Biochemia dla Biologii nr ETCS
Oznaczanie stężenia białka w materiale biologicznym
ZADANIE 11
TYTUA
: OZNACZANIE ST
ŻENIA BIAA
KA W MATERIALE BIOLOGICZNYM
Forma zaliczenia: Kolokwium z części teoretycznej do ćwiczeń oraz praktyczne zaliczenie
ćwiczeń
Materiały i urządzenia:
" Materiały
1. roztwór lizozymu 0,07 mg/ml
2. roztwór lizozymu 0,35 mg/ml
3. 0,9% NaCl
4. odczynnik Bradforda
5. odczynnik C
6. odczynnik Folina-Ciocalteu (odczynnik D)
" Urządzenia
1. probówki
2. zlewki
3. pipety
4. spekole
INFORMACJE TEORETYCZNE:.
W metodzie Bradforda wykorzystuje się wiązanie barwnika Coomassie Brilliant Blue
G-250 z białkiem za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych. Z barwnikiem głównie
reagują reszty argininy, w minimalnym stopniu reszty histydyny, lizyny, tyrozyny, tryptofanu
i fenyloalaniny. Błękit brylantynowy CBB G-250 w środowisku kwasowym ma brunatne
zabarwienie, które po reakcji z białkiem zmienia się na błękitne. Wiąże się z tym zmiana
maksimum pochłaniania z 465 na 595 nm. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości
białka w roztworze. W zależności od budowy białka, mogą zaistnieć różnice w wiązaniu
barwnika, co powoduje uzyskiwanie różnego natężenia barwy przy tych samych stężeniach
odmiennych białek.
Metoda Lowry ego pozwala na oznaczenie białka o stężeniu 1�/ml. Metoda ta opiera się
na dwóch reakcjach barwnych, których efektem jest końcowa barwa roztworu białka:
1. reakcji biuretowej białka z jonami miedziowymi w środowisku alkalicznym, oraz
2. redukcji odczynnika fosforomolibdeno-fosforowolframowego (odczynnik Folina-
Ciocalteu) przez aminokwasy aromatyczne (tyrozyna, tryptofan).
Pierwszy etap reakcji polega na połączeniu kationów miedziowych do wiązań
peptydowych, drugi na redukcji odczynnika Folina-Ciocalteu do błękitu
fosforomolibdenowego. Poszczególne białka dają z odczynnikiem Folina-Ciocalteu różne
natężenia barwy, np. trypsyna 3-krotnie większe od natężenia barwy, jaką daje żelatyna (przy
takich samych stężeniach białka). Również szereg związków niebiałkowych (fenole,
nitrofenole, puryny, pirymidyny, kwas moczowy) reaguje z odczynnikiem Folina-Ciocalteu
tworząc barwne pochodne, które zwiększają intensywność zabarwienia i dlatego mogą
przeszkadzać w oznaczaniu białka.
1
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Oznaczanie stężenia białka w materiale biologicznym
Przebieg doświadczenia:
Podzadanie 1: oznaczanie białka metodą Bradforda  sporządzenie krzywej kalibracyjnej
Do 11 probówek odpipetować odpowiednio od 0 do 1 ml roztworu białka
wzorcowego (roztwór lizozymu o stężeniu 0,07 mg/ml w 0,9% NaCl) i uzupełnić
roztworem NaCl według tabeli 1. Zawartość probówki nr jeden należy traktować
jako próbę kontrolną. Do wszystkich probówek dodać po 5 ml odczynnika
Bradforda i wymieszać. Po 10 minutach zmierzyć ekstynkcję przy długości fali 595
nm. Wyniki zanotować w tabeli 1, sporządzić krzywą wzorcową oraz obliczyć
współczynnik regresji dla tej krzywej.
Tabela 1
Ilość roztworu Ilość roztworu 0,9%NaCl Stężenie białka
Lp. Ekstynkcja
wzorcowego [ml] [ml]
[�g/lm]
�
�
�
1 0,0 1,0 0,0
2 0,1 0,9 7
3 0,2 0,8 14
4 0,3 0,7 21
5 0,4 0,6 28
6 0,5 0,5 35
7 0,6 0,4 42
8 0,7 0,3 49
9 0,8 0,2 56
10 0,9 0,1 63
11 1,0 0,0 70
Obliczenia:
Badaną krzywą kalibracyjną opisuje równanie:
y =ax0 + bx1
Regresję liniową wyznaczamy metodą najmniejszych kwadratów. W tym celu umieść dane
w tabeli. Obliczyć wg wzoru X*Y; X2; Y2 i umieść w tabeli.
N Cbiałka -X Ekstynkcja - Y X*Y X2 Y2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Suma
2
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Oznaczanie stężenia białka w materiale biologicznym
Wyznacz współczynnik b tego równania (współczynnik a = 0) dla podanej serii danych
wg poniższych wzorów:
Łx2 = ŁX2 - (ŁX)2/N b = Ł x*y/Łx2
Ł Ł Ł Ł Ł
Ł Ł Ł Ł Ł
Ł Ł Ł Ł Ł
Ły2 = ŁY2 - (Ł a= (Ł ŁX)/N
Ł Ł Ł Ł Ł
Ł Ł ŁY)2/N ŁY-b*Ł
Ł Ł Ł Ł Ł
Łx*y = ŁX*Y - (Ł Ł
Ł Ł Ł Ł
Ł Ł ŁX * ŁY)/N
Ł Ł Ł Ł
UWAGA !!!
