Prace oryginaIne
Mikol. Lek. 1998, 5 (3): 141-148
ISSN 1232-986X
Wpływ antygenów Trichophyton rubrum i Trichophyton
mentagrophytes na transformację bIastyczną Iimfocytów
The infIuence of Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes on Iymphocytes
bIastic transformation
Anita Hryncewicz-Gwóx
dx
, Eugeniusz Baran, Ewa PIomer-Niezgoda
Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii AM we Wrocławiu
Porównano zdolnoS
ć antygenów T. rubrum i T. mentagrophytes do stymulowania transformacji blastycznej (TB) limfocytów
zdrowych dawców. Stwierdzono, że T. rubrum był słabszym aktywatorem. Indeks transformacji blastycznej dla T. mentagrophytes
był trzykrotnie wyższy niż dla T. rubrum. Oceniano wpływ ekstraktów grzybni (A) i substancji uwalnianych do podłoża (B), które
uzyskano z hodowli płynnej T. rubrum, oraz ich frakcji na TB limfocytów aktywowanych PHA (fitohemaglutyniną). Wykazano,
że zarówno ekstrakty, jak i ich frakcje wyrax
nie hamowaÅ‚y proliferacjÄ™ limfocytów. Ekstrakty A i B w stężeniu 500 µg/ml hamowaÅ‚y
94 i 90% transformacji blastycznej. Ekstrakt A oddziaÅ‚ywaÅ‚ jeszcze w stężeniu 1 µg/ml, a ekstrakt B  w stężeniu 10 µg/ml.
Frakcje A1 i A2 hamowały odpowiedx
limfocytów stymulowanych PHA w 75 i 70%. Pozostałe frakcje działały wyrax
nie słabiej.
SÅ‚aba immunogennoS
ć oraz właS
ciwoS
ci hamowania procesów immunologicznych przez T. rubrum mogą sprzyjać rozwojowi
przewlekłej dermatofitozy.
Słowa kIuczowe: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, transformacja blastyczna limfocytów
Lymphocyte transformation to T. rubrum and T. mentagrophytes antigens was assessed. T. rubrum was worse activator
than T. mentagrophytes. The influence of T. rubrum on proliferation of lymphocytes stimulated by PHA was examined. An
inhibitory effect on lymphoproliferation of mycelium (A), exoantigen (B) and their fractions was observed. Extracts A and B
at 500 µg/ml concentration inhibited 94 and 90% of lymphocyte transformation. Inhibitory effect was observed in concentration
of 10 µg/ml (extract A) and 1 µg/ml (extract B). A1 and A2 are the most active fractions inhibiting proliferation of stimulated
lymphocytes. The low immunogenicity and the inhibiting property of lymphoproliferation by the antigen of T. rubrum can play
a role in the generation of chronic infections with scanty symptoms.
Key words: Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, lymphocyte blastic transformation
Wstęp nie są do końca poznane. Pewną rolę mogą odgrywać
warunki S
rodowiskowe, jak wilgotne mikroS
rodowisko
Dermatofity powodujące infekcję naskórka i zrogo- związane z noszeniem nieprzewiewnego obuwia, oraz
waciałych przydatków skóry mogą wywoływać u czło- właS
ciwoS
ci osobnicze, jak np. szybkoS
ć podziałów ko-
wieka zakażenia o różnym przebiegu. Trichophyton ru- mórek naskórka i złuszczania jego powierzchownych
brum, zaliczany do dermatofitów antropofilnych, jest warstw (1). NieprawidłowoS
ci dotyczÄ…ce specyficznej
przyczyną przewlekłej i nawrotowej grzybicy skóry oraz komórkowej odpowiedzi immunologicznej mogą rów-
paznokci, którą cechuje słabo rozwijający się odczyn nież wpływać na przebieg schorzenia. W trakcie infekcji
zapalny (4). Dermatofitoza wywołana przez grzyby zoo- T. rubrum znacznie rzadziej niż w grzybicy odzwierzęcej
filne przebiega odmiennie. Infekcja powoduje mianowi- dochodzi do pozytywizacji póx
nego odczynu skórnego
cie powstanie nasilonego stanu zapalnego, który może na trichofitynę (8, 13-15, 21). Poziom transformacji bla-
doprowadzić do eliminacji czynnika patogennego i sa- stycznej limfocytów u chorych, u których stwierdzono tę
mowyleczenia (12, 15, 16). Przyczyny występowania infekcję, pod wpływem antygenów grzybiczych może
u niektórych osób infekcji o charakterze przewlekłym być również niski (8, 10). W publikowanych w ostat-
141
Anita Hryncewicz-Gwóx
dx
, Eugeniusz Baran, Ewa Plomer-Niezgoda Mikol. Lek. 1998, 5 (3)
nich latach pracach próbowano wyjaS
nić przyczyny sÅ‚a- triego (w temperaturze okoÅ‚o 37°C). Suchy materiaÅ‚ roz-
bego rozwoju specyficznej odpowiedzi komórkowej tarto w porcelanowym mox
dzierzu, po czym traktowano
w przebiegu dermatofitoz antropofilnych. Być może, ma 400 ml glikolu etylenowego. CzynnoS
ć tę powtórzono
znaczenie słabsza zdolnoS
ć T. rubrum do indukowania dwukrotnie. Ekstrakt glikolowo-etylenowy dializowano
pewnych procesów immunologicznych, a także działanie przez 3 doby w dużej iloS
ci wody (każdorazowo w oko-
hamujące antygenów tego dermatofita na układ odpor- ło 12 litrach wody). Po dializie zawartoS
ć worków liofili-
noS
ciowy (2, 4, 7, 18, 23). zowano.
