie podania badanej substancji. W razie potrzeby można również stosować
dodatkowe terminy pobierania próbek.
1 )
Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N.
(1994), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the
Working Group on Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, pp. 313- 318.
2 )
Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their
Cell-Cycle Specifications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and
Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, pp. 477-484.
228
Zwierzętom, przed uśmierceniem, wstrzykiwany jest dootrzewnowo w odpowiedniej dawce środek
powstrzymujÄ…cy metafazÄ™ (np. Colcemid® lub Kolchicyna), po czym sÄ… pobierane próbki w odpowiednich
odstępach czasu. W przypadku myszy ten odstęp czasu wynosi około 3-5 godzin, a w dla świnek morskich jest on
równy w przybliżeniu 4-5 godzin.
1.5.3. Poziomy dawkowania
Jeżeli badanie z powodu braku odpowiednich danych ma na celu określenie wielkości dawek, to należy je
przeprowadzić w tym samym laboratorium z zastosowaniem takich samych gatunków, szczepów i płci zwierząt
oraz sposobu narażenia, jak w badaniu głównym 1). W przypadku toksyczności stosowane są trzy poziomy dawek
dla pierwszego terminu pobierania próbek. Wspomniane trzy poziomy dawek powinny obejmować zakres od
wywołujących maksymalną do niewielkiej toksyczności a nawet do jej braku. W przypadku póz
niejszego terminu
pobierania próbek stosowana jest tylko dawka największa. Najwyższa dawka definiowana jest jako dawka, przy
której występują objawy zatrucia, można przy nich również oczekiwać śmierci.
Substancje wykazujące określoną aktywność biologiczną przy dawkach nietoksycznych (takie jak hormony
i mitogeny) mogą stanowić wyjątki w odniesieniu do kryteriów ustalania dawek i powinny w każdym przypadku
zostać poddane ocenie indywidualnej. Najwyższą dawkę można również zdefiniować jako dawkę, która
powoduje wystąpienie pewnych objawów toksyczności w komórkach spermatogonii (np. zmniejszenie wartości
stosunku mitoz spermatogonii do pierwszej i drugiej metafazy mejozy nie powinno przekraczać 50%).
1.5.4. Badanie wartości dawki granicznej
Pełne badanie z zastosowaniem trzech poziomów można uznać za niepotrzebne, jeżeli jedna dawka o poziomie
równym co najmniej 2000 mg/kg wagi ciała, podawana jednorazowo lub podzielona na dwie dawki podane
w tym samym dniu, nie wywołuje efektów toksycznych, a dane uzyskane przy zastosowaniu substancji
o pokrewnej budowie nie wskazują na możliwość wystąpienia genotoksyczności. Przewidywana ekspozycja ludzi
może powodować potrzebę zastosowania w badaniu granicznym wyższego poziomu dawki.
1.5.5. Dawkowanie
Badana substancja jest zazwyczaj podawana przez sondę żołądkową lub odpowiednią rurkę intubacyjną bądz
też
za pomocą iniekcji dootrzewnowej. Dopuszczalne jest również stosowanie innych dróg ekspozycji, jednak należy
to uzasadnić. Maksymalna objętość płynu, którą jednorazowo można podać zgłębnikiem lub poprzez iniekcję,
jest uzależniona od wielkości badanego zwierzęcia. Objętość ta nie powinna przekraczać 2 cm3/100 g masy ciała.
Stosowanie większych objętości musi być uzasadnione. Z wyjątkiem substancji żrących lub wywołujących
podrażnienie, które z reguły powodują obostrzenie objawów przy wyższych stężeniach, zmienność badanej
objętości należy ograniczyć do minimum poprzez dobór stężenia zapewniający stałą objętość przy wszystkich
poziomach dawek.
1.5.6. Preparatyka chromosomów
Natychmiast po uśmierceniu zwierzęcia pobierana jest zawiesina komórek z jednego lub z obydwu jąder, która
poddawana jest działaniu roztworu hipotonicznego, a następnie utrwalana, po czym komórki przenoszone są na
szkiełka i barwione.
1.5.7. Analiza
Dla każdego zwierzęcia należy przeanalizować co najmniej 100 dobrze rozwiniętych metafaz (czyli minimum
500 metafaz dla każdej grupy). Ilość ta może zostać zmniejszona w przypadku stwierdzenia dużej liczby
aberracji. Wszystkie preparaty, w tym również pochodzące z kontroli pozytywnej i negatywnej, powinny zostać
niezależnie zakodowane przed przystąpieniem do analizy mikroskopowej. Procedury utrwalania preparatów
często powodują rozerwanie części metafaz, co prowadzi do utraty chromosomów, dlatego zliczone komórki
powinny cechować się liczbą centromerów równą liczbie 2ną2.
2. WYNIKI
2.1. Opracowanie wyników
1 )
Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, i., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-
Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. i. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK
Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis,
7, pp. 313-319.
229
Dane dotyczące poszczególnych zwierząt należy przedstawić w formie tabelarycznej. Jednostką doświadczalną
jest zwierzę. Dla każdego zwierzęcia należy podać liczbę komórek ze strukturalnymi aberracjami chromosomów
oraz liczbę aberracji w przeliczeniu na jedną komórkę. Należy przedstawić wykaz rodzajów strukturalnych
aberracji chromosomów z podaniem ich liczby oraz częstości występowania w grupach poddanych działaniu
badanej substancji i w grupach kontrolnych.
W przypadku stwierdzenia mitoz i mejoz, należy określić stosunek mitoz spermatogoniów do pierwszej i drugiej
metafazy mejozy jako wskaz
nik cytotoksyczności dla wszystkich zwierząt poddanych działaniu badanej
substancji i kontroli negatywnej w łącznej próbce 100 dzielących się komórek dla jednego zwierzęcia, w celu
określenia możliwego działania cytotoksycznego. W przypadku stwierdzenia samych mitoz, należy określić
wartość wskaz
nika mitotycznego dla przynajmniej 1000 komórek każdego zwierzęcia.
2.2. Ocena i interpretacja wyników
Istnieje wiele kryteriów określania wyniku pozytywnego, takich jak powiązany ze stężeniem wzrost liczby
komórek z aberracjami chromosomów lub wyraz
ne zwiększenie liczby komórek z aberracjami w grupie poddanej
działaniu jednej dawki przy jednorazowym pobraniu próbek. W pierwszej kolejności należy ocenić istotność
wyników pod względem biologicznym. Metody statystyczne można zastosować jako narzędzie pomocnicze przy
ocenie wyników badań 1). Istotność statystyczna nie powinna być jedynym czynnikiem decydującym
o stwierdzeniu pozytywnej reakcji. Wyniki niejednoznaczne należy wyjaśnić za pomocą dalszych badań, przy
czym zalecana jest modyfikacja warunków przeprowadzenia eksperymentu.
Badana substancja, dla której wyniki nie spełniają powyższych kryteriów, nie jest uważana za mutagenną w tym
badaniu.
Chociaż w większości doświadczeń uzyskane zostaną wyniki wyraz
nie pozytywne lub negatywne, to jednak
w nielicznych przypadkach uzyskane dane nie dają podstaw do wyrażenia opinii o oddziaływaniu badanej
substancji. Wyniki mogą pozostać dwuznaczne lub dyskusyjne, mimo wielu powtórzeń doświadczenia.
Pozytywne wyniki testu in vivo aberracji chromosomów spermatogoniów wskazują na to, że badana substancja
wywołuje strukturalne aberracje chromosomów w komórkach zarodkowych badanych gatunków. Negatywne
wyniki wskazują, że w warunkach doświadczalnych badana substancja nie wywołuje aberracji chromosomów
w komórkach zarodkowych badanych gatunków.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. Sprawozdanie z badania
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
1) Rozpuszczalnik/nośnik:
- uzasadnienie wyboru nośnika,
- rozpuszczalność i stabilność badanej substancji w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli jest znana;
2) Badane zwierzęta:
- stosowany gatunek/szczep,
- liczba i wiek zwierzÄ…t,
- z
ródło, warunki hodowli, sposób odżywiania itp.,
- waga poszczególnych zwierząt na początku badania, w tym zakres wagi ciała, średnia waga i odchylenie
standardowe dla każdej grupy;
3) Warunki badania:
- dane pochodzące z ewentualnego badania mającego na celu ustalenie zakresu badań,
- uzasadnienie drogi podawania,
- szczegółowe dane na temat sposobu przygotowania badanej substancji,
- szczegółowe dane na temat podawania badanej substancji,
- uzasadnienie terminów uśmiercania zwierząt,
- ewentualne przeliczenie stężenia badanej substancji ze stężenia w pokarmie lub wodzie pitnej (wyrażonego
w ppm) na rzeczywistą dawkę (wyrażoną w mg/kg wagi ciała/dobę),
- szczegółowe dane na temat jakości pokarmu i wody,
- szczegółowy opis poddawania działaniu badanej substancji i harmonogramu pobierania próbek,
- metody oceny toksyczności,
1 )
Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth,
D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.)
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Commettee on Guidelines for Mutagenicity
Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne,
Sydney, pp. 184-232.
230
- nazwa substancji powstrzymującej metafazę, jej stężenie i czas działania,
- metody przygotowania preparatów,
- kryteria zliczania aberracji,
- liczba analizowanych komórek w przeliczeniu na 1 zwierzę,
- kryteria uznania wyników badań za pozytywne, negatywne lub niejednoznaczne;
4) Wyniki:
- objawy toksyczności,
- wskaz
nik mitotyczny,
- stosunek mitoz spermatogoniów pierwszej i drugiej metafazy mejozy,
- rodzaj i liczba aberracji, podane indywidualnie dla każdego zwierzęcia,
- całkowita liczba aberracji w każdej grupie,
- liczba komórek z aberracjami w każdej grupie,
- zależność dawka/odpowiedz
, jeśli to możliwe,
- ewentualne analizy statystyczne,
- dane pochodzące z równolegle prowadzonej kontroli negatywnej,
- własne dane archiwalne dotyczące negatywnej grupy kontrolnej, z podaniem zakresów, średnich i odchyleń
standardowych,
- dane pochodzące z równolegle prowadzonej kontroli pozytywnej,
- ewentualne zmiany poliploidalności;
5) Dyskusję wyników;
6) Wnioski.
231
B.24. TEST PLAMKOWY U MYSZY
1. METODA
1.1. Wstęp
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.2. Definicje
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.3. Substancje kontrolne
Nie sÄ… stosowane.
1.4. Zasada badania
Jest to badanie in vivo u myszy, w którym rozwijające się zarodki są eksponowane na substancję chemiczną.
Melanoblasty są komórkami krytycznymi w rozwijających się zarodkach, a docelowymi genami są te, które
kontrolują barwę sierści. Zarodki są heterozygotyczne w odniesieniu do genów odpowiadających za kolor sierści.
Zmutowanie lub utrata allelu dominującego takiego genu w melanoblastach (poprzez różne zmiany genetyczne)
kończy się ekspresją fenotypu recesywnego w komórkach potomnych melanoblastu, w postaci plamek innego
koloru na sierści myszy. Częstość powstawania takich plamek w grupie eksponowanej jest porównywana z ich
częstością w grupie kontrolnej, której podaje się nośnik. Test plamkowy u myszy wykrywa mutacje somatyczne
w komórkach płodu.
1.5. Kryteria wiarygodności badań
Nie sÄ… stosowane.
1.6. Opis metody
1.6.1. Przygotowanie
Substancje testowane są, w miarę możliwości, rozpuszczane lub zawieszane w izotonicznym roztworze chlorku
sodu. Substancje chemiczne nierozpuszczalne w wodzie mogą być rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednim
nośniku. Używany nośnik nie powinien ani reagować z badaną substancją ani powodować efektu toksycznego.
Powinno się stosować świeżo przygotowane roztwory lub zawiesiny badanych substancji chemicznej.
1.6.2. Zwierzęta doświadczalne
Myszy szczepu T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, cchp/cchp; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald
spotting, s/s) są krzyżowane albo ze szczepem HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy,
ln fz/ln fz; pearl pe/pe) albo ze szczepem C57 BL (nonagouti, a/a). Inne odpowiednie krzyżówki takie jak np.
między NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) i DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute d/d) mogą być również
stosowane, jednak pod warunkiem że wydadzą potomstwo nonagouti.
1.6.3. Liczba i płeć zwierząt
Ciężarne samice eksponuje się tak, aby zapewnić odpowiednią dla każdej dawki liczbę myszy, które przeżyją
badanie. Odpowiednia wielkość próbki jest wyznaczana przez ilość plamek obserwowanych u eksponowanych
myszy w stosunku do wyników w grupie kontroli. Wynik ujemny można uznać tylko w przypadku, gdy zliczono
przynajmniej 300 myszy pochodzących od samic, którym podawano badaną substancję w najwyższej dawce.
232
1.6.4. Użycie badań kontrolnych dodatnich i ujemnych
Powinno się dysponować wynikami badań na myszach kontrolnych, którym podano tylko nośnik (kontrola
ujemna). W celu zwiększenia czułości testu można wykorzystać archiwalne wyniki z kontroli, pochodzące z tego
samego laboratorium, pod warunkiem że są one jednorodne. Jeżeli badana substancja nie wykazuje działania
mutagennego w tym teście, powinno się dysponować wynikami badań pochodzących z tego samego laboratorium
na zwierzętach kontroli dodatniej eksponowanych na związek chemiczny o znanych właściwościach
mutagennych.
1.6.5. Droga podania
Podawanie badanej substancji ciężarnym samicom odbywa się dożołądkowo (sondą) lub dootrzewnowo. W razie
potrzeby stosuje się ekspozycję inhalacyjną lub inny sposób podania.
1.6.6. Dawki
Stosuje się co najmniej dwie odpowiednio zróżnicowane dawki obejmujące również dawkę, która wywołuje
objawy toksyczności lub zmniejsza wielkość miotu. Substancje nietoksyczne powinny być przebadane
w najwyższej osiągalnej dawce.
1.6.7. Opis postępowania
Zwykle stosuje się pojedynczą ekspozycję w 8, 9 lub 10 dniu ciąży, przyjmując jako pierwszy ten dzień,
w którym po raz pierwszy zaobserwowano czop śluzowy w pochwie. Te dni odpowiadają 7,25; 8,25 i 9,25 dniom
od momentu zapłodnienia. Można także stosować dodatkowo ekspozycję w następnych dniach.
1.6.8. Analiza
Pomiędzy trzecim a czwartym tygodniem po urodzeniu, myszy są kodowane, po czym odbywa się liczenie
plamek. Wyróżnia się trzy kategorie plamek:
- białe do 5 mm plamki na środkowej linii brzusznej, które są przyjmowane za wynik zamierania komórek
(WMVS),
- żółte podobne do agouti plamki związane z sutkami, genitaliami, gardłem, okolicami pachowymi
i pachwinowymi oraz na środku czoła, które są przyjmowane za rezultat błędnego różnicowania komórek
(MDS),
- zabarwione i białe plamki przypadkowo rozmieszczone na sierści, które są przyjmowane za wynik mutacji
w komórkach somatycznych (RS).
Liczy siÄ™ wszystkie rodzaje plamek, ale tylko te ostatnie, czyli RS, sÄ… zwiÄ…zane ze zmianami genetycznymi.
W celu odróżnienia MDS od RS do badania próbek sierści można zastosować mikroskop fluorescencyjny.
Należy zanotować każdą widoczną zmianę makroskopową u myszy potomnych.
2. WYNIKI
Wyniki obejmują ogólną liczbę badanych myszy i liczbę plamek, które są przyjmowane za efekt mutacji
w komórkach somatycznych. Wyniki z grup narażanych i kontrolnych powinno się porównać przy pomocy
odpowiednich metod statystycznych. Wyniki powinny także uwzględniać liczebność poszczególnych miotów.
233
3. SPRAWOZDANIE
3.1. Sprawozdanie z badań
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
- szczepy użyte do krzyżówek,
- liczbę ciężarnych samic w grupie doświadczalnej i kontrolnej,
- średnią liczność miotu w grupach doświadczalnych i kontrolnych, po urodzeniu i w okresie karmienia przez
matkÄ™,
- dawki badanej substancji chemicznej,
- użyty rozpuszczalnik,
- dzień ciąży, w którym zwierzęta były eksponowane,
- drogę narażenia,
- całkowitą liczbę myszy oraz liczbę WMVS, MDS i RS w grupach doświadczalnych i kontrolnych,
- nieprawidłowości morfologiczne,
- zależność dawka/odpowiedz
w zakresie występowania RS, jeśli możliwa jest jej ocena,
- ocenÄ™ statystycznÄ…,
- omówienie wyników,
- interpretację wyników.
3.2. Ocena i interpretacja
Przeprowadza się na podstawie przepisów Wstępu Ogólnego Części B.
234
B.25. TEST DZIEDZICZNYCH TRANSLOKACJI U MYSZY
1. METODA
1.1. Wstęp
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.2. Definicje
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.3. Substancje kontrolne
Nie sÄ… stosowane.
