laboratorium przemysłowe
prof. dr hab. inż. Tadeusz Tuszyński
Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Immobilizacja drobnoustrojów
Możliwości ich przemysłowego wykorzystania
Streszczenie Summary
Immobilizacja drobnoustrojów może być naturalna lub celowo za- Immobilization of microorganisms can be natural or planned.
planowana. Wśród metod unieruchamiania wyróżnia się wiązanie Among methods of immobilizations linking at the surface of the
na powierzchni nośnika i wewnątrz matrycy lub bez użycia nośnika carrier material and inside the matrix or without the carrier as
oraz blokowanie komórek między półprzepuszczalnymi membra- well as cell blocking between semi-permeable membranes can be
nami. Istnieją duże możliwości przemysłowego wykorzystania mentioned. There are the huge possibilities of industrial applica-
immobilizowanych drobnoustrojów i biokatalizatorów, szczególnie tion of immobilized microorganisms and biocatalysts, especially
do różnych biosyntez i biotransformacji w procesach ciągłych for different kinds of biosyntheses and biotransformations in
i półciągłych. Upowszechnienie takich procesów wymaga dalszych continuous and semi-continuous processes. Making these pro-
badań fizjologii i metabolizmu komórek unieruchomionych. cesses more common needs further research on physiology and
metabolisms of immobilized cells.
Słowa kluczowe Key words
drobnoustroje, immobilizacja, zastosowanie, korzyści microbes, immobilization, application, benefits
Immobilizacją, czyli inaczej unieruchomieniem (łac. immobilis  nie- głównie uwarunkowane genetycznie, mogą być także wywoływane
ruchomy), można określić zespół metod, które ograniczają całko- za pomocą odpowiednich oddziaływań chemicznych i fizycznych.
wicie lub częściowo swobodę poruszania się określonych atomów, Naturalną skłonność mikroorganizmów do opadania i przylegania
cząsteczek, substancji lub materiału biologicznego na podłożu stałym  nawet do bardzo gładkich powierzchni  można wykorzystać nie
czy też wewnątrz specyficznych struktur. W przemyśle spożywczym tylko w procesach technologicznych, ale również do innych celów,
oprócz unieruchamiania substancji zapachowych coraz powszechniej np. zabezpieczania narzędzi chirurgicznych lub innych środowisk
wykorzystuje się (w procesach technologicz- przed skażeniem drobnoustrojami choro-
nych i analityce) immobilizowane enzymy, botwórczymi.
Od wielu lat trwają prace
komórki drobnoustrojów czy też organelli Należy zaznaczyć, że unieruchamianie
nad możliwością szerszego
komórkowych. Pierwsze procesy przemysłowe enzymów i ich przemysłowe użycie, głów-
wykorzystania komórek
z użyciem unieruchomionych enzymów były nie w procesach ciągłych (np. do różnych
unieruchomionych
stosowane już w latach 60. ubiegłego wieku. biokonwersji), jest już z powodzeniem re-
w procesach technologicznych.
Natomiast wytwarzanie octu z wykorzystaniem alizowane od lat.
Duży wzrost zainteresowania
samoodnawialnego złoża komórek bakterii Natomiast procesy unieruchamiania
kwasu octowego, zaadsorbowanych na wió- aplikacją takich systemów drobnoustrojów, przede wszystkim komó-
rach bukowych, było znane od XVII wieku. rek drożdży, są jeszcze w mniejszym zakre-
w różnych procesach
Złoża biologiczne z unieruchomioną biomasą sie wykorzystywane na skalę przemysłową.
biotechnologicznych, głównie
drobnoustrojów od ponad 100 lat są używane Zasadniczymi trudnościami są zmiana me-
w przemyśle spożywczym,
również w procesach oczyszczania ścieków. tabolizmu na poziomie komórkowym oraz
wynika z korzyści, jakie
Wprawdzie wymienione przykłady nie odnosiły problemy związane z modelowaniem takich
można osiągnąć z użycia
się do świadomego i celowego wykorzystania procesów. Trzeba zauważyć, że odkrywane
immobilizowanej biomasy.