Celem pracy było porównanie właS
ciwoS
ci immuno-
Przygotowanie ekstraktu substancji
gennych T. rubrum, wywołującego 90% dermatofitoz
wydzieIanej do pożywki T. rubrum (B)
przewlekłych (18), oraz T. mentagrophytes  czynnika
według Garga (6)
patogennego grzybicy z nasilonym stanem zapalnym.
Nadsącz czterotygodniowej hodowli na płynnym
Zbadano transformację blastyczną limfocytów od zdro-
podłożu Sabourauda przefiltrowano przez bibułę What-
wych osób pod wpływem ekstraktów grzybni obu der-
man 3. Filtrat zagęszczono 20 razy przez ultrafiltrację,
matofitów. Oceniono również wpływ T. rubrum na od-
przepłukano dwiema objętoS
ciami wody destylowanej,
powiedx
immunologicznÄ… na podstawie testu trans-
a następnie dodano 95% alkoholu etylowego, aby uzy-
formacji blastycznej limfocytów zdrowych dawców
skać 80-proc. stężenie. Po 24 godzinach przechowywa-
aktywowanych PHA (fitohemaglutyninÄ…) w obecnoS
ci
nia w temperaturze 4°C i staÅ‚ego mieszania na miesza-
ekstraktów mycelium i metabolitów wydzielanych do
dełku magnetycznym precypitat oddzielono przez wiro-
pożywki.
wanie przy 6 000 obrotów na minutę przez 30 minut.
Osad rozpuszczono w 60 ml demineralizowanej wody
Materiał i metody
destylowanej, wirowano przy 2 000 obrotów na minutę,
aby usunąć nierozpuszczalne cząsteczki, a następnie
Do badania wpływu antygenów dermatofitów na
liofilizowano.
transformację blastyczną limfocytów użyto krwi zdro-
wych dawców, którzy w wywiadzie nie podawali za-
AnaIiza i rozdział chromatograficzny
chorowania na dermatofitozÄ™.
ekstraktów T. rubrum według metody HPLC
Badaniom poddano szczepy dermatofitów zoofil-
Analizę i rozdział chromatograficzny ekstraktów
nych (T. mentagrophytes) i antropofilnych (T. rubrum),
grzybni i substancji uwalnianych do pożywki prowadzo-
które pochodziły z kolekcji Pracowni Mikologicznej
no przy użyciu chromatografu Waters, wyposażonego
Kliniki Dermatologii we Wrocławiu i były izolowane
w detektor fotodiodowy PDA Waters 996 oraz pompÄ™
z przypadków chorobowych. Z wyhodowanych szcze-
wysokociS
nieniowÄ… sterowane za pomocÄ… programu
pów wykonano ekstrakty i frakcje.
Millenium 2010. Stosowano kolumny Spherisorb C8
250×4 mm ID (Knauer) i C18, przy przepÅ‚ywie 1 ml na
Przygotowanie ekstraktów dermatofitów
minutę, oraz układ rozpuszczalników metanol woda
T. mentagrophytes i T. rubrum
w stosunku 80:20 w systemie izokratycznym.
według HeIandera (10)
CzterotygodniowÄ… hodowlÄ™ (w temperaturze 20°C) Oznaczanie cukrów
dermatofitów na podłożu płynnym Sabourauda odwiro- Cukry całkowite neutralne oznaczano metodą fenol/
wano, po czym trzykrotnie przemyto roztworem soli fiz- /kwas siarkowy (5).
jologicznej. Uzyskany osad zawieszono w 0,1 M buforze Monocukry przeprowadzone w lotne pochodne octa-
glicynowym o pH 9,0 i rozbijano ultradx
więkami trzykrot- nów alditoli identyfikowano według metody chromato-
nie przez 10 minut. Sonifikat pozostawiono na 12 godzin grafii gazowo-cieczowej sprzężonej ze spektrometrią
w temperaturze 4°C, a nastÄ™pnie odwirowano z prÄ™dko- masowÄ…. Do analizy użyto chromatografu gazowego
S
cią 3 000 obrotów na minutę przez 20 minut. Do super- sprzężonego ze spektrometrem masowym firmy Hew-
natantu dodano 7,5 g octanu sodu/l. Następnie dodano lett-Packard HP 5971 z kolumną kapilarną o wymiarach
dwie objętoS
ci acetonu i precypitowano przez 2 godziny 0,22 mm×12 m. Pomiary prowadzono w temperaturze
w temperaturze 4°C. Precypitat uzyskany po wirowaniu wynoszÄ…cej 150-270°C (8°C na minutÄ™), używajÄ…c helu
przy 3 000 obrotów na minutę rozpuszczono w wodzie jako gazu noS
nego (20).
destylowanej, przesączono i sprawdzono jałowoS
ć na
Oznaczanie iIoS
ci białka
podłożu stałym Sabourauda.
Białka w preparatach grzybiczych oznaczano według
metody Lowry ego i wsp. (17).