1.4. Zasada badania
Badanie dziedzicznych translokacji u myszy pozwala na wykrywanie zmian w strukturze i liczbie chromosomów
w komórkach rozrodczych ssaków ujawniających się w pierwszym pokoleniu. W badaniu wykrywa się takie typy
zmian chromosomowych, jak wzajemne translokacje oraz w przypadku samic utratÄ™ chromosomu X. Nosiciele
translokacji i samice XO wykazują mniejszą płodność, co jest wykorzystywane przy wyborze pokolenia F do
analiz cytogenetycznych. Całkowita bezpłodność jest spowodowana pewnym typem translokacji (X-autosom i c-
t). Obserwacje cytogenetyczne translokacji prowadzi się w komórkach mejotycznych w diakinezie - metafazie I u
samców z pokolenia F albo u samców będących potomstwem samic z pokolenia F . Samice XO są
1 1
identyfikowane cytogenetycznie dzięki obecności tylko 39 chromosomów w komórkach szpiku kostnego
będących w metafazie.
1.5. Kryteria wiarygodności badań
Nie sÄ… stosowane.
1.6. Opis metody
1.6.1. Przygotowanie
W miarę możliwości badane substancje rozpuszcza się lub zawiesza w izotonicznym roztworze chlorku sodu.
Substancje nierozpuszczalne w wodzie rozpuszcza się lub zawiesza w odpowiednim nośniku. Zastosowany
nośnik nie powinien reagować z badaną substancją ani wywoływać efektów toksycznych. Powinno się używać
świeżo przygotowanych roztworów lub zawiesin badanej substancji chemicznej.
1.6.2. Drogi podania
Zazwyczaj substancję badaną podaje się drogą pokarmową lub dootrzewnowo. Mogą być używane również inne
drogi podania.
1.6.3. Zwierzęta doświadczalne
Ze względu na łatwość rozmnażania i łatwość przeprowadzania weryfikacji cytologicznej test przeprowadza się
na myszach. W teście nie wymaga się użycia specjalnej rasy, jednakże średnia wielkość miotu powinna być
większa niż 8 i stosunkowo stała. W badaniach wykorzystuje się dojrzałe płciowo zwierzęta.
1.6.4. Liczba zwierzÄ…t
Liczba zwierząt, które trzeba użyć do doświadczenia, zależy od częstości występowania translokacji
spontanicznych oraz od najmniejszego poziomu indukcji koniecznego do uzyskania odpowiedzi pozytywnej.
Najczęściej badanie przeprowadza się, analizując potomstwo płci męskiej pokolenia F . Należy badać
1
przynajmniej 500 samców F na dawkę. W przypadku włączenia samic pokolenia F , należy użyć 300 samców
1 1
i 300 samic.
1.6.5. Użycie kontroli dodatnich i ujemnych
235
Powinno podawać się wyniki dotyczące kontroli prowadzonej równolegle i dostępne własne dane archiwalne.
Jeżeli dysponuje się możliwymi do przyjęcia wynikami kontroli dodatnich z ostatnio prowadzonych badań w tym
samym laboratorium, można ich użyć zamiast równocześnie prowadzonej kontroli dodatniej.
1.6.6. Dawki
Bada się jedną dawkę, zwykle jest to najwyższa dawka powodująca minimalny efekt toksyczny, ale niemająca
wpływu na reprodukcję lub przeżywalność. Do wyznaczenia zależności dawka/odpowiedz
należy użyć dwóch
dodatkowych, niższych dawek.  Nietoksyczne substancje powinno się badać w najwyższej, możliwej do
osiągnięcia dawce.
1.6.7. Opis postępowania
1.6.7.1. Ekspozycja i kojarzenie
Zwierzęta można eksponować na działanie substancji według dwóch schematów. Najczęściej stosuje się
jednorazowe podanie badanej substancji. Można również podawać badaną substancję co 7 dni przez okres
35 dni. Liczba kojarzeń po ekspozycji odbywa się zgodnie z harmonogramem i powinna zapewnić obecność
wszystkich eksponowanych stadiów komórek rozrodczych. Po zakończeniu okresu kojarzenia każdą samicę
umieszcza się w oddzielnej klatce. Po urodzeniu potomstwa rejestruje się tę datę, wielkość miotu i płeć.
Potomstwo rodzaju męskiego jest odstawiane od matek, a potomstwo rodzaju żeńskiego, jeżeli nie bierze udziału
w doświadczeniu, jest usuwane.
1.6.7.2. Badanie translokacji
Badanie to można przeprowadzić przy pomocy jednej z dwóch metod:
1. Badania płodności pokolenia F i następnie sprawdzania ewentualnych nosicieli translokacji przy użyciu
1
analizy cytogenetycznej,
2. Analizy cytogenetycznej wszystkich samców z pokolenia F bez wcześniejszej selekcji poprzez ocenę
1
płodności.
1. Badanie płodności
Zmniejszoną płodność osobników z pokolenia F można ocenić, obserwując wielkość miotu i/lub analizując
1
zawartość macicy skojarzonych samic.
Powinno się ustalić kryteria określania normalnej i obniżonej płodności dla zastosowanej rasy myszy.
Obserwacje wielkości miotu: przeznaczone do badań samce z pokolenia F są umieszczane w osobnych klatkach
1
wraz z samicami użytymi do tego samego doświadczenia. Zwierzęta kontroluje się codziennie począwszy od 18
dnia po kojarzeniu. Rejestruje się wielkość miotu i płeć pokolenia F w chwili urodzenia, a następnie usuwa się
2
potomstwo. Jeżeli badane są samice z pokolenia F , zatrzymuje się całe mioty pokolenia F do dalszych badań.
1 2
Samice-nosicielki translokacji sÄ… sprawdzane poprzez analizÄ™ cytogenetycznÄ… translokacji u jakiegokolwiek z jej
potomków płci męskiej. Samice XO rozpoznaje się po zmianie stosunku płci u potomstwa z 1:1 do 1:2 samców
vs. samice. W kolejnym etapie normalne zwierzęta z pokolenia F są eliminowane z dalszych badań, jeżeli
1
badany miot F osiągnie lub przekroczy określoną wcześniej wartość normalną. W przeciwnym wypadku
2
obserwuje siÄ™ drugie lub trzecie pokolenie F .
2
Zwierzęta z pokolenia F , które po obserwacji maksymalnie trzech pokoleń F nie mogą być sklasyfikowane jako
1 2
normalne, są albo badane dalej na zawartość macicy skojarzonych samic, albo poddane bezpośredniej analizie
cytogenetycznej.
Analiza zawartości macicy: zmniejszenie wielkości pokolenia nosicieli translokacji jest wynikiem śmierci
embrionu, tak więc wysoka liczba martwych implantów jest wskaz
nikiem obecności translokacji u badanego
zwierzęcia. Każdy badany samiec z pokolenia F jest kojarzony z 2-3 samicami. Zapłodnienie ustala się na
1
podstawie codziennej, porannej kontroli czopów śluzowych. Samice zabija się po 14-16 dniach oraz notuje się
żywe i martwe implanty w macicy.
2. Analiza cytogenetyczna
Preparaty cytogenetyczne z jÄ…der wykonuje siÄ™ technikÄ… suszenia na powietrzu. Nosicieli translokacji
identyfikuje się przez obecność wielowartościowych konfiguracji w diakinezie - metafazie I spermatocytów
I rzędu. Wykrycie co najmniej dwóch komórek z wielowartościowym wiązaniem stanowi wymagany dowód na
to, że badane zwierzę jest nosicielem translokacji.
Jeżeli nie przeprowadzono selekcji poprzez rozmnażanie, kontroluje się cytogenetycznie wszystkie samce
pokolenia F . Pod mikroskopem należy przeanalizować co najmniej 25 komórek w diakinezie - metafazie I na
1
236
każdego samca. Badanie metafaz mitotycznych spermatogoniów lub szpiku kostnego przeprowadza się u samców
pokolenia F z małymi jądrami oraz z zahamowaną mejozą przed diakinezą lub u samic pokolenia F
1 1
podejrzanych o XO. Obecność nadzwyczaj długiego lub krótkiego chromosomu w każdej z 10 komórek jest
dowodem na szczególną translokację powodującą bezpłodność u samców (c/t). Niektóre translokacje X-
autosomu, które mogą powodować bezpłodność u samców mogą być identyfikowane tylko przez analizę
mitotycznych chromosomów. Obecność 39 chromosomów we wszystkich 10 mitozach jest dowodem, że mamy
do czynienia z samicÄ… XO.
2. WYNIKI
Wyniki należy przedstawiać w formie tabel.
Dla każdego okresu kojarzenia podaje się średnią wielkość pokolenia i stosunek płci z kojarzeń rodzicielskich
w momencie urodzenia i odstawienia od piersi.
W ocenie płodności zwierząt pokolenia F przedstawia się średnią wielkość pokolenia wszystkich typowych
1
kojarzeń i oddzielnie wielkość pokolenia nosicieli translokacji F . Dla analizy zawartości macicy podaje się
1
średnią liczbę żywych i martwych implantów typowych kojarzeń oraz oddzielnie liczbę żywych i martwych
implantów dla każdej skojarzonej pary nosicieli translokacji z pokolenia F .
1
W analizie cytogenetycznej diakinezy - metafazy I wykazuje się liczbę i typ konfiguracji wielowartościowych
oraz ogólną liczbę komórek dla każdego nosiciela translokacji.
W przypadku bezpłodnych osobników pokolenia F , podaje się ogólną liczbę kojarzeń i długość okresu
1
kojarzenia. Przedstawia się również ciężar jąder i szczegóły analizy cytogenetycznej.
Dla samic XO przedstawia się średnią wielkość miotu, stosunek płci w pokoleniu F oraz wyniki analizy
2
cytogenetycznej.
W miarę możliwości, nosicieli translokacji z pokolenia F selekcjonuje się wstępnie przy pomocy badania
1
płodności. Tabele muszą zawierać informacje dotyczące ilości nosicieli, u których potwierdzono translokacje
w stanie heterozygotycznym.
Do opracowania wyników należy użyć odpowiednich metod statystycznych.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. Sprawozdanie z badań
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
- rasÄ™ myszy, wiek i masÄ™ eksponowanych zwierzÄ…t,
- wyjściową liczbę zwierząt każdej płci w grupach doświadczalnych i kontrolnych,
- warunki badania: szczegółowy opis ekspozycji, zastosowane dawki i rozpuszczalniki, harmonogram
kojarzenia,
- liczbę i płeć potomstwa jednej samicy, liczbę i płeć potomstwa przeznaczonego do analizy translokacji,
- czas i kryteria analizy translokacji,
- liczbę i szczegółowy opis nosicieli translokacji, włącznie z danymi odnośnie rozmnażania i zawartości
macicy (w miarę możliwości),
- procedury cytogenetyczne i szczegóły analizy mikroskopowej, najlepiej ze zdjęciami,
- opracowanie statystyczne,
- omówienie wyników,
- interpretację wyników.
3.2.Ocena i interpretacja
Przeprowadza się na podstawie przepisów Wstępu Ogólnego Części B.
237
B.26. TOKSYCZNOŚĆ PODCHRONICZNA (90-DNIOWE POWTARZANE
NARAŻENIE GRYZONI DROG
POKARMOW
)
1. METODA
Metoda badania toksyczności podchronicznej opracowana na podstawie Wytycznej TG 408 OECD (1998).
1.1. Wprowadzenie
Szacowania i oceny właściwości toksycznych substancji chemicznej, określenia toksyczności podchronicznej za
pomocą powtarzanego dawkowania można dokonać po uzyskaniu wstępnych informacji z badań toksyczności
ostrej lub z badań po 28-dniowym podawaniu danej substancji. 90-dniowe badanie dostarcza informacji
o możliwym zagrożeniu dla zdrowia mogącym być następstwem powtarzanej, przedłużonej ekspozycji
obejmującej okres dojrzewania i wzrostu, aż do okresu dojrzałości.
Badanie powinno dostarczyć informacji na temat głównych skutków toksycznych, wskazać narządy krytyczne
i możliwość kumulacji oraz pozwolić na oszacowanie najwyższej dawki lub poziomu ekspozycji, przy którym nie
obserwuje się szkodliwych objawów wynikających z podawania substancji testowanej (NOAEL), który może być
następnie użyty do wyboru dawkowania w badaniu przewlekłym i określenia kryteriów bezpieczeństwa dla
narażenia człowieka.
Metoda badania toksyczności podchronicznej kładzie dodatkowo nacisk na objawy neurologiczne oraz wskazuje
na efekty immunologiczne i reprodukcyjne. Podkreśla się również potrzebę starannych obserwacji klinicznych
zwierząt w celu uzyskania jak najwięcej informacji. Badanie powinno pozwolić na identyfikację substancji
chemicznych mogących wywoływać w narządach efekty neurotoksyczne, immunologiczne lub reprodukcyjne,
które mogą wskazać na potrzebę dalszych, bardziej pogłębionych badań.
1.2. Definicje
1. Dawka jest to ilość podanej substancji testowanej. Dawka jest wyrażona w jednostkach wagowych (gramy lub
miligramy) lub też jednostkach wagowych badanej substancji na jednostkę masy ciała badanych zwierząt
(miligramy/kilogram masy ciała), lub jako stałe stężenie w paszy (ppm czy mg/kg paszy).
2. Dawkowanie jest ogólnym terminem obejmującym dawkę, częstość i długość okresu jej stosowania.
3. NOAEL określa najwyższą dawkę lub poziom ekspozycji, przy którym nie obserwuje się szkodliwych
objawów wynikających z podawania substancji testowanej (No Observed Adverse Effect Level).
1.3. Zasada badania
BadanÄ… substancjÄ™ podaje siÄ™ drogÄ… pokarmowÄ… codziennie w stopniowanych dawkach kilku grupom
doświadczalnym; jedna dawka dla każdej grupy przez 90 dni. Podczas narażenia zwierzęta obserwuje się
codziennie w celu stwierdzenia objawów działania toksycznego. Zwierzęta, które padną podczas doświadczenia,
poddaje się sekcji, a na końcu doświadczenia sekcję wykonuje się u wszystkich zwierząt, które przeżyły.
1.4. Zasady stosowanych metod badań
1.4.1. Przygotowanie zwierzÄ…t
Do badań należy stosować zdrowe zwierzęta, które są aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych i które nie
były uprzednio używane do doświadczeń. Zwierzęta powinny być scharakteryzowane przez takie dane, jak:
gatunek, szczep, z
ródło pochodzenia, płeć masę i/lub wiek. Zwierzęta należy przydzielić losowo do grup
kontrolnych i narażanych. Klatki powinny być rozmieszczone w sposób minimalizujący możliwe skutki zależne
od ich usytuowania. Każde zwierzę powinno posiadać indywidualny numer identyfikacyjny.
1.4.2. Przygotowanie dawek
Badana substancja może być podawana przez zgłębnik, w paszy lub w wodzie do picia. Sposób podawania
zależy od celu badania i od właściwości fizykochemicznych badanego materiału.
O ile jest to niezbędne, badaną substancję rozpuszcza się lub zawiesza w odpowiednim nośniku. Zaleca się, aby
w miarę możliwości w pierwszej kolejności stosować roztwór/zawiesinę wodną, następnie należy wziąć pod
uwagę roztwór/zawiesinę w oleju (np. oleju kukurydzianym), a potem możliwość stosowania innych nośników.
Dla nośników innych niż woda muszą być znane ich właściwości toksyczne. Należy znać trwałość badanej
substancji w stosowanym nośniku.
238
1.4.3. Warunki doświadczenia
1.4.3.1. Zwierzęta doświadczalne
Zalecanym gatunkiem gryzoni jest szczur, jakkolwiek mogą być również stosowane inne gatunki gryzoni np.
mysz. Należy używać młodych, zdrowych zwierząt, powszechnie stosowanych szczepów laboratoryjnych.
Samice powinny być niekojarzone i nieciężarne. Podawanie badanej substancji należy rozpoczynać możliwie, jak
najwcześniej po odsadzeniu i zawsze zanim zwierzęta osiągną wiek 9 tygodni. W momencie rozpoczęcia badań
różnice w masie ciała nie powinny przekraczać ą20% odpowiedniej wartości średniej dla każdej płci. Jeżeli
badanie subchroniczne jest prowadzone jako wstępne do badań chronicznych, to w obydwu przypadkach należy
używać zwierząt tego samego szczepu i pochodzących z tego samego z
ródła.