drobnoustrojów w dawnych czasach (nieznane są również nowe możliwości aplikacyj-
było również pojęcie immobilizacji), to jed- ne szerokiego użycia immobilizowanego
nak trzeba zaznaczyć, że obecne odkrycia i sukcesy w tym względzie materiału biologicznego (enzymy, mikroorganizmy, organelle ko-
bazują na wiedzy i doświadczeniu z odległej historii. mórkowe, tkanki roślinne i zwierzęce, przeciwciała i inne związki
Unieruchamianie komórek jest procesem naturalnym, często biologicznie czynne) w diagnostyce medycznej, analityce żywności
występującym w przyrodzie. Polega na wiązaniu drobnoustrojów i napojów, monitoringu środowiskowym oraz innych dziedzinach,
w taki sposób, by ograniczyć ich swobodny ruch, jednak umoż- jako elementy receptorowe (np. w biosensorach).
liwić w miarę optymalną penetrację substratów do komórki i wy-
dalanie z niej metabolitów. Niektóre mikroorganizmy mają zdol- Metody unieruchamiania drobnoustrojów
ność do samoagregacji (flokulacji naturalnej) i wzrostu w postaci Wśród wielu znanych technik unieruchamiania biokatalizatorów
kuleczek, kłaczków lub biofilmu. Takie cechy drobnoustrojów są należy wyróżnić takie, które polegają na wiązaniu wewnątrz lub
Laboratorium | 10/2008
34
laboratorium przemysłowe
A B
Rys. 1. Unieruchamianie komórek na powierzchni nośnika: immobilizacja
adsorpcyjna (A), wiązanie kowalencyjne (B)
A B
Rys. 2. Unieruchamianie komórek w matrycy nośnika: pułapkowanie
w kuleczkach żelu (A), pułapkowanie we włóknach (B)
na powierzchni nośników nierozpuszczalnych, zamykaniu we-
wnątrz membran czy też unieruchamianiu bez udziału nośnika
mechanicznego.
Wiązanie na powierzchni nośnika
Dotyczy głównie takich drobnoustrojów, które wykazują na-
turalną skłonność osiadania i przylegania do powierzchni.
W obrębie tej grupy metod wyróżnia się adsorpcję i wiązanie
kowalencyjne komórek. Ważne jest wysokie powinowactwo
komórek do nośnika zapobiegające nadmiernym stratom po-
pulacji, szczególnie podczas szybkiego przepływu strumienia
substratu w bioreaktorze.
Adsorpcja i adhezja polegają na unieruchamianiu komórek
na powierzchni poprzez wiązania wodorowe, oddziaływania sił
van der Waalsa, jonowe, hydrofobowe, elektrostatyczne, powino-
wactwa lub kombinacje różnych sił. Taki sposób immobilizacji jest
bardzo prosty i tani, jednak ma podstawowe wady  stosunkowo
niskie stężenie biomasy na jednostkę objętości bioreaktora oraz
skłonność do desorpcji komórek w wyniku zmian pH, stężenia
jonowego i innych czynników. Jako nośników używa się różnych
materiałów: drewna, celulozy, jonitów, polimerów syntetycznych,
szkła porowatego, spieków ceramicznych, tlenków metali, ziemi
okrzemkowej i innych.
Z kolei wiązanie kowalencyjne polega na utworzeniu chemicz-
nych wiązań peptydowych, estrowych lub innych między nośnikiem
i grupami funkcyjnymi ściany komórkowej drobnoustroju.
Jako czynnik wiążący stosuje się aldehyd glutarowy, natomiast
nośnikami są różne materiały (szkło, ceramika, karboksymetylo-
celuloza, akrylany i inne). Stosowane czynniki wiążące mogą jed-
nak wywierać toksyczny wpływ na drobnoustroje. Stabilność tak
unieruchomionych komórek jest zwykle wysoka i nie obserwuje
się nadmiernych oporów dyfuzyjnych.
Laboratorium | 10/2008
35
35
laboratorium przemysłowe
Zalety procesów z użyciem komórek immobilizowanych
 ułatwione prowadzenie procesów ciągłych oraz ich automatyzacji i kontroli,
A B
 możliwość wielokrotnego użycia komórek,
 tworzenie zazwyczaj mniejszej ilości produktów ubocznych,
 większa specyficzność reakcji enzymatycznych oraz stabilność komórek,
 łatwiejsze oddzielenie końcowego produktu i biomasy,
 większa wydajność z jednostki objętości bioreaktora,
 zmniejszenie objętości użytkowej bioreaktorów i obniżenie kosztów
instalacji,
 korzystniejsze warunki przenikania tlenu z fazy gazowej do wodnej
 podwyższenie ekonomiki procesu,
 wyższa reaktywność i stabilność enzymów wewnątrzkomórkowych,
 istotne skrócenie czasu trwania fermentacji wtórnej win musujących
Rys. 3. Unieruchamianie komórek wewnątrz membran półprzepuszczal-
oraz procesu dojrzewania i stabilizacji win.