Przygotowanie ekstraktu grzybni
T. rubrum (A) według Hanna (9)
Ocena toksycznoS
ci ekstraktów grzybiczych
Hodowlę T. rubrum prowadzono na podłożu płyn-
ToksycznoS
ć oceniano in vitro. Sporządzano roz-
nym, uzyskując wzrost głębinowy. Inokulat przygotowa-
cieńczenia preparatu i dodawano zawiesinę limfocytów
no w 10 bakteriologicznych probówkach, które zawierały
ludzkich (PBL), a następnie inkubowano przez 24 go-
po 10 ml jałowego podłoża płynnego Sabourauda, i in-
dziny. ŻywotnoS
ć komórek oceniano według metody
kubowano przez 3 tygodnie. Hodowlę głębinową prowa-
MTT, porównując z żywotnoS
cią komórek, do których
dzono na podłożu Sabourauda przez 4 tygodnie w tem-
nie dodano preparatu.
peraturze 27°C. W czasie inkubacji kolby wstrzÄ…sano
mechanicznie. IzoIacja Iimfocytów
Osad grzybni przemyto wodą destylowaną, a na- Masę leukocytarną po lizie erytrocytów przemy-
stępnie 400 ml acetonu i wysuszono na szalkach Pe- wano dwukrotnie, a następnie zawieszono w płynie
142
Wpływ antygenów Trichophyton rubrum i Trichophyton mentagrophytes na transformację blastyczną limfocytów
TabeIa I: Transformacja bIastyczna Iimfocytów pod wpływem ekstraktów acetonowych
Hanksa, nawarstwiano na glikol
grzybni T. rubrum i T. mentagrophytes wyrażona Iiczbą impuIsów na minutę
z dodatkiem uropoliny i wirowa-
(LI) i indeksem transformacji (IT)
no przez 15 minut przy 3 000 ob-
TabIe I: Lymphocyte transformation induced by T. rubrum and T. mentagrophytes
rotów na minutę (3). PierS
cień
myceIium extracts expressed as count per minute (LI) and transformation
zawierający komórki zbierano,
index (IT)
przemywano trzy razy płynem
Stężenie ekstraktu Ekstrakt grzybni Ekstrakt grzybni
Hanksa. Do osadu dodawano
Extract concentration Mycelium extract Mycelium extract
pożywki RPMI-1640 z dodatkiem
[µg/ml] T. rubrum T. mentagrophytes
10% FCS i gentamycyny w stÄ™-
100 LI 2898 2506
żeniu 10 µg/ml. Komórki liczo-
IT 0,86 0,8
no i doprowadzano do gęstoS
ci
2×106/ml.
50 LI 2966 2920
IT 0,93 1,1
Transformacja bIastyczna
10 LI 4078 9004
Iimfocytów (TB)
Limfocyty o gęstoS
ci 2×106/
IT 1,16 2,8
ml zawieszono w pożywce RPMI
1 LI 4631 11592
z dodatkiem 10% FCS, 2 mM
IT 1,43 3,6
glutaminy i 10 µg/ml gentamy-
cyny rozlano po 100 µl do pÅ‚a-
0,1 LI 6291 9354
skodennych mikropłytek skła-
IT 1,76 3,2
dających się z 96 dołków (Fal-
PHA LI 35744 35744
kon). Następnie dodawano po
100 µl odpowiednio rozcieÅ„czo-
10 µg/ml IT 17,8 18,0
nych w pożywce preparatów (każ-
TB spontaniczna LI 3245 3240
de stężenie do 3 dołków). Płytki
Tb spontaneous
inkubowano w atmosferze 5%
Podano wartoS
ć S
redniÄ… z trzech doS
wiadczeń / Mean value from three asseys was stated
CO2 w temperaturze 37°C przez
72 godziny. Wynik proliferacji
komórek mierzono według meto-
dy izotopowej. Do dołków, 20 go-
dzin przed zakończeniem hodowli, dodawano po 1 uCi Płyn lizujący rozpuszcza kryształki formazanu wypro-
3
H tymidyny (Amersham, specyficzna aktywnoS
ć 6,9 Ci/ dukowanego z MTT przez żywe komórki. Próbki po do-
mM). Komórki zbierano półautomatycznym harweste- daniu płynu lizującego inkubowano przez 20 godzin
rem na bibułę Whatman 934-AH. RadioaktywnoS
ć ozna- w tych samych warunkach. Ekstynkcję odczytywano
czono w płynnym scyncylacyjnym liczniku (Beckman w czytniku Dynatech przy fali 550 nm (19).