1.4.3.2. Liczba i płeć zwierząt
Co najmniej 20 zwierząt (10 samic i 10 samców) należy użyć dla każdej dawki. Jeżeli planuje się uśmiercanie
zwierząt w trakcie doświadczenia, to liczba zwierząt powinna być zwiększona o tyle, ile planuje się przeznaczyć
do badać sekcyjnych przed zakończeniem badania. W oparciu o dotychczasowe dane o substancji chemicznej lub
jej bliskich analogach, w celu obserwacji odwracalności lub utrwalenia skutków działania toksycznego, należy
rozważyć zastosowanie dodatkowej grupy satelitarnej liczącej 10 zwierząt (5 każdej płci) narażonych na
najwyższą dawkę, oraz grupy kontrolnej. Okres obserwacji po zakończeniu ekspozycji należy odpowiednio
ustalić, uwzględniając obserwowane skutki.
1.4.3.3. Poziomy dawkowania
Badania powinny być wykonane na co najmniej trzech grupach zwierząt (3 poziomy dawkowania) i u zwierząt
grupy kontrolnej, z wyjÄ…tkiem przypadku kiedy przeprowadza siÄ™ test dawki granicznej (1.4.3.4.). Poziomy
dawkowania można ustalić w oparciu o badania toksyczności dawki powtarzanej, należy uwzględnić także
istniejące dane o toksyczności i toksykokinetyce badanej substancji lub substancji o zbliżonych właściwościach.
O ile nie ma ograniczeń spowodowanych właściwościami fizykochemicznymi lub skutkami biologicznymi,
najwyższy poziom dawkowania należy tak dobrać, by wywołał on skutki toksyczne, jednak nie powodował
padnięć lub poważnego cierpienia zwierząt. Zmniejszająca się sekwencja poziomów dawkowania powinna być
tak dobrana, aby można było wykazać zależną od poziomu odpowiedz
, a na najmniejszym poziomie dawkowania
brak szkodliwych objawów wynikających z podawania testowanej substancji (NOAEL). Najczęściej optymalny
mnożnik różnicujący poziomy dawkowania wynosi 2 lub 4, a dodanie czwartej grupy narażanej jest
niejednokrotnie lepsze, niż stosowanie bardzo dużych przedziałów pomiędzy poziomami dawkowania (np.
współczynnik większy niż 6-10).
Zwierzęta z grupy kontrolnej nie powinny być eksponowane lub powinny otrzymywać nośnik stosowany przy
podawaniu substancji badanej. Zwierzęta grupy kontrolnej należy traktować identycznie jak zwierzęta z grup
doświadczalnych z wyjątkiem podawania badanej substancji. Jeżeli używany jest nośnik, to zwierzęta z grupy
kontrolnej powinny go otrzymywać w największej stosowanej objętości. W przypadku gdy badana substancja
podawana jest w paszy i powoduje zmniejszenie spożycia, wtedy użyteczne jest zastosowanie dodatkowej grupy
kontrolnej w celu rozróżnienia zmniejszenia spożycia wskutek zmiany smaku lub zmian toksykologicznych
w układzie badawczym.
Należy zwrócić uwagę na następujące cechy nośnika lub innych dodatków, takie jak wpływ na absorbcję,
rozmieszczenie, metabolizm lub retencję badanej substancji, oddziaływanie na badaną substancję w sposób
mogący zmieniać jej właściwości toksyczne; wpływ na spożycie paszy lub wody lub stan odżywienia zwierząt.
1.4.3.4. Badanie wartości dawki granicznej
Jeżeli w 90-dniowym doświadczeniu przeprowadzonym zgodnie z opisanymi metodami, przy narażeniu na jeden
poziom dawkowania wynoszący co najmniej 1000 mg/kg masy ciała/dzień nie obserwuje się szkodliwych
objawów wynikających z działania toksycznego substancji testowanej i gdy nie przewiduje się działania
toksycznego w oparciu o dane dotyczące substancji o zbliżonej strukturze, to wykonywanie pełnego badania
z zastosowaniem trzech poziomów dawkowania może nie być konieczne. Testu wartości granicznych nie stosuje
się, gdy ekspozycja ludzi wskazuje na potrzebę zastosowania wyższych poziomów dawkowania.
239
1.5. Opis metody
1.5.1. Poziomy dawkowania
Badaną substancję podaje się zwierzętom przez 7 dni w tygodniu przez okres 90 dni. Inny reżim podawania np.
5 dni w tygodniu powinno się uzasadnić. Gdy badaną substancję podaje się za pomocą zgłębnika, należy tego
dokonać w pojedynczych dawkach używając sondy dożołądkowej lub odpowiedniej rurki intubacyjnej.
Największa objętość płynu, jaką można podać jednorazowo, zależy od wielkości zwierzęcia laboratoryjnego.
Objętość ta nie powinna być większa od 1 ml/100 g masy ciała, roztworów z wyjątkiem roztworów wodnych,
które można podawać do 2 ml/100 g masy ciała. Z wyjątkiem substancji o działaniu drażniącym lub żrącym,
które w wyższych stężeniach zazwyczaj mogą nasilać skutki, należy zminimalizować zmienność objętości,
dobierając stężenia tak, aby zapewnić stałą objętość na wszystkich poziomach dawkowania.
W przypadku podawania substancji z paszą lub w wodzie pitnej, ważne jest zapewnienie, aby wprowadzona ilość
substancji badanej nie zakłócała normalnego żywienia lub równowagi wodnej. Gdy badana substancja podawana
jest z paszą, należy stosować albo stałe stężenie w paszy (w ppm), albo stałe dawki w stosunku do masy ciała
zwierząt; należy podać wybrany sposób. W przypadku podawania substancji do żołądka za pomocą sondy,
należy podawać ją o tej samej godzinie każdego dnia i korygować w miarę potrzeby stały poziom dawkowania
w stosunku do masy ciała. Gdy badanie 90-dniowe wykonywane jest jako wstępne do badań długoterminowych,
przewlekłych, należy używać tej samej paszy w obydwu badaniach.
1.5.2. Obserwacje
Okres obserwacji powinien wynosić co najmniej 90 dni. Zwierzęta z grupy satelitarnej, planowanej do dalszych
obserwacji, należy utrzymać przez odpowiedni okres bez narażania, celem wykrycia utrzymywania się,
względnie ustępowania skutków toksycznych.
Ogólne obserwacje kliniczne należy przeprowadzać przynajmniej raz dziennie, najlepiej o tej samej porze,
uwzględniając szczytowy okres wystąpienia przewidywanych skutków po narażeniu. Należy odnotować stan
kliniczny zwierzÄ…t. Przynajmniej dwa razy dziennie, zazwyczaj na poczÄ…tku i pod koniec dnia, wszystkie
zwierzęta należy skontrolować pod kątem zachorowalności i umieralności.
Przynajmniej raz przed pierwszym narażeniem (w celu porównań wewnętrznych między osobnikami) i następnie
przynajmniej raz w tygodniu u wszystkich zwierząt należy przeprowadzić szczegółowe badania kliniczne.
Badania te należy przeprowadzać poza klatką, w standardowym miejscu i najlepiej każdorazowo o tej samej
godzinie. Obserwacje należy starannie opisać, najlepiej używając systemów punktowych, wyraz
nie określonych
przez laboratorium badawcze. Należy dołożyć starań, aby zmiany w warunkach badania były minimalne. Opis
obserwacji powinien zawierać, lecz nie ograniczać się do zmian w skórze, sierści, oczu, błon śluzowych,
występowania wydzielin i wydalin oraz czynności autonomicznych (np. łzawienie, stroszenie sierści, wielkość
z
renicy, nieprawidłowy sposób oddychania). Również należy odnotować zmiany chodu, postawy, reakcji na
chwytanie, jak również obecność ruchów tonicznych lub klonicznych, ruchy stereotypowe (np. nadmierne
czyszczenie się, ciągłe obracanie się) lub nietypowe zachowanie (np. samookaleczanie, chodzenie do tyłu) 1).
Przed rozpoczęciem podawania badanej substancji i pod koniec doświadczenia należy przeprowadzić badania
okulistyczne, używając oftalmoskopu (wziernika ocznego) lub odpowiedniego równorzędnego urządzenia, raczej
u wszystkich zwierzÄ…t bÄ…dz
przynajmniej u zwierząt narażonych na najwyższą dawkę i u zwierząt z grupy
kontrolnej. W przypadku stwierdzenia zmian w oczach należy przebadać wszystkie zwierzęta.
Krótko przed zakończeniem narażania, w każdym razie nie wcześniej niż w 11 tygodniu, należy przeprowadzić
badania reakcji na różnego rodzaju bodz
ce czuciowe 2) (np. bodz
ce słuchowe, wzrokowe, działające na receptory
odpowiedzialne za postawę ciała) 3), 4), 5) oraz ocenę siły uchwytu 6) i aktywności motorycznej 7). Dalsze szczegóły
1 )
Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C., Riley M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore-
and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol Vol 1, pp. 233-236.
2 )
IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to
Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60.
3 )
Tupper, D. E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp.,
40, pp. 999-1003.
4 )
Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9,
pp. 691-704.
5 )
Moser, V. C., Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a
Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol.,108,
pp.267-283.
6 )
Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C., Riley M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore-
and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. Vol., 1, pp. 233-236.
7 )
Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C., Gill M. W., Reiter L. W., Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991).
240
procedur, według których należy postępować, podano w odpowiednich pozycjach piśmiennictwa. Można
również stosować procedury alternatywne.
Badania czynnościowe przeprowadzane pod koniec doświadczenia można pominąć, gdy dostępne są dane
z innych badań oraz gdy codzienne obserwacje kliniczne nie ujawniły jakichkolwiek zaburzeń czynnościowych.
Wyjątkowo, obserwacje czynnościowe mogą zostać pominięte dla grup, w których zwierzęta inaczej ujawniły
oznaki toksyczności w zakresie mogącym znacząco utrudniać przeprowadzenie testów czynnościowych.
1.5.2.1. Masa ciała i spożycie wody/paszy
Wszystkie zwierzęta należy ważyć przynajmniej raz w tygodniu. Pomiary spożycia paszy powinny być
dokonywane przynajmniej co tydzień. W przypadku gdy badana substancja podawana jest w wodzie do
picia.przynajmniej raz w tygodniu należy zmierzyć spożycie wody. Pomiaru spożycia wody należy dokonywać
również przy podawaniu substancji z paszą lub przez sondę, gdyż spożycie wody w tych przypadkach może być
zakłócone.
1.5.2.2. Badania hematologiczne i biochemiczne
Próbki krwi należy pobrać z ustalonego miejsca i przechowywać, o ile to konieczne, w odpowiednich warunkach.
Na zakończenie doświadczenia próbki należy pobrać tuż przed lub w trakcie zabijania zwierząt.
Na zakończenie doświadczenia oraz, o ile pobiera się krew, w trakcie jego trwania należy wykonać następujące
oznaczenia: hematokryt, zawartość hemoglobiny, liczba erytrocytów, całkowita liczba białych ciałek krwi i ich
wzór odsetkowy, liczba płytek krwi oraz pomiar czasu/potencjału krzepnięcia krwi.
Kliniczne badania biochemiczne należy przeprowadzić w próbkach krwi pobranych od wszystkich zwierząt, tuż
przed lub w trakcie ich zabijania (oprócz zwierząt padłych lub zabitych w czasie trwania doświadczenia), w celu
wykrycia w tkankach znaczących skutków toksycznych, zwłaszcza w nerkach i w wątrobie. Podobnie jak
w badaniach hematologicznych należy postępować w przypadku pobierania krwi do oznaczeń biochemicznych
dokonywanych w trakcie doświadczenia. Zaleca się głodzenie zwierząt przez noc przed pobraniem próbek
krwi 1). Badanie osocza lub surowicy krwi powinno obejmować oznaczenia poziomu sodu, potasu, glukozy,
całkowitego cholesterolu, mocznika, azotu niebiałkowego, kreatyniny, białka całkowitego i albumin, co najmniej
dwa enzymy wskazujące na uszkodzenie hepatocytów (aktywność aminotransferazy alaninowej,
aminotransferazy asparaginianowej, fosfatazy zasadowej, gamma-glutamylotranspeptydazy, dehydrogenazy
sorbitolowej). Oznaczenia aktywności dodatkowych enzymów (wątrobowych lub innego pochodzenia) i poziomu
kwasów żółciowych mogą dostarczyć w pewnych warunkach użytecznych informacji.
Opcjonalnie, w ostatnim tygodniu narażenia można dokonać następujących oznaczeń w moczu zbieranym
w odpowiednim okresie czasu: wygląd, objętość, osmolarność lub ciężar właściwy, wartość pH, zawartość
białka, glukozy i obecność krwi/komórki krwi.
Dodatkowo należy rozważyć oznaczanie w surowicy krwi markerów uszkodzenia tkanek. Inne oznaczenia, które
powinny być przeprowadzone, wynikają z faktu, gdy znane są lub istnieją podejrzenia, że badana substancja
może wpływać na związane z nimi profile metaboliczne obejmujące wapń, fosforany, triglicerydy na czczo,
swoiste hormony, stężenie methemoglobiny i aktywność esterazy acetylocholinowej. Potrzebę tych badań ustala
siÄ™ dla pewnych grup substancji chemicznych lub w indywidualnych przypadkach.
Ogólnie, istnieje potrzeba elastycznego podejścia w zależności od gatunku i obserwowanych i/lub
spodziewanych skutków wywoływanych przez daną substancję.
W przypadku gdy podstawowe, archiwalne dane są niewystarczające należy wziąć pod uwagę potrzebę
oznaczania zmienności hematologicznych lub biochemicznych przed rozpoczęciem ekspozycji; generalnie nie
zaleca się pozyskiwania tych danych przed narażaniem zwierząt 2).
1.5.2.3. Badanie sekcyjne
Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments.
Neurotoxicol. Teratol, 13, pp. 599-609.
1 )
Dla szeregu pomiarów w surowicy lub osoczu szczególnie glukozy zalecane jest głodzenie przez noc.
Głównym powodem tego zalecenia jest duża zmienność, która nieuchronnie może wynikać z braku głodzenia
co może prowadzić do maskowania bardziej subtelnych skutków i utrudniać interpretację. Z drugiej strony
całonocne głodzenie może wpływać na ogólny metabolizm zwierząt, a zwłaszcza w badaniach paszowych
może zakłócać dzienne narażenie na badaną substancję. W przypadku stosowania całonocnego głodzenia to
oznaczenia wskaz
ników kliniczno-biochemicznych należy dokonać po przeprowadzeniu badań
czynnościowych.
2 )
Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity
and Safety Studies, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198-201.
241
Wszystkie zwierzęta powinny być poddane pełnej sekcji, w której zakres wchodzi szczegółowe badanie
zewnętrznej powierzchni ciała, wszystkich otworów naturalnych ciała oraz jamy czaszkowej, piersiowej
i brzusznej wraz z ich zawartością. Aby uniknąć wysychania, wątrobę, nerki, nadnercza, jądra, najądrza, macicę,
jajniki, grasicę, śledzionę, mózgowie i serce pobrane od wszystkich zwierząt (z wyjątkiem padłych i/lub zabitych
w trakcie doświadczenia) należy uwolnić w miarę potrzeby od otaczających tkanek i następnie, tak szybko jak to
jest możliwe, określić ich mokrą masę.
Do badań histopatologicznych należy zabezpieczyć w odpowiednim płynie utrwalającym następujące narządy
i tkanki: wszystkie w których stwierdzono makroskopowo zmiany, mózg (reprezentatywne części mózgu,
móżdżku rdzenia/mostu), rdzeń kręgowy (3 odcinki  szyjny, środkowo-piersiowy i lędz
wiowy), przysadkÄ™,
tarczycę, przytarczyce, grasicę, przełyk, ślinianki, żołądek, jelito cienie i grube (łącznie z kępkami Peyera),
wątrobę, trzustkę, nerki, nadnercza, śledzionę, serce, tchawicę i płuca (zabezpieczone za pomocą dotchawiczego
wstrzyknięcia utrwalacza i następnie immersyjnie), aortę, gonady, macicę, dodatkowe narządy układu
rozrodczego, u samic gruczoły mleczne, gruczoł krokowy, pęcherz moczowy, pęcherzyk żółciowy (mysz), węzły
chłonne (jeden węzeł związany z drogą podania i inny odległy od drogi podania, wskazujący na skutki
układowe), nerw obwodowy (kulszowy lub piszczelowy) raczej ściśle związany z mięśniem, wycinek szpiku
kostnego (i/lub świeżo sporządzony aspirat szpiku kostnego), skórę i oczy (w przypadku gdy badanie
okulistyczne wykazało zmiany). Wyniki badań klinicznych lub innych mogą wskazywać na potrzebę badania
dodatkowych tkanek. Również należy zabezpieczyć w utrwalaczu narządy, które na podstawie znanych
właściwości badanej substancji są prawdopodobnie narządami krytycznymi.
1.5.2.4. Badanie histopatologiczne
Pełna ocena histopatologiczna zabezpieczonych w utrwalaczu narządów i tkanek powinna być wykonana
u zwierząt z grupy kontrolnej i grupy narażanej na najwyższą dawkę. Badania te należy wykonać u zwierząt
z wszystkich innych grup, gdy u zwierząt z grupy narażonej na najwyższą dawkę obserwuje się zmiany. Powinny
być zbadane wszystkie zmiany stwierdzone makroskopowo.