nych: kapsułkowanie (A), zamykanie pomiędzy membranami (B)
Wady procesów z użyciem komórek immobilizowanych
 brak wystarczającej wiedzy na temat ewentualnych zakłóceń funkcji
A B
metabolicznych komórek immobilizowanych,
 trudności z matematycznym modelowaniem procesów,
 ograniczenia dyfuzyjne i związane z tym trudności w przenikaniu
substratów i produktów reakcji enzymatycznych,
 częściowe wymywanie komórek ze złoża,
 straty aktywności i stabilności komórek oraz reakcji enzymatycznych
wraz z upływem czasu,
 brak wystarczających informacji dotyczących fizjologii drobnoustrojów
unieruchomionych,
 ciągłe poszukiwanie optymalnych i uniwersalnych nośników o dobrej
wytrzymałości mechanicznej, neutralnych w stosunku do środowiska
Rys. 4. Unieruchamianie bez makroskopowego nośnika: sieciowanie prze-
procesu technologicznego i innych korzystnych właściwościach.
strzenne (A), flokulacja (B)
Wiązanie w matrycy nośnika Unieruchamianie bez użycia nośnika mechanicznego
Metoda polega na fizycznym zamknięciu komórek w matrycy poli- W obrębie tej grupy metod wyróżnia się następujące sposoby:
meru  tzw. pułapkowanie w żelach naturalnych lub syntetycznych.  sieciowanie przestrzenne,
Jako nośniki stosuje się agar, alginiany, karageny, kolagen, poliure-  flokulacja komórek przy udziale elektrolitów,
tan, poliakrylamid, włókna octanu celulozy i inne materiały.  naturalna flokulacja (samoagregacja) oraz wzrost drobnoustro-
Materiał biologiczny można też wymieszać z roztworem jów w postaci kuleczek lub kłaczków biomasy.
nośnika (monomer lub nieusieciowany polimer) i środka sie- Sieciowanie polega na wiązaniu ze sobą komórek drobnoustroju
ciującego, następnie mieszanina poddawana jest polimeryza- różnymi reagentami, zdolnymi do reakcji z grupami funkcyjnymi
cji. W efekcie powstaje trójwymiarowa struktura żelu, w której ich ściany komórkowej.
unieruchomione są komórki drobnoustrojów. W tym przypad- Czynnikami sieciującymi mogą być aldehyd glutarowy,
ku jako nośników używa się akrylamidów, żelów skrobiowych, chlorek cyjanurowy lub heksametylenocyjaniany. Wzajemne
kopolimerów akrylowych czy też polianiliny i nylonu. Techniki sieciowanie jest techniką łatwą i tanią. Daje zazwyczaj dość
wiązania w matrycy nośnika są proste i pozwalają ukształtować trwały biomateriał, jednak może prowadzić także do częścio-
żel w różnej postaci (granulki, kuleczki, folie). Odpowiednia wej utraty aktywności i utrudniać dyfuzję substratów. Metoda
porowatość polimeru powinna umożliwić przenikanie substan- ta jest zalecana raczej do procesów z użyciem substratów ma-
cji odżywczych do immobilizownych komórek oraz transport łocząsteczkowych.
metabolitów na zewnątrz. Flokulacja definiowana jest jako zdolność komórek będących
Pewne problemy mogą stanowić opory dyfuzyjne utrudniające w zawieszeniu do tworzenia większych skupień i konglomera-
wymianę metabolitów i substancji odżywczych. tów w postaci kłaczków, które ulegają szybkiej sedymentacji.
Procesy flokulacji pozwalają utrzymać wysoką gęstość populacji
Zamykanie wewnątrz półprzepuszczalnych membran drobnoustrojów w bioreaktorze, bez stosowania nośników i in-
Materiał biologiczny jest zamykany w mikrokapsułkach lub po- nych materiałów. Przyspieszenie procesu samoagregacji można
między półprzepuszczalnymi membranami, przez które mogą dy- spowodować poprzez regulację pH, skład pożywki, stężenie
fundować substraty i metabolity. rozpuszczonego tlenu i inne czynniki (np. dodatek polielek-
Komórki drobnoustrojów zachowują dobrą aktywność, gdyż trolitów).