LS7500) liczbą impulsów na minutę (LI). Komórki sty-
mulowane fitohemaglutyninÄ… 10 µg/ml (PHA  P Sigma)
Wyniki
stanowiły kontrolę dodatnią, a próbki bez preparatów 
kontrolÄ™ ujemnÄ…. StymuIacja transformacji bIastycznej
przez ekstrakty acetonowe grzybni
Badanie wpływu preparatów grzybiczych T. mentagrophtes i T. rubrum
na transformację bIastyczną (TB) Iimfocytów Wykazano, że antygeny grzybicze w słabym stopniu
stymuIowanych PHA indukujÄ… limfoproliferacjÄ™, a indeksy transformacji bla-
Limfocyty o gęstoS
ci 2×106/ml zawieszano w pożyw- stycznej sÄ… o wiele niższe niż po stymulacji PHA. Eks-
ce RPMI z dodatkiem 10% FCS, 2 mM glutaminy i 10 trakty obydwu dermatofitów w stężeniu 100 i 50 µg/ml nie
µg/ml gentamycyny rozlewano po 100 µl do pÅ‚askoden- stymulujÄ… transformacji blastycznej. OptymalnÄ… dawkÄ…
nych mikropÅ‚ytek skÅ‚adajÄ…cych siÄ™ z 96 doÅ‚ków (Falkon). T. rubrum stymulujÄ…cÄ… limfoproliferacjÄ™ jest 0,1 µg/ml
NastÄ™pnie dodawano po 50 µl odpowiednio rozcieÅ„czo- i 1 µg/ml, a indeksy transformacji wynoszÄ…, odpowiednio:
nych w pożywce preparatów grzybiczych i 50 µl PHA 1,76 i 1,43. Trichophyton mentagrophytes jest najbardziej
o stężeniu 20 µl/ml do 3 doÅ‚ków. Dalej postÄ™powano tak aktywny w stężeniach 0,1-10 µg/ml (indeksy transforma-
samo, jak podczas badania TB. Proliferację limfocytów cji wynoszą 3,6-2,8). W miarę wzrostu stężeń obu anty-
oznaczano według metody MTT (11). genów, ich aktywnoS
ć stymulująca TB zmniejsza się
(tab. I).
Test MTT. Metoda koIorymetryczna
służąca do oceny żywotnoS
ci komórek Wpływ antygenów T. rubrum
Do każdego dołka zawierającego limfocyty dodawa- na transformację bIastyczną
no po 10 µl MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl] 2,5-diphe- WpÅ‚yw ekstraktu glikoloetylenowego grzybni (A)
nyl-tetrazolium bromide) o stężeniu 5 mg/ml, a po 3 go- i etylowego substancji uwalnianych do pożywki hodowla-
dzinach inkubacji (37°C, 5% CO2) dodawano pÅ‚yn lizu- nej (B) T. rubrum na transformacjÄ™ blastycznÄ… limfocytów
jący o składzie: 20% lauryl sulfate (SDS, Sigma) w 50% aktywowanych PHA badano używając stężeń 1-500
N-N-dimethyl formamide (DMF, Sigma) rozcieÅ„czony µg/ml. Wykazano, że obydwa ekstrakty hamujÄ… trans-
w wodzie dejonizowanej z dodatkiem kwasu octowego. formację blastyczną limfocytów. Stopień zahamowania
143
Anita Hryncewicz-Gwóx
dx
, Eugeniusz Baran, Ewa Plomer-Niezgoda Mikol. Lek. 1998, 5 (3)
TabeIa II: Hamowanie transformacji bIastycznej (TB) TabeIa III: Hamowanie transformacji bIastycznej (TB)
Iimfocytów zdrowych osób stymuIowanych Iimfocytów zdrowych osób stymuIowanych PHA
PHA przez ekstrakt grzybni (A) T. rubrum przez ekstrakt (B) substancji uwaInianych przez
TabIe II: Inhibition of IymphoproIiferation stimuIated T. rubrum do podłoża
by PHA in presence of myceIium (A) extract TabIe III: Inhibition of IymphoproIiferation stimuIated by
of T. rubrum PHA in presence of exoantigen (B) of T. rubrum
Antygen i dawka [µg/ml] WartoS
ć ekstynkcji % zahamowania TB
Antygen i dawka [µg/ml] WartoS
ć ekstynkcji % zahamowania TB
Antigen and dose Extinction value TB Inhibition %
Antigen and dose Extinction value TB Inhibition %
[µg/ml]
[µg/ml]
A 500 274 94
B 500 293 90
A 100 288 84
B 100 338 70
A10 310 61
B10 411 31
A1 339 32
B1 502 0
PHA 372
PHA 10 472
TB spontaniczna 274
TB spontaniczna 282
Tb spontaneous
Tb spontaneous
Podano wartoS
ć S
redniÄ… z trzech doS
wiadczeń
Podano wartoS
ć S
redniÄ… z trzech doS
wiadczeń
Mean value form three asseys was stated
Mean value form three asseys was stated
TabeIa IV: Skład chemiczny ekstraktu grzybni (A) i ekstraktu substancji wydzieIanych do pożywki (B) T. rubrum
TabIe IV: ChemicaI constitution of myceIium (A) and exoantigen (B) extracts of T. rubrum
Preparat Białkob [%] WydajnoS