Jeżeli stosowana jest grupa towarzysząca, to należy wykonać badania histopatologiczne tych tkanek i narządów,
w których stwierdzono zmiany w grupach narażanych.
2. WYNIKI I SPORZ
DZANIE SPRAWOZDANIA
2.1. Wyniki
Należy podać dane indywidualne. Uzyskane wyniki należy zebrać w formie tabel zamieszczając, w nich dla
każdej grupy: liczbę zwierząt na początku doświadczenia, liczbę zwierząt, które padły lub ze względów
humanitarnych zostały zabite w trakcie doświadczenia, oraz datę padnięć lub likwidacji, liczbę zwierząt
z oznakami działania toksycznego, opis obserwowanych objawów z podaniem daty ich wystąpienia i trwania oraz
stopnia nasilenia, liczbę zwierząt, u których stwierdzono uszkodzenia, charakter zmian i odsetek zwierząt
wykazujących każdy typ uszkodzenia.
W miarę potrzeby wyniki liczbowe powinny być ocenione za pomocą odpowiednich i ogólnie uznanych metod
statystycznych. Metody statystyczne i dane, które należy analizować powinny być wybrane w trakcie planowania
badania
2.2. Sprawozdanie z badań
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
1) Substancja badana:
- stan fizyczny, czystość, właściwości fizykochemiczne,
- dane identyfikujÄ…ce,
- nośnik (gdy stosowano), uzasadnienie wyboru nośnika innego niż woda;
2) Zwierzęta laboratoryjne:
- stosowany gatunek i szczep,
- liczba, wiek i płeć zwierząt,
- z
ródło pochodzenia, warunki przetrzymywania, dieta itp.,
- masa poszczególnych zwierząt na początku badania;
3) Warunki przeprowadzenia badania:
- uzasadnienie wyboru poziomu dawkowania,
- szczegóły dotyczące receptury przygotowania badanej substancji/sporządzenia diety, osiąganego stężenia,
trwałości i jednorodności mieszaniny,
- szczegóły dotyczące podawania badanej substancji,
- rzeczywiste dawki (mg/kg masy ciała/dzień) oraz współczynniki przeliczeniowe stężenia badanej substancji
w diecie/wodzie pitnej na rzeczywiste dawki, jeżeli się je stosuje,
242
- dane dotyczące jakości paszy i wody;
4) Wyniki:
- masa ciała i zmiany masy ciała,
- spożycie paszy, spożycie wody, gdy jest to konieczne,
- dane dotyczące odpowiedzi na działanie toksyczne w powiązaniu z dawką i płcią, łącznie z objawami
działania toksycznego,
- charakter, nasilenie i czas trwania objawów klinicznych (odwracalne czy nie),
- wyniki badań okulistycznych,
- dane dotyczące czynności czuciowych, siły chwytnej i aktywności motorycznej (oile osiągalne),
- dane hematologiczne z przynależnymi wartościami podstawowymi,
- dane z biochemii klinicznej z przynależnymi wartościami podstawowymi,
- dane dotyczące masy ciała przed uśmierceniem, masy narządów i stosunku masy narządów do masy ciała,
- opis zmian makroskopowych,
- szczegółowy opis wszystkich zmian histopatologicznych,
- dane o absorbcji, o ile są dostępne,
- opracowanie statystyczne wyników, jeśli wykonano;
5) Dyskusja wyników;
6) Wnioski.
B. 27. TOKSYCZNOŚĆ PODCHRONICZNA (90-DNIOWE POWTARZANE
NARAŻENIE DROG
POKARMOW
ZWIERZ
T Z GATUNKÓW INNYCH
NIÅ» GRYZONIE)
1. METODA
Metoda badania toksyczności podchronicznej opracowana na podstawie wytycznej TG 409 OECD (1998).
1.1. Wprowadzenie
Szacowania i oceny właściwości toksycznych substancji chemicznej, określenia toksyczności podchronicznej za
pomocą powtarzanego dawkowania można dokonać po uzyskaniu wstępnych informacji z badań toksyczności
ostrej lub z badań po 28-dniowym podawaniu danej substancji. 90-dniowe badanie dostarcza informacji
o możliwym zagrożeniu dla zdrowia mogącym być następstwem powtarzanej ekspozycji obejmującej szybki
wzrost, aż do okresu wczesnej dojrzałości. Badanie powinno dostarczyć informacji na temat głównych skutków
toksycznych, wskazać narządy krytyczne i możliwość kumulacji oraz pozwolić na oszacowanie najwyższej dawki
lub poziomu ekspozycji, przy którym nie obserwuje się szkodliwych objawów wynikających z podawania
substancji testowanej (NOAEL), który może być następnie użyty do wyboru sposobu dawkowania w badaniu
przewlekłym i określenia kryteriów bezpieczeństwa dla narażenia człowieka.
Metoda badania toksyczności podchronicznej pozwala na identyfikację szkodliwych skutków u niegryzoni
narażonych na substancję chemiczną i powinna być stosowana:
- gdy obserwowane skutki u innego gatunku zwierząt wskazują na potrzebę ich wyjaśnienia/charakterystyki na
drugim gatunku  niegryzoniu,
- gdy badania toksykokinetyki wskazują, że użycie specjalnego gatunku niegryzoni jest najlepszym wyborem
zwierzęcia laboratoryjnego,
- gdy inne, wyraz
nie określone powody uzasadniają użycie gatunku niegryzoni.
1.2. Definicje
1. Dawka jest to ilość podanej substancji testowanej. Dawka jest wyrażona w jednostkach wagowych (gramy lub
miligramy) lub też jednostkach wagowych badanej substancji na jednostkę masy ciała badanych zwierząt
(miligramy/kilogram masy ciała) lub jako stałe stężenie w paszy (ppm czy mg/kg paszy).
2. Dawkowanie jest ogólnym terminem obejmującym dawkę, częstość i długość okresu jej stosowania.
3. NOAEL określa najwyższą dawkę lub poziom ekspozycji, przy którym nie obserwuje się szkodliwych
objawów wynikających z podawania substancji testowanej (No Observed Adverse Effect Level).
1.3. Zasada metody badawczej
BadanÄ… substancjÄ™ podaje siÄ™ drogÄ… pokarmowÄ… codziennie w stopniowanych dawkach kilku grupom
doświadczalnym; jedna dawka dla każdej grupy przez 90 dni. Podczas narażania zwierzęta obserwuje się
codziennie w celu stwierdzenia objawów działania toksycznego. U zwierząt, które padną podczas doświadczenia,
wykonuje się sekcję, a na końcu doświadczenia sekcję wykonuje się u wszystkich zwierząt, które przeżyły.
243
1.4. Zasady stosowanych metod badań
1.4.1. Wybór gatunku zwierząt
Powszechnie stosowanym gatunkiem niegryzoni jest pies, pochodzący z określonej hodowli; najczęściej stosuje
się beagle. Można stosować również inne gatunki, jak np. świnie, świnie miniaturowe. Nie zaleca się stosowania
naczelnych, a ich użycie musi być uzasadnione. Należy stosować młode, zdrowe zwierzęta, a w przypadku psów
podawanie należy rozpocząć w 4-6 miesiącu życia, lecz nie póz
niej niż w wieku 9 miesięcy. Jeżeli badanie
podchroniczne jest prowadzone jako wstępne do długoterminowych badań chronicznych, to w obu przypadkach
należy używać zwierząt tego samego szczepu i pochodzących z tego samego z
ródła.
244
1.4.2. Przygotowanie zwierzÄ…t
Do badań należy stosować zdrowe zwierzęta, które są aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych i które nie
były uprzednio używane do doświadczeń. Okres aklimatyzacji zależy od wybranego gatunku i z
ródła jego
pochodzenia. Zaleca się co najmniej 5 dni dla psów i świń hodowlanych z miejscowego stada i przynajmniej dwa
tygodnie dla zwierząt pochodzących z zewnątrz. Zwierzęta powinny być scharakteryzowane przez takie dane,
jak: gatunek, szczep, z
ródło pochodzenia, płeć, masę i/lub wiek. Zwierzęta należy przydzielić losowo do grup
kontrolnych i narażanych. Klatki powinny być rozmieszczone w sposób minimalizujący możliwe skutki zależne
od ich usytuowania. Każde zwierzę powinno posiadać indywidualny numer identyfikacyjny.
1.4.3. Przygotowanie dawek
Badana substancja może być podawana przez zgłębnik, w paszy, w wodzie do picia lub w kapsułkach. Sposób
podawania zależy od celu badania i od właściwości fizykochemicznych badanego materiału.
O ile jest to niezbędne, badaną substancję rozpuszcza się lub zawiesza w odpowiednim nośniku. Zaleca się, aby
w miarę możliwości w pierwszej kolejności stosować roztwór/zawiesinę wodną, następnie należy wziąć pod
uwagę roztwór/zawiesinę w oleju (np. oleju kukurydzianym), a potem możliwość stosowania innych nośników.
Dla nośników innych niż woda muszą być znane ich właściwości toksyczne. Należy znać trwałość badanej
substancji w stosowanym nośniku.
1.5. Opis metod
1.5.1. Liczba i płeć zwierząt
Co najmniej 8 zwierząt (4 samice i 4 samce) należy użyć dla każdego poziomu dawkowania. Jeżeli planuje się
uśmiercanie zwierząt w trakcie doświadczenia to liczba zwierząt powinna być zwiększona o tyle, ile planuje się
przeznaczyć do badań sekcyjnych przed zakończeniem badania. Liczba zwierząt pod koniec doświadczenia musi
być wystarczająca dla pełnej oceny skutków toksycznych. W oparciu o dotychczasowe dane o substancji
chemicznej lub o jej bliskich analogach należy rozważyć dodatkową grupę satelitarną, liczącą 8 zwierząt
(4 każdej płci) narażonych na najwyższą dawkę, oraz grupę kontrolną, w celu obserwacji odwracalności lub
utrwalenia skutków działania toksycznego. Okres obserwacji po zakończeniu ekspozycji należy odpowiednio
ustalić, uwzględniając obserwowane skutki.
1.5.2. Dawki
Badania powinny być wykonane na co najmniej trzech grupach zwierząt (3 poziomy dawkowania) i u zwierząt
grupy kontrolnej, z wyjÄ…tkiem przypadku kiedy przeprowadza siÄ™ test dawki granicznej (1.5.3.). Poziomy
dawkowania można ustalić w oparciu o badania toksyczności dawki powtarzanej, należy także uwzględnić
istniejące dane o toksyczności i toksykokinetyce badanej substancji lub materiału o zbliżonych właściwościach.
O ile nie ma ograniczeń spowodowanych właściwościami fizykochemicznymi lub skutkami biologicznymi,
najwyższy poziom dawkowania należy tak dobrać, by wywołał skutki toksyczne, jednak nie powodował padnięć
lub poważnego cierpienia zwierząt. Zmniejszająca się sekwencja poziomów dawkowania powinna być tak
dobrana, aby można było wykazać zależną od poziomu odpowiedz
, a w najmniejszym poziomie dawkowania
brak szkodliwych objawów wynikających z podawania testowanej substancji (NOAEL). Najczęściej optymalny
mnożnik różnicujący poziomy dawkowania wynosi 2 lub 4, a dodanie czwartej grupy narażanej jest
niejednokrotnie lepsze, niż stosowanie bardzo dużych przedziałów pomiędzy poziomami dawkowania (np.
współczynnik większy niż 6-10).
Zwierzęta z grupy kontrolnej nie powinny być eksponowane lub powinny otrzymywać nośnik stosowany przy
podawaniu substancji badanej. Zwierzęta grupy kontrolnej należy traktować identycznie jak zwierzęta z grup
doświadczalnych z wyjątkiem podawania badanej substancji. Jeżeli używany jest nośnik, to zwierzęta z grupy
kontrolnej powinny go otrzymywać w największej stosowanej objętości. W przypadku gdy badana substancja
podawana jest w paszy i powoduje zmniejszenie spożycia, wtedy użyteczne jest zastosowanie dodatkowej grupy
kontrolnej w celu rozróżnienia zmniejszenia spożycia wskutek zmiany smaku lub zmian toksykologicznych
w układzie badawczym.
Należy zwrócić uwagę na następujące cechy nośnika lub innych dodatków, takie jak wpływ na absorbcję,
rozmieszczenie, metabolizm lub retencję badanej substancji, oddziaływanie na badaną substancję w sposób
mogący zmieniać jej właściwości toksyczne, wpływ na spożycie paszy lub wody, stan odżywienia zwierząt.
245
1.5.3. Badanie wartości dawki granicznej
Jeżeli w 90-dniowym doświadczeniu przeprowadzonym zgodnie z opisanymi metodami, przy narażeniu na jeden
poziom dawkowania wynoszący co najmniej 1000 mg/kg masy ciała/dzień nie obserwuje się szkodliwych
objawów wynikających z działania toksycznego substancji testowanej i gdy nie przewiduje się działania
toksycznego w oparciu o dane dotyczące substancji o zbliżonej strukturze, to wykonywanie pełnego badania
z zastosowaniem trzech poziomów dawkowania może nie być konieczne. Testu wartości granicznych nie stosuje
się, gdy ekspozycja ludzi wskazuje na potrzebę zastosowania wyższych poziomów dawkowania.
1.5.4. Poziomy dawkowania
Zwierzętom powinno się podawać badaną substancję przez 7 dni w tygodniu przez okres 90 dni. Inny reżim
podawania np. 5 dni w tygodniu powinno się uzasadnić. Gdy badaną substancję podaje się za pomocą zgłębnika,
należy tego dokonać w pojedynczych dawkach, używając sondy dożołądkowej lub odpowiedniej rurki
intubacyjnej. Największa objętość płynu, jaką można podać jednorazowo, zależy od wielkości zwierzęcia
laboratoryjnego. Zazwyczaj objętość ta powinna być możliwie jak najmniejsza. Z wyjątkiem substancji
o działaniu drażniącym lub żrącym, które w wyższych stężeniach zazwyczaj mogą nasilać skutki, należy
zminimalizować zmienność objętości, dobierając stężenia tak, aby zapewnić stałą objętość na wszystkich
poziomach dawkowania.
W przypadku podawania substancji z paszą lub w wodzie pitnej, ważne jest zapewnienie, aby wprowadzona ilość
substancji badanej nie zakłócała normalnego żywienia lub równowagi wodnej. Gdy badana substancja podawana
jest z paszą, należy stosować albo stałe stężenie w paszy (w ppm), albo stałe dawki w stosunku do masy ciała
zwierząt; należy podać wybrany sposób. W przypadku podawania substancji do żołądka za pomocą sondy,
dawkę należy podawać o tej samej godzinie każdego dnia i korygować w miarę potrzeby stały poziom
dawkowania w stosunku do masy ciała. Gdy badanie 90-dniowe wykonywane jest jako wstępne do badań
długoterminowych, przewlekłych, należy używać tej samej paszy w obu badaniach.
1.5.5. Obserwacje
Okres obserwacji powinien wynosić co najmniej 90 dni. Zwierzęta z grupy satelitarnej, planowanej do dalszych
obserwacji, należy utrzymać przez odpowiedni okres bez narażania, celem wykrycia utrzymywania się,
względnie ustępowania skutków toksycznych.
Ogólne obserwacje kliniczne należy przeprowadzać przynajmniej raz dziennie, najlepiej o tej samej porze,
uwzględniając szczytowy okres wystąpienia przewidywanych skutków po narażeniu. Należy odnotować stan
kliniczny zwierzÄ…t. Przynajmniej dwa razy dziennie, zazwyczaj na poczÄ…tku i pod koniec dnia, wszystkie
zwierzęta należy skontrolować pod kątem zachorowalności i umieralności.
Przynajmniej raz przed pierwszym narażeniem (w celu porównań wewnętrznych między osobnikami) i następnie
przynajmniej raz w tygodniu u wszystkich zwierząt należy przeprowadzić szczegółowe badania kliniczne.
Badania te należy przeprowadzać poza klatką, w standardowym miejscu i najlepiej każdorazowo o tej samej
godzinie. Obserwacje należy starannie opisać, najlepiej używając systemów punktowych, wyraz
nie określonych
przez laboratorium badawcze. Należy dołożyć starań, aby zmiany w warunkach badania były minimalne. Opis
obserwacji powinien zawierać, lecz nie ograniczać się do zmian w skórze, sierści, oczu, błon śluzowych,
występowania wydzielin i wydalin oraz czynności autonomicznych (np. łzawienie, stroszenie sierści, wielkość
z
renicy, nieprawidłowy sposób oddychania). Należy również odnotować zmiany chodu, postawy, reakcji na
chwytanie, jak również obecność ruchów tonicznych lub klonicznych, ruchy stereotypowe (np. nadmierne
czyszczenie się, ciągłe obracanie się) lub nietypowe zachowanie (np. samookaleczanie, chodzenie do tyłu).