znajdują się w naturalnym otoczeniu. I w tym przypadku mogą
występować opory dyfuzyjne na membranie. Na membrany Zastosowanie drobnoustrojów
i do kapsułkowania używa się takich materiałów, jak silikon, immobilizowanych
nylon, polioctan, celuloza i poliwęglany. Techniki zamykania Od wielu lat trwają prace nad możliwością szerszego wykorzy-
komórek są dość proste i tanie do przeprowadzenia, jednak stania komórek unieruchomionych w procesach technologicz-
mogą mieć zastosowanie wyłącznie do przemian substratów nych. Duży wzrost zainteresowania aplikacją takich systemów
małocząsteczkowych. w różnych procesach biotechnologicznych, głównie w przemyśle
Laboratorium | 10/2008
36
laboratorium przemysłowe
spożywczym, wynika z korzyści, jakie można osiągnąć z użycia
immobilizowanej biomasy. Największe szanse przemysłowego
wykorzystania istnieją w procesach biosyntezy witamin, amino-
kwasów i kwasów organicznych, a szczególnie fermentacji eta-
nolowej (tabela 1, s. 38).
Preparaty komórek drobnoustrojów immobilizowanych są droż-
sze od podobnych preparatów komórek wolnych, dlatego też po
zakończonym procesie należy odzyskać biomasę i przygotować
do ponownego użycia. Z tej przyczyny do stosowania immobili-
zowanych kultur drobnoustrojów przemysłowych nadają się tylko
płyny o odpowiedniej konsystencji i klarowności. Warunki te speł-
niają wszystkie roztwory fermentacyjne  brzeczka piwna, nastawy
winiarskie, brzeczki miodowe, klarowane zaciery gorzelnicze oraz
inne media i podłoża płynne stosowane w procesach biosyntezy
i biotransformacji.
W niektórych przypadkach celowe jest wykorzystanie w pro-
cesach technologicznych koimmobilizatów. Koimmobilizacja
polega najczęściej na jednoczesnym wiązaniu (unieruchamianiu)
enzymu i komórek drobnoustrojów. Przykładem może być wiąza-
nie kowalencyjne białka enzymatycznego w strukturze alginianu
i następnie immobilizacja komórek drożdży na zasadzie inkluzji
 otrzymujemy drobiny koimmobilizatu o średnicy ok. 2 mm.
Innym przykładem jest unieruchamianie enzymu na ścianie
komórkowej drożdży. Lekko podsuszone komórki drożdży
umieszczamy w roztworze glukoamylazy, następuje rehydratacja
i adsorpcja enzymu na ścianie komórkowej. W kolejnym etapie
strukturę tę stabilizujemy roztworem aldehydu glutarowego i ta-
niny. W efekcie tworzą się wiązania między cząsteczkami białka
enzymatycznego, jak również między enzymem i grupami funk-
cyjnymi ściany komórkowej. Powstały preparat koimmobilizatu
o średnicy ok. 0,01 mm może być zastosowany do jednoczesnej
hydrolizy skrobi i następczej fermentacji w jednoetapowym
procesie technologicznym. Prowadzenie procesów ciągłych
z komórkami immobilizowanymi lub koimmobilizowanymi
wymaga odpowiednich bioreaktorów, które zapewnią m.in. jak
najmniejsze straty aktywnych komórek podczas odprowadzania
strumienia z górnej strefy bioreaktora.
Podsumowanie
Unieruchomione komórki drobnoustrojów i enzymy znajdują
zastosowanie w różnych obszarach przemysłu spożywczego,
farmaceutycznego, chemicznego, ochronie środowiska oraz
szeroko pojętej analityce, diagnostyce i monitoringu; jako ele-
menty receptorowe (czuła warstwa na dany analit) w bioczujni-
kach i biosensorach. Dużą zaletą komórek immobilizowanych
jest ich przydatność do prowadzenia procesów ciągłych i pół-
ciągłych, jak również łatwość wydzielania produktu i komórek
oraz mniejsze ryzyko zakażeń mikrobiologicznych. Korzyści
wynikające z możliwości szerokiego zastosowania immobiliza-
tów powodują wzrost zainteresowania nauki i przemysłu ich
aplikacją do wielu procesów biotechnologicznych, m.in. pro-
dukcji bioetanolu, fermentacji i stabilizacji w piwowarstwie,
winiarstwie, biosyntezie kwasów organicznych, aminokwasów,
antybiotyków, nukleotydów oraz otrzymywania fermentowanych
napojów mlecznych (kultury starterowe ) i różnych syropów
poprzez hydrolizę dwu- i wielocukrów. Technologie z zastoso-
waniem unieruchomionych komórek i enzymów pozwalają na
znaczne zwiększenie produktywności bioreaktorów w porównaniu
z procesami tradycyjnymi (komórki wolne). Ich wprowadzenie
Laboratorium | 10/2008
37
37
laboratorium przemysłowe
Kultura
Rodzaje nośnika Produkt
mikroorganizmów
Saccharomyces materiał ceramiczny,
etanol
cerevisiae drewno, żelatyna
Saccharomyces alginian, karagen lub
etanol
cerevisiae poliakrylamid
Saccharomyces na szeroką skalę wymaga jednak jeszcze dalszych badań, które
żywice jonowymienne etanol
cerevisiae
pozwolą lepiej poznać fizjologię i metabolizm drobnoustrojów
immobilizowanych.