ć [%]
Cukier całkowitya [%]
Preparation Proteinb [%] Output [%]
Total sugar [%]
A 0,92c
20 24
B 47 1,9d
1
a
oznaczany metodą wykrywającą cukry obojętne za pomocą fenol/kwas siarkowy / determined by a method detecting neutral sugars using phenol/sulphur acid
b
oznaczane według metody Lowry i wsp. / determined using Lowry et al. method
c
w mg preparatu z 100 mg grzybni / in mg of preparation out of 100 mg mycelium
d
w mg preparatu z 100 ml nadsÄ…czu grzybni / in mg of preparation out of 100 ml mycelium supernatant
TabeIa V: Wyniki anaIizy jakoS
ciowej i iIoS
ciowej cukrów ekstraktu grzybni (A) i ekstraktu substancji wydzieIanych do pożywki (B)
T. rubrum
TabIe V: Quantity and quaIity anaIysis of sugar in myceIium (A) and exoantigen (B) extracts of T. rubrum
Składnik cukrowy* Czas retencji [min]
IloS
ć w preparacie [%]
Sugar constituent* Retention time [min]
Amount in preparation [%]
A B
Ryboza 6,82
 1,20
Ribose
Arabinoza 6,93
1,94 0,47
Arabinose
Ksyloza 7,17
R
lad 
Xylose
Trace
Mannoza 9,83
9,94 1,52
Mannose
Glukoza 9,94
2,96 3,14
Glucose
Galaktoza 10,03
6,67 1,15
Galactose
Glukozoamina 11,60
0,49 0,71
Glucoseamine
Galaktozoamina 11,87
0,06 0,31
Galactoseamine
Razem
22,01 8,50
Total
* składniki cukrowe jako pochodne octanów alditoli cukrów oznaczane według metody chromatografii gazowo-cieczowej połączonej ze spektrometrią masową
(GC-MS) / Sugar constituents as derivatives of sugar aldithol acetate determined with GC-MS method
 brak składnika / no consitituent
144
Wpływ antygenów Trichophyton rubrum i Trichophyton mentagrophytes na transformację blastyczną limfocytów
TabeIa VI: Procentowa zawartoS
ć białka i cukru w po-
proliferacji aktywowanych PHA limfocytów zależał
szczegóInych frakcjach ekstraktu grzybni (A)
od stężenia wykorzystanych ekstraktów. Najsilniejsze
i ekstraktu substancji wydzieIanych do pożywki (B)
hamowanie stwierdzono, gdy stężenie wynosiło 500
TabIe VI: Protein and sugar constituents on fractions of
µg/ml. Ekstrakt substancji uwalnianej do podÅ‚oża ha-
myceIium (A) and exoantigen (B) extracts
of T. rubrum [%] mowaÅ‚ limfoproliferacjÄ™ jeszcze w stężeniu 10 µg/ml,
ekstrakt grzybni natomiast nawet w stężeniu 1 µg/mI
Frakcje Cukier Białko
(tab. II, III).
Fractions Sugar Protein
A1 1,03 0
OkreS
Ienie składu chemicznego
A2 10,03 17,87
ekstraktów A i B i ich frakcji
W celu scharakteryzowania czynnika odpowiedzial-
A3 3,5 1,02
nego za hamowanie limfoproliferacji przez ekstrakty
A4 0,41 R
lad /Trace
A i B, do dalszych badań użyto ich frakcji. Oba ekstrakty
A5 1,03 2,55
rozdzielono na frakcje według metody cieczowej chroma-
tografii wysokociS
nieniowej (HPLC). Uzyskano po szeS
ć
A6 3,71 2,55
frakcji z każdego preparatu (A1-A6 otrzymano z grzyb-
B1 4,6 22,74
ni i B1-B6  z substancji uwalnianej do podłoża).
B2 2,30 7,58
Ekstrakty wyjS
ciowe i ich frakcje poddano analizie
cukrowej (według metody kolorymetrycznej i chroma-
B3 0,40 7,58
tografii gazowej połączonej ze spektrometrią maso-
B4 0,66 7,58
wÄ…) oraz okreS
lono zawartoS
ć białka (według metody
B5 0,10 1,52
Lowry ego i wsp.). Stwierdzono, że ekstrakt grzybni
zawiera podobne iloS
ci cukru i białka, a przeważa-
B6 0,40 0,20
jącym składnikiem ekstraktu substancji uwalnianych
TabeIa VII: Skład cukrowy frakcji (A1-A6) otrzymanych z gIikoIowego ekstraktu grzybni T. rubrum
TabIe VII: Sugar constituents in myceIium fractions (A1-A6) of T. rubrum
Procentowa zawartoS
ć w ekstrakcie grzybni cukrów
Frakcje ekstraktu
zidentyfikowanych w poszczególnych jego frakcjach
Extract fractions
Percentual contents in mycelium extract of sugers identified in its individual fractions
A
Arabinoza Ksyloza Mannoza Glukoza Galaktoza Glukozoamina Galaktozoamina
Arabinose Xylose Mannose Glucose Galactose Glucoseamine Galactoseamine