Przed rozpoczęciem podawania badanej substancji i pod koniec doświadczenia należy przeprowadzić badania
okulistyczne, używając oftalmoskopu (wziernika ocznego) lub odpowiedniego równorzędnego urządzenia, raczej
u wszystkich zwierzÄ…t bÄ…dz
przynajmniej u zwierząt narażonych na najwyższą dawkę i u zwierząt z grupy
kontrolnej. W przypadku stwierdzenia zmian w oczach należy przebadać wszystkie zwierzęta.
1.5.5.1. Masa ciała i spożycie wody/paszy
Wszystkie zwierzęta należy ważyć przynajmniej raz w tygodniu. Pomiary spożycia paszy powinny być
dokonywane przynajmniej co tydzień. W przypadku gdy badana substancja podawana jest w wodzie do picia,
przynajmniej raz w tygodniu należy zmierzyć spożycie wody. Pomiaru spożycia wody należy dokonywać
również przy podawaniu substancji z paszą lub przez sondę, gdyż spożycie wody w tych przypadkach może być
zakłócone.
246
1.5.5.2. Badania hematologiczne i biochemiczne
Próbki krwi należy pobrać z ustalonego miejsca i przechowywać, o ile to konieczne w odpowiednich warunkach.
W końcowej fazie doświadczenia próbki należy pobrać tuż przed lub w trakcie zabijania zwierząt.
Na początku badania, następnie w comiesięcznych odstępach lub w połowie badania oraz w chwili jego
zakończenia należy wykonać następujące oznaczenia: hematokryt, stężenie hemoglobiny, liczba erytrocytów,
całkowita liczba białych ciałek krwi i ich wzór odsetkowy, liczba płytek krwi oraz pomiar czasu/potencjału
krzepnięcia krwi, czas protrombinowy lub czas tromboplastynowy,
Kliniczne badania biochemiczne należy przeprowadzić w próbkach krwi pobranych od wszystkich zwierząt na
początku badania, następnie w comiesięcznych odstępach lub w połowie badania oraz w chwili jego zakończenia
w celu wykrycia w tkankach znaczących skutków toksycznych, zwłaszcza w nerkach i w wątrobie. Zakres badań
powinien obejmować zachowanie równowagi elektrolitów, metabolizm węglowodanów oraz czynność wątroby
i nerek. Wybór specyficznych testów będzie zależał od obserwacji sposobu działania badanej substancji. Przed
pobraniem próbek krwi zwierzęta powinny być głodzone przez okres stosowny dla danego gatunku. Sugerowane
jest wykonanie następujących oznaczeń: poziom wapnia, fosforanów, chlorków, sodu, potasu, glukozy na czczo,
mocznika, azotu niebiałkowego, albumin, kreatyniny, całkowitej bilirubiny, białka całkowitego oraz aktywność
aminotransferazy alaninowej, aminotransferazy asparaginianowej, dekarbolazy ornitynowej,
gamma-glutamylotranspeptydazy, dehydrogenazy sorbitolowej.
Na początku badania, następnie w comiesięcznych odstępach lub w połowie badania oraz w chwili jego
zakończenia należy wykonać badania moczu zbieranego w określonym czasie. Analiza moczu powinna
obejmować: wygląd, objętość, osmolarność lub ciężar właściwy, wartość pH, zawartość białka, glukozy
i krew/komórki krwi. W miarę potrzeby, dla poszerzenia oceny obserwowanych skutków, należy oznaczyć dalsze
parametry.
Dodatkowo należy rozważyć oznaczanie w surowicy krwi markerów uszkodzenia tkanek. Inne oznaczenia, które
powinny być przeprowadzone, wynikają z faktu, gdy znane są lub istnieją podejrzenia, że badana substancja
może wpływać na związane z nimi profile metaboliczne obejmujące wapń, fosforany, triglicerydy na czczo,
swoiste hormony, stężenie methemoglobiny i aktywność esterazy acetylocholinowej. Potrzebę tych badań ustala
siÄ™ dla pewnych grup substancji chemicznych lub w indywidualnych przypadkach.
Ogólnie, istnieje potrzeba elastycznego podejścia w zależności od gatunku i obserwowanych i/lub
spodziewanych skutków wywoływanych przez daną substancję.
1.5.5.3. Badanie sekcyjne
Wszystkie zwierzęta powinny być poddane pełnemu badaniu sekcyjnemu, które obejmuje szczegółową ocenę
zewnętrznej powierzchni ciała, wszystkich otworów naturalnych ciała oraz jamę czaszkową, piersiową i brzuszną
wraz z ich zawartością. Aby uniknąć wysychania, wątrobę z pęcherzykiem żółciowym, nerki, nadnercza, jądra,
najądrza, macicę, jajniki, tarczycę (z przytarczycami), grasicę, śledzionę, mózg i serce pobrane od wszystkich
zwierząt (z wyjątkiem padłych i/lub zabitych w trakcie doświadczenia) należy uwolnić w miarę potrzeby od
otaczających tkanek i następnie, tak szybko jak to jest możliwe, określić ich mokrą masę.
Do dalszych badań histopatologicznych następujące narządy i tkanki należy zabezpieczyć w odpowiednim płynie
utrwalającym: wszystkie, w których stwierdzono makroskopowo zmiany oraz mózgowie (reprezentatywne części
mózgu, móżdżku, rdzenia/mostu), rdzeń kręgowy (3 odcinki  szyjny, środkowo-piersiowy i lędz
wiowy),
przysadkę, oczy, tarczycę, przytarczyce, grasicę, przełyk, ślinianki, żołądek, jelito cienie i grube (łącznie
z kępkami Peyera), wątrobę, pęcherzyk żółciowy, trzustkę, nerki, nadnercza, śledzionę, serce, tchawicę i płuca,
aortę, gonady, macicę, dodatkowe narządy układu rozrodczego, u samic gruczoły mleczne, gruczoł krokowy,
pęcherz moczowy, węzły chłonne (jeden węzeł związany z drogą podania i inny odległy od drogi podania,
wskazujący na skutki układowe), nerw obwodowy (kulszowy lub piszczelowy) raczej ściśle związany
z mięśniem, wycinek szpiku kostnego (i/lub świeżo sporządzony aspirat szpiku kostnego) i skórę. Wyniki badań
klinicznych lub innych mogą wskazywać na potrzebę badania dodatkowych tkanek. Należy również zabezpieczyć
w utrwalaczu narządy, które na podstawie znanych właściwości badanej substancji są prawdopodobnie
narzÄ…dami krytycznymi.
1.5.5.4. Badania histopatologiczne
Pełna ocena histopatologiczna zabezpieczonych w utrwalaczu narządów i tkanek powinna być wykonana
u zwierząt z grupy kontrolnej i grupy narażanej na najwyższą dawkę. Badania te należy wykonać u zwierząt
z wszystkich innych grup, gdy u zwierząt z grupy narażonej na najwyższą dawkę obserwuje się zmiany.
Powinny być zbadane wszystkie zmiany stwierdzone makroskopowo.
Jeżeli stosowana jest grupa towarzysząca, to należy wykonać badania histopatologiczne tych tkanek i narządów,
w których stwierdzono zmiany w grupach narażanych.
247
2. WYNIKI I SPORZ
DZANIE SPRAWOZDANIA
2.1. Wyniki
Należy podać dane indywidualne. Uzyskane wyniki należy zebrać w formie tabel, zamieszczając w nich dla
każdej grupy: liczbę zwierząt na początku doświadczenia, liczbę zwierząt, które padły lub ze względów
humanitarnych zostały zabite w trakcie doświadczenia, oraz datę padnięć lub likwidacji, liczbę zwierząt
z oznakami działania toksycznego, opis obserwowanych objawów z podaniem daty ich wystąpienia i trwania oraz
stopnia nasilenia, liczbę zwierząt, u których stwierdzono uszkodzenia, charakter zmian i odsetek zwierząt
wykazujących każdy typ uszkodzenia.
W miarę potrzeby wyniki liczbowe powinny być ocenione za pomocą odpowiednich, ogólnie uznanych metod
statystycznych. Metody statystyczne i dane, które należy analizować, powinny być wybrane w trakcie planowania
badania.
2.2. Sprawozdanie z badań
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
1) Substancja badana:
- stan fizyczny, czystość, właściwości fizykochemiczne,
- dane identyfikujÄ…ce,
- nośnik (jeśli był stosowany), uzasadnienie wyboru nośnika, o ile inny niż woda;
2) Zwierzęta laboratoryjne:
- stosowany gatunek i szczep,
- liczba wiek i płeć zwierząt,
- z
ródło pochodzenia, warunki przetrzymywania, dieta itp.,
- masa poszczególnych zwierząt na początku badania;
3) Warunki przeprowadzenia badania:
- uzasadnienie wyboru poziomu dawkowania,
- szczegóły dotyczące receptury przygotowania badanej substancji/sporządzenia diety, osiąganego stężenia,
trwałości i jednorodności mieszaniny,
- szczegóły dotyczące podawania badanej substancji,
- rzeczywiste dawki (mg/kg masy ciała/dzień) oraz współczynniki przeliczeniowe stężenia badanej substancji
w diecie/wodzie pitnej na rzeczywiste dawki,
- dane dotyczące jakości paszy i wody;
4) Wyniki:
- masa ciała i zmiany masy ciała,
- spożycie paszy, spożycie wody, gdy jest to konieczne,
- dane dotyczące odpowiedzi na działanie toksyczne w powiązaniu z dawką i płcią, łącznie z objawami
działania toksycznego,
- charakter, nasilenie i czas trwania objawów klinicznych (odwracalne czy nie),
- wyniki badań okulistycznych,
- dane hematologiczne z przynależnymi wartościami podstawowymi,
- dane z biochemii klinicznej z przynależnymi wartościami podstawowymi,
- dane dotyczące masy ciała przed uśmierceniem, masy narządów i stosunku masy narządów do masy ciała,
- opis zmian makroskopowych,
- szczegółowy opis wszystkich zmian histopatologicznych,
- opracowanie statystyczne wyników, jeśli je wykonano;
5) Dyskusję wyników;
6) Wnioski.
248
B.28. TOKSYCZNOŚĆ PODPODPRZEWLEKA
A-NARAŻENIE PRZEZ SKÓR

(90-DNIOWE POWTARZANE NARAŻENIE NA SKÓR
U GRYZONI)
1. METODA
1.1. Wstęp
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.2. Definicje
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.3. Substancje kontrolne
Nie sÄ… stosowane.
1.4. Zasada badania
Badaną substancję nakłada się w stopniowanych dawkach na skórę zwierząt z kilku grup doświadczalnych przez
90 dni, jedna dawka dla jednej grupy. Aby stwierdzić wystąpienie objawów toksycznych, zwierzęta obserwuje
się codziennie przez cały okres nanoszenia substancji. U zwierząt, które padły podczas doświadczenia,
wykonywana jest sekcja, a na końcu doświadczenia sekcję wykonuje się u wszystkich zwierząt, które przeżyły
badanie.
1.5. Kryteria wiarygodności badań
Nie sÄ… stosowane.
1.6. Opis metody badania
1.6.1. Przygotowania
Zwierzęta muszą odbyć co najmniej 5-dniową kwarantannę w warunkach, które będą obowiązywać podczas
doświadczenia. Przed rozpoczęciem badania zdrowe, młode zwierzęta należy wybrać losowo, oznakować
i przydzielić do grup badanych i kontrolnych. U zwierząt badanych, na krótko przed doświadczeniem, sierść
musi zostać ostrzyżona na grzbietowej części tułowia. Może być również zastosowane golenie, ale należy je
wykonać na około 24 godziny przed rozpoczęciem badania. Powtórne strzyżenia lub golenia są zwykle potrzebne
w tygodniowych odstępach. Podczas strzyżenia i golenia należy zachować ostrożność, aby nie skaleczyć skóry.
Dla naniesienia badanej substancji należy oczyścić z sierści nie mniej niż 10% powierzchni ciała. Przy
decydowaniu o wielkości powierzchni, którą pozbawia się sierści, jak i wielkości powierzchni, na którą nanosi
się badaną substancję, należy brać pod uwagę masę ciała zwierząt. Jeżeli badana substancja jest ciałem stałym, to
może być sproszkowana; aby zapewnić dobry kontakt ze skórą, badaną substancję należy zwilżyć wodą lub jeżeli
zachodzi taka potrzeba, odpowiednim nośnikiem. Badane substancje w stanie ciekłym aplikuje się zwykle
w formie nierozcieńczonej. Badane substancje aplikuje się przez 5 do 7 dni w tygodniu.
1.6.2. Warunki doświadczenia
1.6.2.1. Zwierzęta doświadczalne
Do doświadczenia powinny być użyte dorosłe szczury, króliki lub świnki morskie. Można również używać
innych gatunków, ale ich użycie wymaga uzasadnienia. Na początku doświadczenia różnice masy ciała zwierząt
nie powinny przekraczać ą20% wartości średniej. Jeżeli badanie toksyczności podprzewlekłej skórnej jest
wykonywane jako poprzedzające badanie przewlekłe, to w obydwu badaniach należy używać tego samego
gatunku i szczepu zwierzÄ…t.
249
1.6.2.2. Liczba i płeć zwierząt
Dla każdego poziomu dawkowania należy użyć co najmniej 20 zwierząt (10 samców i 10 samic) ze zdrową
skórą. Nie powinny być używane samice ciężarne i takie, które były kojarzone. Jeżeli w trakcie doświadczenia
przewiduje się uśmiercanie zwierząt, to liczba zwierząt powinna być zwiększona o tyle zwierząt, ile przewiduje
się zabić przed zakończeniem doświadczenia. Dodatkowo może być testowana grupa towarzysząca 20 zwierząt
(po 10 zwierząt każdej płci), które w celu stwierdzenia odwracalności, utrzymywania się i opóz
nionego
wystąpienia efektów toksycznych po 90-dniowym podawaniu substancji w wysokiej dawce są następnie
obserwowane przez okres 28 dni po zakończeniu narażenia przez skórę.
1.6.2.3. Poziomy dawkowania
Wymagane są co najmniej 3 poziomy dawkowania substancji badanej, grupa kontrolna z nośnikiem, jeżeli jest on
stosowany. Okres narażenia powinien wynosić co najmniej 6 godzin na dzień. Aplikowanie badanej substancji
powinno się odbywać o tej samej porze każdego dnia, ilość badanej substancji należy korygować w odstępach (1
lub 2 tygodniowych) tak, aby utrzymać stały poziom dawkowania w odniesieniu do masy ciała zwierząt.
Z wyjątkiem aplikowania badanej substancji, zwierzęta grupy kontrolnej należy traktować tak samo jak zwierzęta
grup badanych. Jeżeli stosuje się nośnik ułatwiający dawkowanie, zwierzęta grupy kontrolnej z nośnikiem należy
traktować tak samo jak zwierzęta z grup badanych; powinny one otrzymywać takie same ilości nośnika, jak
zwierzęta grupy doświadczalnej narażanej na badaną substancję w najwyższej dawce. Narażenie na badaną
substancję w najwyższej dawce powinno powodować wystąpienie objawów toksycznych, ale nie powinno
powodować wystąpienia zgonów lub wywoływać tylko nieliczne zgony. Najniższa dawka nie powinna
wywoływać żadnych objawów działania toksycznego. Najniższy poziom dawkowania powinien być wyższy od
przewidywanego poziomu narażenia u ludzi. Przy średnim poziomie dawkowania powinny występować
minimalne, możliwe do stwierdzenia objawy toksyczne. Jeżeli stosowana jest więcej niż jedna dawka pośrednia,
to należy dawki tak dobrać, aby uzyskać stopniowanie efektów toksycznych. Dla prawidłowej oceny wyników
przy niskich i średnich poziomach narażenia, a także w grupach kontrolnych, przypadki padnięć nie powinny być
liczne.
Jeżeli zastosowanie badanej substancji powoduje ostre podrażnienie skóry, to stosowane stężenie należy obniżyć;
może to przy najwyższej stosowanej dawce spowodować zredukowanie lub brak innych objawów toksycznych.
Jeżeli skóra ulegnie poważnemu uszkodzeniu, to może być konieczne wcześniejsze zakończenie doświadczenia
i podjęcie nowych badań przy niższych stężeniach.
1.6.2.4. Badanie wartości dawki granicznej
Jeżeli we wstępnych badaniach narażenia na badaną substancję w dawce 1000 mg/kg lub wyższej,
odpowiadającej prawdopodobnemu lub znanemu narażeniu ludzi, nie stwierdza się objawów działania
toksycznego, to dalsze badanie może być zbędne.
1.6.2.5. Okres obserwacji
W celu stwierdzenia wystąpienia objawów toksycznych, zwierzęta doświadczalne należy obserwować
codziennie. Należy notować czas padnięcia zwierząt, a także czas pojawienia się i ustąpienia objawów
toksycznych.