alginian, włókno
Zymomonas mobilis etanol
drewniane
Piśmiennictwo
alginian, żelatyna
Saccharomyces
sieciowana, karagen, wino 1. Bednarski W., Reps A.: Biotechnologia żywności. WNT, Warszawa
bayanus
wióry dębowe
2001.
2. Chibata I., Tosa T., Sato T.: Methoda of cell immobilization.  Enzyme.
alginian wapnia,
Saccharomyces
Microb. Technol.. , 18, 217-227, 1980.
ziemia okrzemkowa, piwo
uvarum
DEAE  celuloza
3. Fumi M.D., Ragg E., Battiscotti G., Colagrande O.: Alginate immobi-
lized Saccharomyces cerevisiae cell alternations during alcoholic fermentation.
karagen,
Escherichia coli kwas asparaginowy
 Ital. J. Food Sci. , 3, 325- 337, 1994.
poliakrylamid
4. Junter G.A., Coquet L., Vilain S., Jouenne T.: Immobilized  cell physiology:
Brevibacterium flavum kolagen kwas glutaminowy
current data and the potentialities proteomics.  Enzyme Microb. Technol. ,
31, 201-212, 2002.
Propionibacterium acidi
włókno bawełny kwas propionowy
5. Kourkoutas Y., Bekatorou A., Banat I.M., Marchant R., Koutinas A.A.:
-propionici
Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages
karagen, wióry
production.  Food Microbiol. , 21, 377-397, 2004.
Gluconobacter oxydans bukowe, szkło kwas octowy
6. Moll M., Duteurtre B.: Fermentation and maturation of beer with immobi-
porowate
lized microorganisms.  Brauwelt International , 3, 248-251, 1996.
Corynebacterium
7. Olejnik A., Czaczyk K.: Zastosowanie komórek immobilizowanych w prze-
alkohol poliwinylowy lizyna
glutamicum
myśle spożywczym.  Przem. Spoż. , 1, 39-42, 1998.
Clostridium kulki szkła 8. P
ztop H.N., P
ztop A.Y. , Karadag E., Isikver Y., Saraydin D.: Immobi-
etanol
thermosaccharolyticum porowatego
lization of Saccharomyces cerevisiae on to acrylamide  sodium acrylate hydro-
gens for production of alcohol.  Enzyme Microb. Technol , 32, 114-119,
Bacillus
alginian ą-amylaza
2002.
amyloliquefaciens
9. Praca zbiorowa pod red. Jankiewicza M. i Kędziora Z.: Metody pomia-
Drożdże
alginian, agaroza ą-glukanaza rów i kontroli jakości w przemyśle spożywczym i biotechnologii. Wyd. AR,
rekombinowane
Poznań 2001.
alginian, żele
10. Qureshi N., Tamhane D.V.: Production of mead by immobilized Hansenula
Bakterie kwasu
polisacharydowe, jogurt
anomala.  Appl. Microbiol. Biotechnal. , 27, 27-30, 1987.
mlekowego
karagen
11. Van De Winkel L.: Design and optimization of a multipurpose immobilized
Bakterie kwasu yeast bioreactor system for brewery fermentation.  J. of Brewing and Biotech-
biologiczne odkwaszanie
mlekowego  szczepy alginian, drewno
nology , 20 (1), 77-80, 1985.
moszczów i win
odkwaszające
12. Walsh P.K., Malone D.M.: Cell growth patterns in immobilization matrices.
Tabela 1. Wybrane przykłady zastosowań drobnoustrojów immobilizowanych
 Biotech. Adv. , 13, 13-43, 1995.
Laboratorium | 10/2008
38
fot. Shutterstock