A1 0,06  0,35 0,41 0,27  
A2   2,49 4,16 3,70 6,26 0,84
A3   0,30 2,80 0,41 0,36 
A4   0,13 0,10 0,19 0,62 0,06
A5  0,02 0,32 0,21 0,50 0,72 0,08
A6   1,06 1,23 1,44 2,78 0,53
 brak składnika / no constituent
TabeIa VIII: Skład cukrowy frakcji (B1-B6) otrzymanych z etanoIowego ekstraktu substancji uwaInianych do pożywki T. rubrum
TabIe VIII: Sugar constituents in exoantigen fractions (B1-B6) of T. rubrum
Frakcje ekstraktu Procentowa zawartoS
ć w ekstrakcie substancji wydzielanych do pożywki cukrów
Extract fractions zidentyfikowanych w poszczególnych jego frakcjach
B Percentual contents in extract of substances secreted to the medium
of sugars identified in its individual fractions
Arabinoza Ryboza + Mannoza Glukoza Galaktoza Glukozoamina Galaktozoamina
Arabinose Ramnoza Mannose Glucose Galactose Glucoseamine Galactoseamine
Ribose +
Ramnose
B1   0,07 0,31 0,15 0,18 
B2   0,03 0,18 0,06 0,11 0,02
B3   0,01 0,02 0,02 0,05 0,004
B4   0,008 0,09 0,01 0,02 
B5   0,0004 0,01   
B6 16 30 0,009 0,02 0,01 0,02 0,002
 brak składnika / no constituent
145
Anita Hryncewicz-Gwóx
dx
, Eugeniusz Baran, Ewa Plomer-Niezgoda Mikol. Lek. 1998, 5 (3)
TabeIa IX: Wpływ frakcji (A1-A6) ekstraktu grzybni na trans- TabeIa X: Wpływ frakcji (B1-B6) ekstraktu substancji
formację bIastyczną (TB) Iimfocytów zdrowych uwaInianych do pożywki T. rubrum na transforma-
osób stymuIowanych PHA cję bIastyczną (TB) Iimfocytów zdrowych osób
TabIe IX: Inhibition of IymphoproIiferation stimuIated by stymuIowanych PHA
PHA in presence of myceIium extract fractions TabIe X: Inhibition of IymphoproIiferation stimuIated by PHA
(A1-A6) of T. rubrum in presence of exoantigen extract fractions (B1-B6)
of T. rubrum
Antygen WartoS
ć ekstynkcji % zahamowania TB
Antygen WartoS
ć ekstynkcji % zahamowania TB
Antigen Extinction value TB Inhibition %
Antigen Extinction value TB Inhibition %
A 500 µg/ml 285 97
B 500 µg/ml 293 90
Frakcja A1 333 75
Frakcja B1 421 33
Fraction A1
Fraction B1
Frakcja A2 344 70
Frakcja B2 395 41
Fraction A2
Fraction B2
Frakcja A3 418 37
Frakcja B3 404 38
Fraction A3
Fraction B3
Frakcja A4 452 17
Frakcja B4 450 15
Fraction A4
Fraction B4
Frakcja A5 450 22
Frakcja B5 435 27
Fraction A5
Fraction B5
Frakcja A6 429 34
Frakcja B6 452 13
Fraction A6
Fraction B6
PHA 477
PHA B 10 µg/ml 469
TB spontaniczna 278
TB spontaniczna 282
Tb spontaneous
Tb spontaneous
Frakcje ekstraktów A zastosowano w stężeniach odpowiadających zawarto-
S
ci danej frakcji w 500 µg/ml ekstraktu. Podano wartoS
ć S
rednią z trzech do- Frakcje ekstraktów B zastosowano w stężeniach odpowiadających zawarto-
S
wiadczeń S
ci danej frakcji w 500 µg/ml ekstraktu. Podano wartoS
ć S
redniÄ… z 3 do-
Fractions of A extracts were used in concentrations corresponding to the S
wiadczeń
contents of a given fraction in 500 mg/ml of extract. Mean value from three Fractions of B extracts were used in concentrations corresponding to the
asseys was stated contents of a given fraction in 500 mg/ml of extract. Mean value from 3 as-
seys was stated
do pożywki jest białko (tab. IV). Głównym składni- focytów stymulowanych PHA. Najsilniej hamująco dzia-
kiem cukrowym ekstraktu grzybni jest mannoza, a eks- Å‚ajÄ… frakcje A1 i A2 (75 i 70%). DoS
ć znaczne hamowa-
traktu substancji uwalnianych do pożywki  glukoza nie obserwowano również w obecnoS
ci frakcji A3 i A6
(tab. V). (37 i 34%). SpoS
ród frakcji ekstraktu B najsilniej hamują
Analizując skład cukrowy frakcji ekstraktu grzybni, TB frakcje B1, B2 i B3 (33, 41 i 38%). Pozostałe frakcje
wykazano, że dominującym składnikiem poszczegól- w mniejszym stopniu wpływają na odpowiedx
limfocy-
nych frakcji jest glukoza lub gIukozoamina. Różnice tów stymulowanych PHA (13-27%) (tab. IX, X).