1.6.3. Opis postępowania
Zwierzęta należy umieszczać w klatkach pojedynczo. Badaną substancję należy nanosić przez 7 dni w tygodniu,
przez 90 dni. W celu stwierdzenia powrotu do normy lub utrzymywania się efektów toksycznych, zwierzęta
w każdej grupie towarzyszącej, przewidzianej do obserwacji tych efektów, należy obserwować przez następne
28 dni, bez aplikowania badanej substancji. Czas ekspozycji powinien wynosić 6 godzin dziennie.
Badaną substancję należy nanosić jednorodną warstwą na powierzchnię, która powinna wynosić około 10% całej
powierzchni ciała. Podczas badania substancji silnie toksycznych pole powierzchni pokrytej może być mniejsze,
ale powinno być ono pokryte cienką jednolitą warstwą substancji badanej.
W czasie narażenia badana substancja powinna być utrzymywana w kontakcie ze skórą przez nałożenie
porowatego gazika i niedrażniącego przylepca. Miejsce badane należy tak zabezpieczyć, aby zwierzę nie mogło
zjeść badanej substancji. Można zastosować ograniczenie ruchów przeciwdziałające zjedzeniu badanej
substancji, ale nie zaleca się całkowitego unieruchomienia.
Po zakończeniu ekspozycji należy usunąć resztki badanej substancji, używając do tego celu wody lub użyć
innych właściwych sposobów oczyszczenia skóry. Należy codziennie obserwować wszystkie zwierzęta, notować
objawy toksyczne, Å‚Ä…cznie z czasem ich wystÄ…pienia, nasileniem i czasem trwania. Obserwacje w klatkach
250
powinny dotyczyć zmian: skóry, sierści, oczu, błon śluzowych, a także układu oddechowego, krążenia,
autonomicznego i ośrodkowego układu nerwowego, aktywności somatomotorycznej i zachowania. Regularne
obserwowanie zwierząt jest konieczne, aby być pewnym, że nie traci się badanych zwierząt z powodu
kanibalizmu, autolizy tkanek lub przemieszania zwierząt. Na końcu doświadczenia u wszystkich zwierząt z grup
doświadczalnych, które przeżyły (z wyjątkiem grupy towarzyszącej), wykonuje się sekcje. Zwierzęta konające
należy zabić i wykonać sekcję.
Zwykle u wszystkich zwierząt, w tym i z grupy kontrolnej wykonuje się następujące badania:
- badania oftalmologiczne; za pomocą oftalmoskopu lub innego odpowiedniego sprzętu należy wykonać
przed rozpoczęciem podawania badanej substancji i przy końcu doświadczenia, najlepiej u wszystkich
zwierząt albo co najmniej u zwierząt narażanych na najwyższą dawkę i u zwierząt grupy kontrolnej. Jeżeli
zostaną stwierdzone zmiany w oczach, wtedy należy przebadać wszystkie zwierzęta,
- hematologiczne; powinny być wykonane na końcu doświadczenia; w skład badań hematologicznych
wchodzi hematokryt, zawartość hemoglobiny, liczba erytrocytów, całkowita liczba białych ciałek krwi i ich
wzór odsetkowy, parametry krzepliwości tj. czas krzepnięcia, czas protrombinowy, czas tromboplastynowy
i liczba płytek krwi,
- biochemiczne; badanie krwi należy wykonać na końcu doświadczenia. Testy biochemiczne, które są uznane
za odpowiednie we wszystkich doświadczeniach, to badania równowagi elektrolitowej, metabolizmu
węglowodanów, funkcji nerek i wątroby. Na wybór specyficznych testów wpływają obserwacje wskazujące
na sposób działania badanej substancji. Sugeruje się następujące oznaczenia: poziom wapnia, fosforu,
chlorków, sodu, potasu, poziom glukozy na czczo (z okresem głodzenia właściwym dla gatunku), aktywność
aminotransferazy alaninowej i aminotransferazy asparginianowej w surowicy krwi, dekarboksylazy
ornitynowej, gamma-glutamylotranspeptydazy, zawartość azotu mocznikowego, stężenie albumin,
kreatyniny we krwi, całkowitej bilirubiny, białka całkowitego w surowicy krwi. Inne oznaczenia, które mogą
być konieczne dla dokonania prawidłowej oceny toksykologicznej, to: oznaczenie profilu lipidowego,
stężenia hormonów, równowagi kwasowo-zasadowej, stężenia methemoglobiny, aktywności
cholinoesterazy. Dodatkowe badania biochemiczne mogą być wykonywane, jeżeli konieczne jest szersze
przebadanie obserwowanych efektów,
- badanie moczu; w zakresie badań wykonywanych rutynowo nie jest wymagane, wymagane jest tylko wtedy,
jeżeli są wskazania poparte oczekiwanymi lub obserwowanymi objawami działania toksycznego.
Jeżeli podstawowe własne wyniki archiwalne są niewystarczające, należy rozważyć możliwość wykonania
oznaczeń parametrów hematologicznych i biochemicznych przed rozpoczęciem narażania.
1.6.3.1. Badania sekcyjne
Wszystkie zwierzęta powinny być poddane pełnej sekcji wykonanej makroskopowo, w której zakres wchodzi
badanie zewnętrznej powierzchni ciała, wszystkich otworów naturalnych ciała oraz jamy czaszkowej, piersiowej
i brzusznej wraz z ich zawartością. Aby uniknąć wysychania, wątrobę, nerki, nadnercza i jądra należy zważyć
natychmiast po wycięciu. Aby umożliwić dalsze badania histopatologiczne następujące narządy i tkanki należy
utrwalić w odpowiednim medium: wszystkie, w których makroskopowo stwierdzono uszkodzenia,
mózgowie-włączając odcinki rdzenia/mostu, kora mózgu i móżdżku, przysadka, tarczyca/przytarczyce, grasica,
(tchawica) i płuca, serce, aorta, ślinianki, wątroba, śledziona, nerki, nadnercza, trzustka, gonady, macica,
dodatkowe narządy układu rozrodczego, pęcherzyk żółciowy (jeśli jest), skóra, przełyk, żołądek, dwunastnica,
jelito czcze, jelito kręte, jelito ślepe, okrężnica, odbytnica, pęcherz moczowy, wybrane węzły chłonne, (gruczoły
mleczne samic), (mięśnie udowe), nerw obwodowy, (mostek ze szpikiem), (oczy), (kość udowa łącznie
z powierzchnią stawową), (rdzeń kręgowy na trzech poziomach szyjnym, śródpiersiowym i lędz
wiowym)
i (gruczoły łzowe). Tkanki umieszczone w nawiasach należy badać tylko wtedy, jeżeli wskazują na to objawy
toksyczne, a także wtedy, gdy mogą być narządami krytycznymi działania toksycznego badanej substancji.
1.6.3.2. Badania histopatologiczne
Należy wykonać pełne badania histologiczne skóry normalnej i narażanej oraz narządów i tkanek zwierząt grupy
kontrolnej i grupy narażanej na badaną substancję w najwyższej dawce.
Należy zbadać wszystkie tkanki, w których makroskopowo stwierdzono uszkodzenia.
Należy zbadać narządy krytyczne w innych grupach doświadczalnych.
Jeżeli używa się szczurów, płuca zwierząt narażanych na badaną substancję w niskich i pośrednich dawkach
należy poddać badaniom histopatologicznym dla stwierdzenia infekcji, co służy właściwej ocenie stanu zdrowia
zwierząt. U zwierząt tych grup dalsze badania histopatologiczne nie są wymagane jako rutynowe, ale muszą być
zawsze przeprowadzone badania histopatologiczne tych narządów, w których wykazano uszkodzenia w grupie
zwierząt narażanych na badaną substancję w wysokiej dawce.
Jeżeli badana jest grupa towarzysząca, badania histopatologiczne powinny być wykonane na tkankach
i narządach, w których stwierdzano działanie toksyczne u zwierząt innych grup narażanych.
251
2. WYNIKI BADAC

Uzyskane wyniki badań należy zebrać w formie tabel, zamieszczając w nich dla każdej grupy, liczbę zwierząt na
początku doświadczenia, liczbę zwierząt, u których stwierdzono uszkodzenie, rodzaj tego uszkodzenia oraz
odsetek zwierząt wykazujących jakikolwiek typ uszkodzenia. Wyniki powinny być analizowane odpowiednimi
metodami statystycznymi. Może być zastosowana każda uznana metoda statystyczna.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. Sprawozdanie z badań
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
- gatunek, szczep, z
ródło pochodzenia zwierząt, warunki środowiskowe, rodzaj paszy itp.,
- warunki przeprowadzenia badania,
- poziomy dawkowania (łącznie z nośnikiem, jeżeli jest używany) i stężenia,
- dane dotyczące efektów toksycznych w zależności od dawki i płci,
- w miarę możliwości poziom dawkowania, przy którym nie występują efekty toksyczne i
inne,
- czas padnięcia zwierząt w trakcie doświadczenia lub informację, czy zwierzęta przeżyły do końca badania,
- opis efektów toksycznych lub innych efektów,
- czas zaobserwowania każdego nietypowego objawu i czas jego trwania,
- dane dotyczące masy ciała i zużycia paszy,
- wyniki badań oftalmologicznych,
- rodzaj przeprowadzonych badań hematologicznych i ich wyniki,
- rodzaj przeprowadzonych badań biochemicznych i ich wyniki (łącznie z wynikami badań moczu, jeżeli były
wykonane),
- wyniki sekcji,
- szczegółowy opis zmian stwierdzonych w badaniach histopatologicznych,
- statystyczne opracowanie uzyskanych wyników,
- omówienie wyników,
- interpretację uzyskanych wyników.
3.2. Ocena i interpretacja
Przeprowadza się na podstawie przepisów Wstępu Ogólnego Części B.
252
B.29. TOKSYCZNOŚĆ PODPRZEWLEKA
A - NARAŻENIE INHALACYJNE
(90-DNIOWE POWTARZANE NARAŻENIE INHALACYJNE U GRYZONI)
1. METODA
1.1. Wstęp
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.2. Definicje
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.3. Substancje kontrolne
Nie sÄ… stosowane.
1.4. Zasada badania
Kilka grup zwierząt doświadczalnych eksponuje się codziennie na badaną substancję w stopniowanych
stężeniach; jedno stężenie stosuje się dla jednej grupy przez 90 dni. Jeżeli stosowany jest nośnik, dla ułatwienia
uzyskania właściwego stężenia badanej substancji w powietrzu, do badań należy dołączyć grupę kontrolną
narażaną na nośnik. W celu stwierdzenia wystąpienia objawów toksycznych, zwierzęta w okresie narażania
należy obserwować codziennie. U zwierząt, które padną podczas doświadczenia, wykonuje się sekcję; na końcu
doświadczenia wszystkie zwierzęta, które przeżyły, są także poddawane sekcji.
1.5. Kryteria wiarygodności badań
Nie sÄ… stosowane.
1.6. Opis metody badania
1.6.1. Przygotowanie
Zwierzęta, przed rozpoczęciem doświadczenia, muszą odbyć co najmniej 5-dniową kwarantannę w takich
warunkach jakie będą obowiązywać podczas badania. Przed rozpoczęciem doświadczenia należy wybrać losowo
młode, zdrowe zwierzęta, oznakować je i przydzielić do grup doświadczalnych i kontrolnych. Jeżeli istnieje
potrzeba, to w celu łatwiejszego uzyskania właściwego stężenia badanej substancji w powietrzu dodaje się do
substancji badanej odpowiedni nośnik. Jeżeli używany jest nośnik lub inne dodatki ułatwiające dawkowanie,
należy upewnić się, że nie mają one działania toksycznego. Jeżeli zachodzi taka potrzeba, można wykorzystywać
dostępne dane archiwalne.
1.6.2. Warunki doświadczenia
1.6.2.1. Zwierzęta doświadczalne
Jeżeli nie ma przeciwwskazań, gatunkiem zalecanym do badań jest szczur. Należy używać młodych, zdrowych
szczurów rasy powszechnie używanej w laboratoriach. W momencie rozpoczynania badań różnice w masie ciała
nie powinny przekraczać ą20% odpowiedniej średniej wartości. Jeżeli badania podprzewlekłe zaplanowane są
jako wstępne dla badań długoterminowych, w obydwu badaniach należy używać tego samego gatunku i tej samej
rasy zwierzÄ…t.
1.6.2.2. Liczba i płeć zwierząt
Co najmniej 20 zwierząt (10 samic i 10 samców) powinno być użyte dla każdego stężenia oznaczonego
w powietrzu. Nie należy używać samic, które były kojarzone i samic ciężarnych. Jeżeli w trakcie doświadczenia
przewiduje się uśmiercanie zwierząt, to liczba zwierząt powinna być zwiększona o tyle zwierząt, ile planuje się
zabić przed zakończeniem badań. Dla oceny odwracalności zmian, ich trwałości lub opóz
nionego pojawienia siÄ™
efektów toksycznych, dodatkowa, grupa 20 zwierząt (po 10 z każdej płci) może być narażana na wysokie
stężenie przez 90 dni i obserwowana przez dalsze 28 dni po zakończeniu ekspozycji.
1.6.2.3. Stężenia podczas narażenia inhalacyjnego
253
Wymagane są co najmniej 3 grupy zwierząt otrzymujące substancję w trzech stężeniach, grupa kontrolna lub
grupa kontrolna z nośnikiem (stężenie nośnika odpowiada stężeniu, które jest stosowane przy najwyższym
poziomie narażenia), jeżeli stosuje się nośnik. Ze zwierzętami grupy kontrolnej należy postępować identycznie
jak ze zwierzętami z grup doświadczalnych. Narażenie na najwyższe stężenie powinno wywoływać objawy
działania toksycznego, ale nie powodować zgonów lub powodować tylko nieliczne zgony. Najmniejsze stężenie
nie powinno powodować wystąpienia objawów działania toksycznego. W przypadku gdy istnieje możliwość
oszacowania narażenia u ludzi, najniższa dawka użyta do doświadczeń powinna przekraczać tę wartość
szacunkową. Najlepiej jest, gdy stężenia pośrednie to takie, które powodują minimalne, możliwe do stwierdzenia
działanie toksyczne. Jeżeli stosuje się więcej niż jedno stężenie pośrednie, to stężenia powinny być tak dobrane,
aby było możliwe stwierdzenie stopniowania działania toksycznego. Aby ocena uzyskanych wyników była
prawidłowa zarówno w grupach kontrolnych, jak i w grupach otrzymujących pośrednie dawki, przypadki
śmiertelne powinny być nieliczne.
1.6.2.4. Czas ekspozycji
Codzienna ekspozycja powinna trwać 6 godzin od momentu uzyskania prawidłowego stężenia. Jeżeli istnieje
taka potrzeba, można stosować inne czasy trwania ekspozycji.
1.6.2.5. Wyposażenie
Zwierzęta powinny być badane przy wykorzystaniu aparatury inhalacyjnej zapewniającej dynamiczny przepływ
powietrza z co najmniej 12 wymianami/godzinę oraz odpowiednią zawartość tlenu i równomierny rozkład
powietrza. Jeżeli używana jest komora, to jej budowa powinna maksymalnie zmniejszać efekt zagęszczenia
zwierząt i zapewnić jak najlepsze narażenie na badaną substancję. Ogólna zasada zapewniająca stabilność
atmosfery w komorze, to zagwarantowanie, że całkowita objętość badanych zwierząt nie przekracza 5%
objętości stosowanej komory. Mogą być używane też urządzenia zapewniające narażenie przez układ nos-pysk
lub przez całą część twarzową, a także indywidualne komory inhalacyjne z możliwością narażenia na całe ciało;
pierwsze dwie zmniejszają możliwość wchłaniania do organizmu badanej substancji innymi drogami.
1.6.2.6. Okres obserwacji
W celu stwierdzenia występowania objawów toksycznych, zwierzęta doświadczalne powinny być obserwowane
codziennie podczas całego okresu narażenia i okresu powrotu do zdrowia. Powinno się notować czas padnięcia
i czas wystąpienia objawów toksycznych oraz ich ustąpienia.
1.6.3. Opis postępowania
Zwierzęta należy eksponować na badaną substancję codziennie, 5-7 dni/tydzień przez okres 90 dni. Zwierzęta
każdej grupy towarzyszącej przewidzianej dla dokonania uzupełniających obserwacji powinny być trzymane
przez dalsze 28 dni bez narażenia, w celu stwierdzenia powrotu do zdrowia lub utrzymywania się efektów
toksycznych. Temperatura, w jakiej badanie jest przeprowadzane, powinna wynosić 22Ä…3°C, wilgotność
względna powinna być utrzymywana między 30-70%, jednak w pewnych przypadkach (np. badanie aerozoli)
może to być praktycznie niemożliwe. Pasza i woda powinny być niedostępne dla zwierząt w czasie trwania
ekspozycji.
