PODSTAWY BIOTECHNOLOGII

OTRZYMYWANIE PROTOPLASTÓW Z LIŚCI SAŁATY (2h)

I. Przygotowanie sałaty

1. Wyciąć z liścia sałaty fragmenty o wymiarach mniej więcej 2 mm x 2 mm.

2. Do probówki z 9.5 ml 13% roztworu sorbitolu dodać od 20-30 uzyskanych powyżej

fragmentów liścia sałaty.

3. Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37˚C przez 5 minut.

Podczas inkubacji liście sałaty wyrównują potencjał osmotyczny z roztworem

sorbitolu.

II. Enzymatyczne zniszczenie ściany komórkowej

1. Do probówek delikatnie dodać 0,5 ml roztworu hydrolaz glikozydowych.

2. Z powrotem umieścić probówkę w łaźni wodnej na 20 minut, podczas inkubacji, od

czasu do czasu, ostrożnie wstrząsać probówką. Mieszanina hydrolaz glikozydowych zawiera pektynazy, celulazy i inne enzymy rozkładające ścianę komórki roślinnej.

III. Uzyskanie protoplastów

1. Dokładnie i mocno zwinąć gazę i umieść ją ściśle na spodzie lejka.

2. Przefiltrować nadtrawione fragmenty liści sałaty przez upakowaną gazę w lejku.

3. Po przefiltrowaniu tkanki roślinnej należy przepłukać filtr w lejku 2 ml 13% roztworu sorbitolu. Następnie zebrać całą przefiltrowaną zawiesinę do naczyniek

wirówkowych. Protoplasty powinny przejść przez filtr, podczas gdy większość

nienadtrawionych komórek oraz szczątków tkanki roślinnej powinna osiąść na filtrze.

4. Odwirować przesącz przez 5 minut przy obrotach 5000 razy na minutę.

5. Ostrożnie zebrać supernatant znad zwirowanych komórek, pozostawiając peletkę protoplastów na dnie probówki. Wykorzystać bibułkę w celu odciągnięcia nadmiaru płynu pozostałego na ściankach wewnątrz probówki.

6. Ponownie zawiesić peletkę protoplastów w około 0,1 ml 21% roztworu sacharozy (roztwór pozwalający uzyskać równowagę osmotyczną).

IV. Obserwacje protoplastów

1. Protoplasty można utrzymać w stanie nienaruszonym w roztworze sacharozy przez kilka godzin.

2. Przygotować preparat mikroskopowy, nakryć szkiełkiem nakrywkowym, nie

wybarwiać.

3. Protoplasty oglądać pod mikroskopem, pod powiększeniem 40 razy.

Obserwacje, wyniki i wnioski należy zamieścić w formie sprawozdania w zeszycie

ćwiczeniowym.

Literatura

1. Bajaj Y.P.S. Biotechnology in Agriculture and Forestry, vol. 1-10 - ed. Springer

Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, 1988.

2. Bednarski W., Reps A. (red.) Biotechnologia żywności. Wydawnictwo Naukowo

Techniczne, Warszawa, 2003.

3. Bednarski W. (red) Biotechnologia żywności. Wydawnictwo Art., Olsztyn, 1993.

4. Legocki A.B. (red.) Transformowanie i regeneracja roślin. Instytut Chemii

Bioorganicznej PAN, Poznań, 1990.

5. Libudzisz Z., Kowal K. (red.) Mikrobiologia techniczna. Tom II, Wydawnictwo

Politechniki Łódzkiej, Łodź, 2000.

6. Malepszy S., Niemirowicz-Szczytt K., Przybecki Z..Biotechnologia w genetyce i

hodowli roślin. PWN, Warszawa, 1989

7. Malepszy S. (red.) Wprowadzenie do biotechnologii w genetyce i hodowli roślin.

Wyd. SGGW, Warszawa 1990

8. Pijanowski E., Dłużewski M., Dłużewska A., Jarczyk A. Ogólna technologia

żywności. Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa, 2004.

9. Wareing P.F., Phillips I.D.J. Przekład zbiorowy pod redakcją Lidii D. Wasilewskiej-Dąbrowskiej. Wzrost i różnicowanie się roślin. PWN, Warszawa, 1985.

10. Zenkteler M. Hodowla komórek i tkanek roślinnych. PWN, Warszawa, 1984.