w rezultatach badań składu cukrowego ekstraktu
grzybni i jego frakcji mogą wynikać z adsorpcji nie-
Omówienie
których składników wielkocząsteczkowych, np. manna-
nu, na filtrach w kolumnach rozdzielających oraz roz- Komórkowa odpowiedx
immunologiczna odgrywa
padu większych cząsteczek i uwolnienia cukrów pro- dużą rolę w eliminacji czynnika patogennego w prze-
stych. Stwierdzono również, że głównym składnikiem biegu dermatofitozy. W czasie infekcji grzybami antro-
cukrowym frakcji ekstraktu substancji uwalnianych do pofilnymi, która cechuje się przewlekłym, nawrotowym
pożywki, podobnie jak ekstraktu wyjS
ciowego, jest glu- przebiegiem oraz słabo rozwijającym się stanem za-
koza i glukozoamina (tab. VI-VIII). palnym, podczas badań in vivo, na podstawie póx
ne-
go testu S
ródskórnego (DTH), obserwowano u wielu
Wpływ frakcji ekstraktów pacjentów brak reaktywnoS
ci komórkowej na antyge-
na transformację bIastyczną Iimfocytów ny dermatofitów, przy prawidłowej odpowiedzi na inne
aktywowanych PHA antygeny niespecyficzne, jak tuberkulina i kandydyna
Podczas wyżej opisanych doS
wiadczeń wykaza- (8, 13-15, 21). Przyczyna słabej selektywnej odpowie-
no, że ekstrakty grzybni i substancji uwalnianych do dzi komórkowej w dermatofitozach przewlekłych nie
podłoża T. rubrum wywołują największe zahamowa- została do końca wyjaS
niona. Wyniki naszych badań,
nie transformacji blastycznej w stężeniu wynoszącym uzyskane na podstawie testu transformacji blastycz-
500 µg/ml. Dlatego, prowadzÄ…c badania nad wpÅ‚y- nej, wskazujÄ…, że T. rubrum jest sÅ‚abszym aktywato-
wem frakcji tych ekstraktów na TB, użyto stężeń od- rem limfocytów niż T. mentagrophytes. Słaba immuno-
powiadajÄ…cych zawartoS
ci danej frakcji w 500 µg/ml gennoS
ć dermatofitów antropofilnych może być zatem
ekstraktu wyjS
ciowego. przyczyną rozwoju przewlekłego i skąpoobjawowego
Stwierdzono, że frakcje obu ekstraktów (A i B) przebiegu schorzenia. Doniesienia na temat badań in
w różnym stopniu hamują transformację blastyczną lim- vitro reaktywnoS
ci komórkowej u chorych na przewle-
146
Wpływ antygenów Trichophyton rubrum i Trichophyton mentagrophytes na transformację blastyczną limfocytów
kłą dermatofitozę są niejednoznaczne. Niektórzy auto- Wnioski
rzy wykazali na podstawie testu transformacji bla-
1. Antygeny T. rubrum słabiej niż T. mentagrophy-
stycznej osłabioną proliferację limfocytów pod wpły-
tes stymulują transformację blastyczną limfocytów.
wem antygenów grzybiczych, a nawet jej brak (8, 10).
2. Ekstrakty grzybni i substancji uwalnianych do
Inni natomiast donoszą o prawidłowej proliferacji lim-
podłoża przez T. rubrum oraz ich frakcje wpływają ha-
focytów pod wpływem antygenów dermatofitów u cho-
mująco na proliferację limfocytów stymulowanych PHA.
rych na przewlekłą grzybicę, również u pacjentów,
3. SÅ‚aba immunogennoS
ć oraz właS
ciwoS
ci hamo-
u których odczyn DTH jest ujemny (18, 22). Istnienie
wania procesów immunologicznych przez T. rubrum
czynników pochodzenia grzybiczego, które hamują
mogą sprzyjać rozwojowi przewlekłej dermatofitozy.
procesy immunologiczne, może mieć znaczenie w ogra-
niczeniu rozwijającej się odpowiedzi komórkowej. Lokal-
PiS
miennictwo
ne oddziaływanie tych czynników u chorych na przewle-
1. Aly R.: Dr Raza Aly o immunologii grzybic. Przegl. Mikol.,
kłą dermatofitozę, u których reaktywnoS
ć limfocytów
1997, 1, 1-2.
krwi krążącej w teS
cie TB jest prawidłowa, mogłoby ha-
2. Blake J.S., Dahl M.V., Herron M.J., Nelson R.D.: An immu-
mować odpowiedx
immunologicznÄ… w miejscu infekcji
noinhibitory cell wall glycoprotein (mannan) from Tricho-
i ograniczać możliwoS
ć eliminowania czynnika pato-
phyton rubrum. J. Invest. Dermatol., 1991, 96, 657-661.
gennego z powierzchni skóry. W trakcie swoich badań
3. Boyum A.: Isolation of mononuclear cells and granulo-
McGregor, Blake i Grando stwierdzili, że antygeny T.
cytes from human blood. J. Clin. Lab. Invest., 1968, 28
rubrum oraz mannan wyizolowany z grzybni T. rubrum
(supl. 97), 77-89.
w odpowiednich stężeniach hamują proliferację limfo-
4. Dahl M.V., Grando S.A.: Chronic dermatophytosis: what
cytów aktywowanych mitogenami (2, 7, 18). Wyniki
is special about Trichophyton rubrum? Adv. Dermatol.,
naszych badań są podobne. Ekstrakty T. rubrum uzy-
1994, 9, 97-109.
skane z grzybni i substancji wydzielanych do pożywki
5. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Robers P.A.,
dodane do stymulowanych PHA limfocytów zdrowych
Smith F.: Colorimetric method for determination of su-
osób hamują TB. Najsilniejsze hamowanie wywierają
gars and related substances. Anal. Chem., 1956, 28,
obydwa ekstrakty wyjS
ciowe w stężeniu wynoszącym
350-356.
500 µg/ml (90 i 94% zahamowania TB). W mniejszych
6. Garg A.P., Muler J.: Preparation of antigens from Tri-
stężeniach ekstrakt grzybni oddziałuje silniej niż eks-
chophyton mentagrophytes using a new semi-solid cul-
trakt substancji uwalnianej do pożywki. Przy użyciu
ture medium and their characterization by SDS-PAGE
100, 10 i 1 µg/ml zahamowanie wywoÅ‚ane przez eks-
and immunological techniques. Mycoses, 1992, 35,
trakt grzybni wynosiło, odpowiednio: 84, 61 i 32%,
349-355.
a przez ekstrakt substancji uwalnianych do pożywki 
7. Grando S.A., Hostager B.S., Herron M.J., Dahl M.V.,
70, 31 i 0%.