Należy używać dynamicznego systemu inhalacyjnego z odpowiednim systemem analitycznym do pomiaru
stężenia badanej substancji w komorze. Dla ustalenia odpowiednich stężeń ekspozycyjnych zaleca się testowanie
wstępne. Przepływ powietrza powinien być tak skorygowany, aby zapewnić jednakowe warunki w całej komorze.
System powinien zapewniać szybkie uzyskanie stabilnych warunków ekspozycji.
Powinny być wykonane następujące pomiary lub monitoring:
- szybkości przepływu powietrza (w sposób ciągły),
- rzeczywiste stężenia badanej substancji mierzone w strefie oddychania. W trakcie dziennego okresu
ekspozycji stężenie nie powinno się różnić więcej niż o ą15% od wartości średniej. Jednakże w przypadku
pyłów i aerozoli ten poziom może być niemożliwy do uzyskania i wtedy możliwy jest do zaakceptowania
szerszy zakres rozrzutu. W czasie trwania całego doświadczenia, stężenie powinno być możliwie codziennie
stałe. Podczas rozruchu systemu generującego należy przeprowadzić analizę wielkości cząstek, aby ustalić
stabilność stężeń aerozolu. Podczas ekspozycji, analizy należy przeprowadzać, tak często, jak to jest
konieczne dla oznaczenia rozkładu wielkości cząstek,
- temperatury i wilgotności.
Podczas i po narażeniu dokonuje się systematycznych obserwacji i ich zapisów; powinny być dokonywane zapisy
indywidualne dla każdego zwierzęcia. Wszystkie zwierzęta powinny być obserwowane codziennie a objawy
254
działania toksycznego zapisywane łącznie z czasem ich wystąpienia, nasilenia i czasem trwania. Obserwacje
w klatkach powinny dotyczyć zmian skóry i sierści, oczu, błon śluzowych, układu oddechowego, krążenia,
autonomicznego i ośrodkowego układu nerwowego, aktywności somatomotorycznej i zachowania. Pomiarów
masy ciała należy dokonywać raz w tygodniu. Zaleca się także cotygodniowy pomiar spożycia paszy. Regularne
obserwacje zwierząt są konieczne, aby być pewnym, że utrata zwierzęcia w badaniu nie jest spowodowana
kanibalizmem, autolizą tkanek lub pomieszaniem zwierząt. Na końcu doświadczenia wszystkie zwierzęta (z
wyjątkiem grup towarzyszących) są poddawane sekcji. Zwierzęta konające należy usunąć, zabić i wykonać
sekcjÄ™.
Na końcu doświadczenia należy wykonać następujące badania u wszystkich zwierząt, łącznie z kontrolnymi:
- badania oftalmologiczne; za pomocą oftalmoskopu lub innego odpowiedniego sprzętu należy wykonać
przed rozpoczęciem podawania badanej substancji i przy końcu doświadczenia, najlepiej u wszystkich
zwierząt albo przynajmniej u zwierząt narażanych na najwyższą dawkę i u zwierząt grupy kontrolnej. Jeżeli
zostaną stwierdzone zmiany w oczach, wtedy należy przebadać wszystkie zwierzęta,
- hematologiczne; powinny być wykonane na końcu doświadczenia; w skład badań hematologicznych
wchodzi hematokryt, zawartość hemoglobiny, liczba erytrocytów, całkowita liczba białych ciałek krwi i ich
wzór odsetkowy, parametry krzepliwości, tj. czas krzepnięcia, czas protrombinowy, czas tromboplastynowy
i liczba płytek krwi,
- biochemiczne badanie krwi należy wykonać na końcu doświadczenia. Testy biochemiczne, które są uznane
za odpowiednie we wszystkich doświadczeniach to badania równowagi elektrolitowej, metabolizmu
węglowodanów, funkcji nerek i wątroby. Na wybór specyficznych testów wpływają obserwacje wskazujące
na sposób działania badanej substancji. Sugeruje się następujące oznaczenia: poziom wapnia, fosforu,
chlorków, sodu, potasu, poziom glukozy na czczo (z okresem głodzenia właściwym dla gatunku), aktywność
aminotransferazy alaninowej i aminotransferazy asparginianowej w surowicy krwi, dekarboksylazy
ornitynowej, gamma-glutamylotranspeptydazy, zawartość azotu mocznikowego, stężenia albumin,
kreatyniny we krwi, całkowitej bilirubiny, białka całkowitego w surowicy krwi. Inne oznaczenia, które mogą
być konieczne dla dokonania prawidłowej oceny toksykologicznej to: oznaczenie profilu lipidowego,
stężenia hormonów, równowagi kwasowo-zasadowej, stężenia methemoglobiny, aktywności
cholinoesterazy.
Dodatkowe badania biochemiczne mogą być wykonywane, jeżeli konieczne jest szersze przebadanie
obserwowanych efektów.
Badanie moczu; w zakresie badań wykonywanych rutynowo nie jest wymagane, wymagane jest tylko wtedy,
jeżeli są wskazania poparte oczekiwanymi lub obserwowanymi objawami działania toksycznego.
Jeżeli podstawowe własne wyniki archiwalne są niewystarczające, należy rozważyć możliwość wykonania
oznaczeń parametrów hematologicznych i biochemicznych przed rozpoczęciem narażania.
1.6.3.1. Badania sekcyjne
Wszystkie zwierzęta powinny być poddane pełnej sekcji wykonanej makroskopowo, w której zakres wchodzi
badanie zewnętrznej powierzchni ciała, wszystkich otworów naturalnych ciała oraz jamy czaszkowej, piersiowej
i brzusznej wraz z ich zawartością. Aby uniknąć wysychania, wątrobę, nerki, nadnercza i jądra należy zważyć
natychmiast po wycięciu. Aby umożliwić dalsze badania histopatologiczne, następujące narządy i tkanki należy
utrwalić w odpowiednim medium: wszystkie, w których makroskopowo stwierdzono uszkodzenia, mózgowie -
włączając odcinki rdzenia/mostu, kora mózgu i móżdżku, przysadka, tarczyca/przytarczyce, grasica, (tchawica)
i płuca, serce, aorta, ślinianki, wątroba, śledziona, nerki, nadnercza, trzustka, gonady, macica, dodatkowe
narządy układu rozrodczego, pęcherzyk żółciowy (jeśli jest), skóra, przełyk, żołądek, dwunastnica, jelito czcze,
jelito kręte, jelito ślepe, okrężnica, odbytnica, pęcherz moczowy, wybrane węzły chłonne, (gruczoły mleczne
samic), (mięśnie udowe), nerw obwodowy, (mostek ze szpikiem), (oczy), (kość udowa łącznie z powierzchnią
stawową), (rdzeń kręgowy na trzech poziomach szyjnym, śródpiersiowym i lędz
wiowym) i (gruczoły łzowe).
Tkanki umieszczone w nawiasach należy badać tylko wtedy, jeżeli wskazują na to objawy toksyczne, a także
wtedy, gdy mogą być narządami krytycznymi działania toksycznego badanej substancji.
1.6.3.2. Badania histopatologiczne
Należy wykonać pełne badania histopatologiczne układu oddechowego, innych narządów i tkanek zwierząt grupy
kontrolnej i grupy narażanej na badaną substancję w najwyższej dawce.
Należy zbadać wszystkie tkanki, w których makroskopowo stwierdzono uszkodzenia.
Należy zbadać narządy krytyczne w innych grupach doświadczalnych.
Płuca zwierząt narażanych na badaną substancję w niskich i średnich dawkach należy poddać badaniom
histopatologicznym w celu właściwej oceny stanu zdrowia zwierząt. U zwierząt z tych grup, dalsze badania
histopatologiczne nie są wymagane w badaniach wykonywanych rutynowo, ale muszą być zawsze
255
przeprowadzone badania histopatologiczne tych narządów, które wykazują uszkodzenia w grupie zwierząt
narażanych na badaną substancję w wysokiej dawce.
Jeżeli badana jest grupa towarzysząca, badania histopatologiczne powinny być wykonane na tkankach
i narządach, w których stwierdzano działanie toksyczne u zwierząt innych grup narażanych.
2. WYNIKI BADAC

Wyniki badań należy zebrać w formie tabel, w których powinna być umieszczona dla każdej badanej grupy:
liczba zwierząt na początku doświadczenia, liczba zwierząt z uszkodzeniami, rodzaj uszkodzenia i odsetek
zwierząt wykazujących każdy rodzaj uszkodzenia. Wszystkie uzyskane wyniki należy opracować za pomocą
właściwych metod statystycznych. Można użyć każdej powszechnie uznanej metody statystycznej.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. Sprawozdanie z badań
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
1) Gatunek, szczep, z
ródło pochodzenia zwierząt, warunki środowiskowe, rodzaj paszy itp.;
2) Warunki przeprowadzenia badania:
a) opis aparatury ekspozycyjnej: Å‚Ä…cznie z budowÄ…, typem, rozmiarami, z
ródłem powietrza, sposobem
dozowania pyłów i aerozoli, metodą klimatyzacji powietrza, sposobem umieszczenia zwierząt w komorze,
jeżeli taka jest używana. Należy opisać urządzenia do mierzenia temperatury, wilgotności, i tam gdzie to
właściwe, urządzenie do pomiaru stabilności stężeń aerozolu i rozkładu wielkości jego cząstek,
b) dane dotyczące narażenia: powinny być zebrane w tabelach, w postaci wartości średnich z pomiarem
zmienności (tj. odchylenia standardowego) oraz powinny, jeżeli to możliwe, zawierać:
- szybkość przepływu powietrza przez system inhalacyjny,
- temperaturę i wilgotność powietrza,
- nominalne stężenia (całkowita ilość badanej substancji wprowadzona do aparatury inhalacyjnej
i podzielona przez objętość powietrza),
- rodzaj nośnika, jeżeli był użyty,
- rzeczywiste stężenie w strefie oddechowej zwierząt doświadczalnych,
- medianę rozmiarów cząstek aerozolu;
3) Efekty toksyczne w zależności od płci i stężenia;
4) Wielkość poziomu narażenia, przy którym nie stwierdzono występowania żadnych efektów (NOEL);
5) Czas padnięcia zwierząt podczas doświadczenia lub w okresie obserwacji po zakończeniu badań (czas
przeprowadzania sekcji);
6) Opis efektów toksycznych i innych efektów;
7) Czas zaobserwowania każdego nietypowego objawu i jego przebieg;
8) Dane dotyczące masy ciała i spożycia paszy;
9) Wyniki badań oftalmologicznych;
10) Wykonane badania hematologiczne i ich wyniki;
11) Wykonane badania biochemiczne i ich wyniki (Å‚Ä…cznie w wynikami analizy moczu);
12) Wyniki sekcji;
13) Szczegółowy opis wszystkich zmian histopatologicznych;
14) Statystyczne opracowanie wyników, jeżeli to możliwe;
15) Omówienie wyników;
16) Interpretację wyników.
3.2. Ocena i interpretacja
Przeprowadza się na podstawie przepisów Wstępu Ogólnego Części B.
256
B.30. TOKSYCZNOŚĆ PRZEWLEKA
A
1. METODA
1.1. Wstęp
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.2. Definicje
Zamieszczono we Wstępie Ogólnym Części B.
1.3. Substancje kontrolne
Nie sÄ… stosowane.
1.4. Zasada badania
Substancja badana jest podawana odpowiedniÄ… drogÄ…, zwykle przez siedem dni w tygodniu, kilku grupom
zwierząt, przez większą część ich przewidywanego okresu przeżycia; jeden poziom narażenia (dawka) na grupę.
W czasie i po narażeniu na badaną substancję, zwierzęta doświadczalne są codziennie obserwowane w celu
wykrycia objawów działania toksycznego.
1.5. Kryteria wiarygodności badań
Nie sÄ… stosowane.
1.6. Opis metody badawczej
1.6.1. Przygotowanie
Co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem doświadczenia, zwierzęta muszą być umieszczone w takich warunkach,
jakie będą obowiązywały podczas eksperymentu. Przed rozpoczęciem badania zdrowe, młode zwierzęta należy
rozdzielić w sposób losowy do grup eksponowanych i kontrolnych.
1.6.2. Warunki badania
1.6.2.1. Zwierzęta doświadczalne
Preferowanym gatunkiem zwierząt jest szczur. W zależności od wyników wcześniej przeprowadzonych badań
mogą być zastosowane również inne gatunki (gryzonie lub zwierzęta, które nie są gryzoniami). Do badania
powinny być używane szczepy pospolitych zdrowych, młodych zwierząt, a dawkowanie substancji powinno
rozpocząć się w możliwie najkrótszym okresie po usamodzielnieniu się zwierząt (po zakończeniu okresu
karmienia przez matki).
Różnice w masie ciała zwierząt na początku doświadczenia nie powinny przekraczać ą20% odpowiedniej
wartości średniej dla każdej płci. Gdy przed badaniem długoterminowym przeprowadzone jest badanie
podprzewlekłe (narażenia drogą pokarmową), to w obydwu tych badaniach powinny być stosowane zwierzęta
tego samego gatunku i szczepu.
1.6.2.2. Liczba i płeć zwierząt
W przypadku gryzoni na każdą dawkę i grupę kontrolną powinno być użyte przynajmniej 40 zwierząt (20 samic
i 20 samców). Samice powinny być dziewicze (niekojarzone), nieciężarne. Jeśli w trakcie trwania eksperymentu
zaplanowano badanie narządów wewnętrznych określonej liczby zwierząt, wówczas o tę liczbę należy zwiększyć
liczebność zwierząt zaplanowanych do badania.
W przypadku zwierząt, które nie są gryzoniami może być użyta mniejsza liczba zwierząt, lecz wymagane są
grupy zawierające przynajmniej po cztery zwierzęta obydwu płci.
1.6.2.3. Poziomy dawkowania i częstotliwość podawania substancji
257
Powinny być stosowane przynajmniej trzy grupy zwierząt otrzymujących substancję w trzech poziomach
dawkowania i równocześnie grupa kontrolna. Najwyższa dawka powinna powodować powstanie wyraz
nych
objawów działania toksycznego, jednak bez zwiększonej śmiertelności zwierząt. Najmniejsza dawka nie powinna
powodować żadnych efektów działania toksycznego.
Dawki(dawka) pośrednie powinny być ustalone w zakresie środkowym pomiędzy najwyższą i najniższą dawką.
W celu dobrania poziomów dawek powinno brać się pod uwagę wyniki wcześniejszych badań działania
toksycznego.
Zazwyczaj narażenie zwierząt wykonuje się codziennie. Jeśli związek podawany jest w wodzie do picia lub
w paszy, wówczas zwierzęta powinny mieć do nich dostęp przez całą dobę.
1.6.2.4. Grupy kontrolne
Równolegle powinna być stosowana grupa kontrolna, pod każdym względem identyczna z grupami
eksponowanymi, z wyjątkiem narażenia na badaną substancję.
W szczególnych przypadkach, takich jak narażenie inhalacyjne na aerozol lub stosowanie środka emulgującego
o nieokreślonej aktywności biologicznej podczas podawania substancji drogą pokarmową, powinna być
równolegle stosowana ujemna grupa kontrolna. Ujemna grupa kontrolna jest traktowana w taki sam sposób jak
grupy badane z wyjątkiem tego, że zwierzęta nie są narażane na badaną substancję lub jakikolwiek nośnik
(emulgator).
1.6.2.5. Droga podania badanej substancji
Stosowane są głównie dwie drogi podawania substancji: pokarmowa i inhalacyjna. Wybór drogi podawania
zależy od właściwości fizycznych i chemicznych badanej substancji i przypuszczalnej drogi narażenia ludzi.
Narażenie przez skórę stwarza poważne problemy praktyczne. Przewlekłe, toksyczne działanie układowe,
spowodowane wchłanianiem przez skórę, zwykle może być przewidziane na podstawie wyników innych badań
np. po podaniu do żołądka i na podstawie znajomości wielkości wchłaniania przez skórę z poprzednio
przeprowadzonych badań działania toksycznego.
Podawanie substancji drogÄ… pokarmowÄ…
Gdy badana substancja wchłaniana jest z przewodu pokarmowego i jeśli droga pokarmowa jest jedną z dróg,
przez którą mogą być narażeni ludzie, wtedy preferowany jest układ pokarmowy, jeśli nie ma innych wskazań.
Zwierzęta mogą otrzymywać badaną substancję w paszy, rozpuszczoną w wodzie do picia lub przez podanie
w kapsułce.
Substancję należy podawać codziennie przez 7 dni w tygodniu, dawkowanie przez 5 dni w tygodniu może
prowadzić do zmniejszenia lub cofnięcia działania toksycznego w okresie przerwy w narażeniu i w ten sposób
wpływać na wynik i ocenę badań. Jednakże, z praktycznego punktu widzenia, dawkowanie przez 5 dni
w tygodniu jest do zaakceptowania.