Krzywa zależności ekstynkcji od stężenia jest liniowa tylko w określonym zakresie.
Nie można więc stosować uzyskanego równania do wyznaczania stężenia z ekstynkcji
większej niż wyznaczona w krzywej kalibracyjnej!!!
Wniosek: Badaną krzywą kalibracyjną opisuje równanie:........................................................
Podzadanie 2: oznaczanie białka w materiale biologicznym metodą Bradforda
Pobrać 1 ml próby. Dodać 5 ml odczynnika Bradforda i starannie wymieszać.
Oznaczyć ekstynkcję przy długości fali 595. Obliczyć stężenie białka w badanej
próbie.
Podzadanie 3: oznaczanie białka metodą Lowry ego  sporządzenie krzywej kalibracyjnej
Do 11 probówek odpipetować odpowiednio od 0 do 1 ml roztworu białka
wzorcowego (lizozymu o stężeniu 0,35 mg/ml w 0,9% NaCl) i uzupełnić
roztworem NaCl według tabeli 2. Zawartość probówki nr jeden należy traktować
jako próbę kontrolną. Do wszystkich probówek dodać po 5 ml odczynnika C i
wymieszać. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut. Dodać 0,5 ml
odczynnika D i energicznie wymieszać. Po 30 minutach zmierzyć ekstynkcję przy
długości fali 750 nm. Wyniki zanotować w tabeli 2, sporządzić krzywą wzorcową
oraz obliczyć współczynnik regresji dla tej krzywej.
Tabela 2
Ilość roztworu Ilość roztworu 0,9%NaCl Stężenie białka
Lp. Ekstynkcja
wzorcowego [ml] [ml] [�g/lm]
�
�
�
1 0,0 1,0 0,0
2 0,1 0,9 35
3 0,2 0,8 70
4 0,3 0,7 105
5 0,4 0,6 140
6 0,5 0,5 175
7 0,6 0,4 210
8 0,7 0,3 245
9 0,8 0,2 280
10 0,9 0,1 315
11 1,0 0,0 350
3
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Oznaczanie stężenia białka w materiale biologicznym
Obliczenia:
Badaną krzywą kalibracyjną opisuje równanie:
y =ax0 + bx1
Regresję liniową wyznaczamy metodą najmniejszych kwadratów. W tym celu umieść dane
w tabeli. Obliczyć wg wzoru X*Y; X2; Y2 i umieść w tabeli.
N Cbiałka -X Ekstynkcja - Y X*Y X2 Y2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Suma
Wyznacz współczynnik b tego równania (współczynnik a = 0) dla podanej serii danych
wg poniższych wzorów:
Łx2 = ŁX2 - (ŁX)2/N b = Ł x*y/Łx2
Ł Ł Ł Ł Ł
Ł Ł Ł Ł Ł
Ł Ł Ł Ł Ł
Ły2 = ŁY2 - (Ł a= (ŁY-b*Ł
Ł Ł Ł Ł Ł
Ł Ł ŁY)2/N Ł ŁX)/N
Ł Ł Ł Ł Ł
Łx*y = ŁX*Y - (ŁX * ŁY)/N
Ł Ł Ł Ł
Ł Ł Ł Ł
Ł Ł Ł Ł
UWAGA !!!
Krzywa zależności ekstynkcji od stężenia jest liniowa tylko w określonym zakresie.
Nie można więc stosować uzyskanego równania do wyznaczania stężenia z ekstynkcji
większej niż wyznaczona w krzywej kalibracyjnej!!!
Wniosek: Badaną krzywą kalibracyjną opisuje równanie:........................................................
Podzadanie 4: oznaczanie białka w materiale biologicznym metodą Lowry ego
Pobrać 1 ml próby. Dodać 5 ml odczynnika C i starannie wymieszać. Pozostawić
w temperaturze pokojowej na 5 minut. Dodać 0,5 ml odczynnika D i energicznie
wymieszać. Po upływie 30 zmierzyć ekstynkcję przy długości fali 750. Obliczyć
stężenie białka w badanej próbie.
Porównać otrzymane wyniki z rzeczywistym stężeniem i wyciągnąć odpowiednie
wnioski.
4
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii
Biochemia dla Biologii nr ETCS
Oznaczanie stężenia białka w materiale biologicznym
LITERATURA
1. Biochemia , L. Stryer, PWN, Warszawa 1997 i nowsze
2.  Biochemia Harpera , R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 1995 i nowsze
3. Cytobiochemia , L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1995, 2002
4. Biochemia- Krótkie Wykłady , B. D. Hames i wsp., PWN, Warszawa 2002
5. Zarys Biochemii Cz.1, Karlson P., Pwn W-Wa 1987
6. Biochemia kręgowców, Minakowski W. PWN W-wa 1998
7. Ćwiczenia z biochemii , L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1999, 2003
8. Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J wyd. ART. 1997
9. Ćwiczenia z biochemii, Logoń A. wyd. ART. 1997
5
Koordynatorem przedmiotu jest Katedra Biochemii Przedmiot prowadzony przez Katedrę Biochemii