Nelson R.D.: Binding of Trichophyton rubrum mannan
Różnice w sile oddziaływania na procesy immuno-
to human monocytes in vitro. J. Invest. Dermatol., 1992,
logiczne mogą być związane z budową chemiczną obu 98, 876-880.
badanych ekstraktów. Oznaczono ich skład chemiczny
8. Hanifin J.M., Ray L.F., Lobitz W.C.: Immunological reacti-
i stwierdzono, że: ekstrakt grzybni zawiera dużą iloS
ć vity in dermatophytosis. Br. J. Dermatol., 1974, 90, 1-7.
cukru (20%) i podobnÄ… iloS
ć białka (24%), a ekstrakt
9. Hann P., Raay-Helmer E.M.H., Boorsma D.M.: Diversity
substancji uwalnianej do pożywki składa się z przewa-
of antigenic extracts from the dermatophyte Trichophyton
żającej iloS
ci białka (47%) i niewielkiej iloS
ci cukru rubrum. Mykosen, 1986, 9, 427-433.
(8,5%). Silniejsze hamowanie TB wywołane przez eks-
10. Helander I.: The lymphocyte transformation test in der-
trakt grzybni jest, być może, związane z większą za-
matophytoses. Mykosen, 1978, 21, 71-80.
wartoS
cią cukrowców, których głównym składnikiem
11. Hussain R.F., Nouri A.M.E., Oliver R.T.D.: A new ap-
jest mannoza.
proach for measurement of cytotoxicity using colorime-
Zarówno ekstrakt grzybni, jak i substancji uwalnia-
tric assay. J. Immunol. Methods, 1993, 160, 89-96.
nych do podłoża rozdzielono według metody HPLC
12. Jones H.E., Reinhard J.H., Rinaldi M.G.: Acquired im-
i uzyskano po szeS
ć frakcji. Oznaczono zawartoS
ć bia-
munity to dermatophytes. Arch. Dermatol., 1974, 109,
łek i cukrów we frakcjach oraz badano ich wpływ na
840-848.
TB. JakoS
ciowy skład cukrowy wszystkich frakcji jest
13. Jones H.E., Reinhard J.H., Rinaldi M.G.: A clinical, my-
podobny. Dominują heksozy oraz występuje znaczna
cologial, and immunological survey for dermatophyto-
iloS
ć glukozoaminy. Najsilniejsze działanie hamujące
sis. Arch. Dermatol., 1973, 108, 61-65.
wywierały dwie frakcje ekstraktu grzybni: A1 (75%) i A2
14. Jones H.E., Reinhard J.H., Rinaldi M.G.: Immunologic
(70%), co potwierdza wczeS
niejsze wyniki o silniej-
susceptibility to chronic dermatophytosis. Arch. Derma-
szym hamowaniu TB przez ekstrakt grzybni niż sub- tol., 1974, 110, 213-220.
stancji uwalnianych do pożywki. Pozostałe frakcje obu
15. Jones H.E., Reinhard J.H.: Model dermatophytosis in
ekstraktów obniżały poziom TB słabiej (13-41%).
naturaly infeceted subjects. Arch. Dermatol., 1974, 110,
Frakcja A1 składa się jedynie z cukru, a frakcja A2 369-374.
ma dużą zawartoS
ć cukru i białka. Być może, brak biał-
16. Jones H.E.: Immune response and host resistance of
ka w A1 i obecnoS
ć największej ze wszystkich frakcji
humans to dermatophyte infection. J. Am. Acad. Derma-
częS
ci cukrowej w A2 warunkuje możliwoS
ć działania tol., 1993, 28, S12-S18.
hamującego cukru. W pozostałych frakcjach natomiast
17. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Fowr A.L., Randall R.J.: Pro-
stosunki iloS
ciowe białka i cukru nie sprzyjają silnemu
tein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol.
oddziaływaniu na TB. Chem., 1951, 193, 265-275.
147
Anita Hryncewicz-Gwóx
dx
, Eugeniusz Baran, Ewa Plomer-Niezgoda Mikol. Lek. 1998, 5 (3)
18. McGregor J.M., Hamilton A.J., Hay R.J.: Possible mecha- 22. Svejgaard E.: Immunologic Investigations of Dermato-
nism of immune modulation in chronic dermatophytoses phytes and Dermatophytosis. Semin. Dermatol., 1985,
an in vitro study. Br. J. Dermatol., 1992, 127, 233-238. 4, 201-221.
19. Mosmann T.: Rapid colorimetric assay for cellular growth 23. Weitzman I., Summerbell R.C.: The dermatophytes.
and cytotoxity assays. J. Immunol. Methods, 1983, 65, Clin. Microbiol. Rev., 1995, 8, 240-259.
55-63.
Adres do korespondencji:
20. Sawardeker J.S., Slonker J.H., Jeanes A.R.: Quantitati-
Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii AM
ve determination of monosaccharides as their alditol
ul. Chałubińskiego 1
acetates by gas-liquid chromatography. Anal. Chem.,
50-368 Wrocław
1965, 37, 1602-1624.
21. Sorensen G.W., Jones H.E.: Immediate and delayed
hypersensitivity in chronic dermatophytosis. Arch. Der- Praca wpłynęła do Redakcji: 9 czerwca 1998 r.
matol., 1976, 112, 40-42. Zaakceptowano do druku: 26 czerwca 1998 r.
148