Narażenie inhalacyjne na badaną substancję
Ponieważ narażenie inhalacyjne stwarza techniczne problemy z powodu większej jego złożoności niż inne drogi
podawania, przedstawiono tutaj więcej szczegółowych zasad tego sposobu narażenia. Powinno się także wziąć
pod uwagę, że podanie dotchawicze może stanowić, w specyficznych sytuacjach, ważną alternatywę narażenia
inhalacyjnego.
Przewlekłe narażenia są wykonywane zazwyczaj w celu odzwierciedlenia narażenia ludzi. Po ustaleniu stężenia
w komorze, zwierzęta eksponowane są w ciągu dnia przez 6 godzin, 5 dni w tygodniu (ekspozycja przerywana)
lub w sposób podobny do narażenia środowiskowego, przez 22 do 24 godzin dziennie przez 7 dni w tygodniu
(ekspozycja ciągła) z około godzinną przerwą dziennie na karmienie zwierząt (zawsze o tej samej porze) i w celu
oczyszczenia komory. W obydwu przypadkach, zwierzęta są zwykle eksponowane na badaną substancję
w określonych stężeniach. Podstawowa różnica pomiędzy ekspozycją przerywaną i ciągłą jest taka, że
w przypadku tej pierwszej istnieje 17-18-godzinny, a nawet dłuższy w okresie weekendów, okres bez narażenia,
podczas którego efekty codziennego narażenia mogą ustąpić.
Wybór ekspozycji przerywanej lub ciągłej zależy od celu badania i od przewidywanego sposobu narażenia ludzi.
Należy wziąć pod uwagę pewne pojawiające się trudności techniczne. Na przykład, zalety narażenia ciągłego dla
symulacji warunków narażenia środowiskowego mogą być równoważone utrudnieniem związanym
z koniecznością karmienia i pojenia podczas narażenia oraz wymaganiami technicznymi związanymi z bardziej
skomplikowanymi (i rzetelnymi) technikami wytwarzania par i aerozoli oraz potrzebami monitoringu.
1.6.2.6. Komory inhalacyjne
258
Zwierzęta powinny być narażane w komorach inhalacyjnych zaprojektowanych w ten sposób, aby utrzymać
dynamiczny przepływ powietrza zapewniający przynajmniej 12 wymian na godzinę, w celu zapewnienia
dostatecznej zawartości tlenu i dokładnego wymieszania atmosfery komory. Komory dla zwierząt kontrolnych
i narażanych powinny być identycznie skonstruowane tak, aby warunki w nich były porównywalne pod każdym
względem, z wyjątkiem narażenia na badaną substancję. Wewnątrz komory utrzymuje się zwykle lekkie
podciśnienie, w celu zabezpieczenia przed ulatnianiem się badanej substancji do atmosfery pomieszczenia,
w którym znajdują się komory. Komory powinny być zaprojektowane na określoną liczbę zwierząt testowanych.
Zwykle, aby zapewnić stabilną atmosferę w komorze, całkowita objętość zajmowana przez badane zwierzęta nie
powinna przekraczać 5% objętości komory.
Pomiary lub monitorowanie powinny być wykonywane w następujący sposób:
- przepływ powietrza: zaleca się, aby prędkość przepływu powietrza przez komorę była monitorowana
w sposób ciągły,
- stężenie: w czasie dziennej ekspozycji stężenie badanej substancji nie powinno odbiegać więcej niż o ą15%
od wartości średniej,
- temperatura i wilgotność: dla gryzoni temperatura powinna być utrzymywana na poziomie 22Ä…2°C,
a wilgotność powietrza w komorze na poziomie od 30 do 70%, z wyjątkiem sytuacji kiedy w atmosferze
komory stosowana jest woda do rozpylenia badanej substancji. Oba te parametry powinny być
monitorowane w sposób ciągły,
- pomiary wielkości cząstek: rozkład wielkości cząstek aerozoli ciekłych lub stałych powinien być oznaczony
w atmosferze komory inhalacyjnej. Cząstki aerozolu powinny mieć rozmiar cząstek respirabilnych dla
badanych zwierząt. Próbki aerozolu z komory powinny być pobierane w strefie oddychania zwierząt. Próbki
aerozolu powinny odzwierciedlać rozkład rozmiarów cząstek, na które zwierzęta są eksponowane, i być
obliczone metodami grawimetrycznymi dla całego aerozolu, nawet kiedy większość cząstek nie stanowi
frakcji respirabilnej. Analizy wielkości cząstek powinny być wykonywane często w czasie uruchamiania
systemu dozowania, w celu upewnienia się o stabilności wielkości cząstek aerozolu. W czasie ekspozycji
należy również pomiary te powtarzać dość często w celu właściwego określenia rozkładu rozmiarów
cząstek, na które były eksponowane zwierzęta.
1.6.3. Czas trwania badania
Czas narażania powinien wynosić przynajmniej 12 miesięcy.
1.6.4. Opis postępowania
1.6.4.1. Obserwacja
Przynajmniej raz dziennie powinny być przeprowadzone staranne obserwacje kliniczne. Codziennie powinny być
wykonywane dodatkowe obserwacje zwierząt oraz powinno się podejmować działania w celu zabezpieczenia
materiału zwierzęcego dla badań, na przykład, usunięcie i włożenie do lodówki ciał zwierząt, które padły, oraz
odizolowanie i poddanie sekcji zwierząt słabych lub konających. Powinny być również wykonywane dokładne
obserwacje w celu wykrycia pojawienia się i rozwoju objawów toksycznych, jak również w celu
zminimalizowania strat spowodowanych chorobą, autolizą (tkanek padłych zwierząt) lub kanibalizmem.
U wszystkich zwierząt powinny być notowane objawy kliniczne, łącznie ze zmianami neurologicznymi
i uszkodzeniami oczu, w tym także zgony zwierząt. Powinien być notowany czas pojawienia się i rozwoju
objawów toksycznego działania, łącznie z podejrzeniem rozwoju zmian nowotworowych.
Raz w tygodniu, w okresie pierwszych 13 tygodni od momentu rozpoczęcia badania, a następnie przynajmniej
raz na 4 tygodnie, wszystkie zwierzęta powinny być indywidualnie ważone. Spożycie paszy powinno być
określane co tydzień w czasie pierwszych 13 tygodni od rozpoczęcia badania, a następnie, co trzy miesiące,
dopóki stan zdrowia lub zmiany masy ciała nie podyktują innego sposobu postępowania.
1.6.4.2. Badania hematologiczne
Badanie hematologiczne (np. zawartość hemoglobiny, hematokryt, liczba czerwonych krwinek, liczba białych
krwinek, liczba płytek krwi i inne parametry krzepnięcia krwi) powinno być wykonywane na próbkach krwi
pobranych od wszystkich zwierząt, które nie są gryzoniami i 10 szczurów z każdej płci, po trzech i sześciu
miesiącach, a następnie w odstępach około sześciomiesięcznych i na koniec doświadczenia. Jeśli jest to możliwe,
próbki krwi powinny być pobrane od tych samych szczurów, u których pobierano je w poszczególnych okresach.
Dodatkowo, dla innych gatunków zwierząt niegryzoni powinno być przeprowadzone badanie krwi przed
rozpoczęciem badania.
259
Jeśli na podstawie obserwacji klinicznych stwierdza się pogorszenie stanu zdrowia zwierząt w czasie trwania
badania, wówczas należy przeprowadzić badanie obrazu krwi u tych zwierząt.
Badanie obrazu krwi jest wykonywane w grupie zwierząt narażanych na badaną substancję w najwyższej dawce
i u zwierząt kontrolnych. Badania obrazu krwi u zwierząt eksponowanych na badaną substancję w niższych
dawkach są przeprowadzane tylko wtedy, gdy są duże rozbieżności pomiędzy grupą zwierząt z najwyższej dawki
a grupą kontrolną lub jeśli na taką potrzebę wskazuje istnienie zmian patologicznych.
1.6.4.3. Analiza moczu
Do analizy powinny być pobierane próbki moczu od wszystkich zwierząt-niegryzoni i od 10 szczurów każdej
płci ze wszystkich grup. Jeśli to możliwe, próbki moczu należy pobierać w tych samych okresach co krew do
badań hematologicznych i od tego samego szczura. Powinny być wykonane następujące oznaczenia w moczu,
zarówno u każdego zwierzęcia, jak i pobranego łącznie od grupy zwierząt każdej płci, w danej grupie
doświadczalnej w przypadku gryzoni:
- ogólny wygląd: objętość i ciężar właściwy moczu poszczególnych zwierząt,
- zawartości białka, glukozy, ketonów, krwinek czerwonych (oznaczenie półilościowe),
- mikroskopowe badanie osadu (oznaczenie półilościowe).
1.6.4.4. Badania biochemiczne
W odstępach około sześciomiesięcznych i na zakończenie badań, powinny zostać pobrane próbki krwi do badań
biochemicznych od wszystkich niegryzoni i od 10 szczurów każdej płci ze wszystkich grup, i w miarę
możliwości do każdego badania od tych samych szczurów. Dodatkowo przed rozpoczęciem badania powinny
być zbadane próbki krwi pobrane od niegryzoni. W osoczu krwi wykonuje się następujące oznaczenia:
- zawartość białka ogólnego,
- zawartość albumin,
- testy czynnościowe wątroby takie, jak aktywność fosfatazy zasadowej, aktywność aminotransferazy
alaninowej (AlAT), aminotransferazy asparaginowej (AspAT), aktywność gamma-glutamylotranspeptydazy
i dekarboksylazy ornitynowej,
- metabolizmu węglowodanów np. zawartość glukozy we krwi zwierząt głodzonych,
- testy pozwalające ocenić czynność nerek np. zawartość mocznika we krwi.
1.6.4.5. Badania sekcyjne
Pełna ocena makroskopowa podczas sekcji zwierząt powinna być przeprowadzona na wszystkich zwierzętach,
łącznie z tymi, które padły w czasie eksperymentu lub były zabite z powodu złego stanu zdrowia. Przed sekcją,
od wszystkich zwierząt powinny być pobrane próbki krwi w celu przeprowadzenia szczegółowych badań.
Wszystkie widoczne nieuzbrojonym okiem uszkodzenia narządów wewnętrznych, guzy, które mogą być
nowotworami, powinny być odpowiednio zabezpieczone. Powinno pobrać się odpowiednie próbki do badań
mikroskopowych, w celu porównania z obserwacjami makroskopowymi.
Wszystkie narządy i tkanki powinny być odpowiednio zabezpieczone do badań histopatologicznych. Zwykle
dotyczy to następujących narządów i tkanek: mózgowie 1) (rdzeń przedłużony/most, kora móżdżku, kora mózgu),
przysadka mózgowa, tarczyca (łącznie z gruczołami przytarczycznymi), grasica, płuca (łącznie z tchawicą),
serce, aorta, ślinianki, wątroba 1), śledziona, nerki 1), nadnercza 1), przełyk, żołądek, dwunastnica, jelito czcze,
jelito kręte, jelito ślepe, okrężnica, odbytnica, macica, pęcherz moczowy, węzły chłonne, trzustka, gonady 1),
dodatkowe narządy płciowe, gruczoły mleczne samic, skóra, mięśnie, nerw obwodowy, rdzeń kręgowy (odcinki:
szyjny, piersiowy, lędz
wiowy), mostek ze szpikiem kostnym, kość udowa (łącznie ze stawem) i oczy. Najlepszym
sposobem zabezpieczenia płuc i pęcherza moczowego jest wypełnienie tych tkanek utrwalaczem; w badaniach
inhalacyjnych, perfuzja płuc jest podstawowym sposobem ich zabezpieczenia w celu wykonania właściwych
badań histopatologicznych. W specjalnych badaniach takich jak narażenie inhalacyjne powinien być zbadany
cały układ oddechowy łącznie z nosem, gardłem i krtanią.
Jeśli zostały przeprowadzone inne badania kliniczne, wówczas uzyskane informacje powinny być dostępne przed
badaniem mikroskopowym narządów, gdyż mogą one dać istotne wskazówki dla patologów.
1.6.4.6. Badania histopatologiczne
1 )
Te narządy powinny być pobrane i ważone, od 10 zwierząt każdej płci z każdej grupy gryzoni oraz od wszystkich
zwierząt-niegryzoni, plus tarczyca (z gruczołem przytarczycznym) od wszystkich zwierząt niegryzoni.
260
Wszystkie widoczne nieuzbrojonym okiem zmiany, szczególnie guzy lub inne uszkodzenia występujące
w poszczególnych narządach powinny być zbadane mikroskopowo. Dodatkowo zalecane są następujące
procedury:
1) Badanie mikroskopowe wszystkich zabezpieczonych narządów i tkanek z pełnym opisem stwierdzonych
uszkodzeń:
- u wszystkich zwierząt, które padły lub były zabite w czasie trwania eksperymentu,
- u wszystkich zwierzÄ…t w grupach otrzymujÄ…cych wysokie dawki zwiÄ…zku i w grupach kontrolnych;
2) U zwierząt otrzymujących niższe dawki substancji badane są także te narządy lub tkanki, których nietypowy
wygląd spowodowany jest/lub prawdopodobnie mógł być spowodowany przez badaną substancję;
3) Gdy wyniki eksperymentu jednoznacznie wskazują na znaczne skrócenie normalnego okresu życia zwierząt,
lub na indukcję objawów, które mogą wpłynąć na charakter odpowiedzi toksycznej, wówczas powinny być
zbadane narządy zwierząt, które otrzymały kolejną niższą dawkę substancji w sposób opisany powyżej;
4) Dla prawidłowej oceny istotności zmian obserwowanych u zwierząt narażanych niezbędna jest informacja
dotycząca częstości zmian normalnie występujących u badanego szczepu zwierząt w tych samych warunkach
laboratoryjnych, tj. dane archiwalne na temat tego gatunku/szczepu.
2. WYNIKI
Wyniki powinny być zebrane w formie tabeli z wykazem liczby zwierząt w każdej badanej grupie w momencie
rozpoczęcia eksperymentu, liczby zwierząt ze zmianami i odsetek zwierząt wykazujących jakikolwiek rodzaj
zmian. Ocena wyników powinna być wykonana za pomocą odpowiedniej metody statystycznej. Może być
zastosowana każda uznana metoda statystyczna.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. Sprawozdanie z badań
W sprawozdaniu zamieszcza się, z uwzględnieniem zakresu badań, następujące informacje:
1) Gatunek zwierząt, szczep, pochodzenie, warunki środowiskowe, rodzaj paszy;
2) Warunki badania:
a) opis aparatury stosowanej do narażania - łącznie z jej schematem, typem, wymiarami, z
ródłem powietrza,
systemem dozowania pyłu i aerozolu, metodą klimatyzacji powietrza w komorze, metodą usuwania powietrza
wylotowego i metodą umieszczenia zwierząt w komorze inhalacyjnej w czasie eksperymentu. Powinno być
również opisane wyposażenie do pomiaru temperatury, wilgotności, i oczywiście jeśli to konieczne,
stabilności stężenia aerozolu lub wielkości cząstek;
b) dane dotyczące ekspozycji - dane te powinny być przedstawione w tabeli jako wartości średnie wraz
z odchyleniami standardowymi i powinny zawierać:
- szybkość przepływu powietrza przez komorę inhalacyjną,
- temperaturę i wilgotność powietrza w komorze,
- nominalne stężenia (całkowita ilość badanej substancji wprowadzonej do komory inhalacyjnej
podzielona przez objętość powietrza przepuszczonego przez komorę),
- rodzaj rozpuszczalnika (nośnika), jeśli był stosowany,
- rzeczywiste stężenia substancji w strefie oddychania,
- wartość średnia (medianę) wielkości cząstek (tam gdzie to konieczne),
- poziomy dawek (uwzględniając nośnik, jeśli był stosowany) i stężeń;
3) Skutki działania toksycznego dla każdej płci w każdej dawce;
4) Poziom, przy którym nie obserwowano żadnych efektów (i efektów działania toksycznego);
5) Czas padnięcia zwierząt w czasie doświadczenia lub czas wykonywania sekcji zwierząt po zakończeniu
doświadczenia;
6) Opis efektów działania toksycznego lub innych efektów;
7) Czas, po którym wystąpiły nietypowe objawy, ich następstwa i przebieg;
8) Dane o spożyciu paszy i zmianach masy ciała;
9) Wyniki badań oftalmologicznych;
10) Wykonane badania hematologiczne i wszystkie wyniki tych badań;
11) Wykonane oznaczenia biochemiczne i wszystkie wyniki tych oznaczeń (łącznie z wynikami analizy moczu);
12) Wyniki badań sekcyjnych;
13) Dokładny opis wszystkich zmian stwierdzonych na podstawie badań histopatologicznych;
14) Statystyczną ocenę wyników, tam gdzie to możliwe;
15) Omówienie wyników badań;
16) Interpretację wyników badań.
261
3.2. Ocena i interpretacja wyników
Przeprowadza się na podstawie przepisów Wstępu Ogólnego Części B.
262