dr in\
. Aneta Białkowska
ANALIZA SKA
ADU AMINOKWASOWEGO
METODA CHEMICZNA
Skład aminokwasowy białka wyznacza się zwykle po jego hydrolizie
kwasowej, np. w 6M HCl w temperaturze 105-110�C przez 24 godz. W
tych warunkach tryptofan ulega prawie całkowitemu rozło\
eniu, a
częściowemu cystyna, cysteina i metionina.
W celu uwolnienia tryptofanu z łańcucha polipeptydowego
praktycznie bez strat stosuje się hydrolizę zasadową roztworem Ba(OH)2,
gotując hydrolizat przez 24 godziny.
W celu oznaczenia w białku cystyny, cysteiny i metioniny bez
strat, przed kwaśną hydrolizą poddaje się białko reakcji utleniania za
pomocą kwasu nadmrówkowego, w wyniku której z cystyny i cysteiny
powstaje kwas cysteinowy, a z metioniny sulfon metioniny, produkty te są
odporne na długotrwałe gotowanie z kwasem solnym.
Walina i izoleucyna uwalniają się dość trudno z białka i dlatego oznacza
się je dopiero po 96 godz. hydrolizy.
METODA ENZYMATYCZNA
Subtylizyna i pronaza (proteaza ze Streptomyces griseus) hydrolizują białka
całkowicie, ale reakcja enzymatyczna biegnie bardzo wolno.
dr in\
. Aneta Białkowska
ANALIZA SKA
ADU AMINOKWASOWEGO
Rozdział i ilościowe oznaczanie aminokwasów w
hydrolizatach kwasowych
Chromatografia jonowymienna RP-HPLC (derywatyzacja przed
na sulfonowanych \
ywicach kolumną)
polistyrenowych
Reakcja np. z N-(4-chinolilo)
Reakcja z ninhydryną
karbaminianem N-sukcynoimidu
 przekształcenie aminokwasów
w pochodne fluorescencyjne
Detekcja promieniowania w
zakresie światła widzialnego
Detekcja promieniowania
fluorescencyjnego
Metoda Moore a i Steina
dr in\
. Aneta Białkowska
ANALIZA SKA
ADU AMINOKWASOWEGO
ANALIZA SKA
ADU AMINOKWASOWEGO POZWALA OKREŚLIĆ, W
JAKICH STOSUNKACH MOLOWYCH WYST
PUJ

POSZCZEGÓLNE AMINOKWASY W POLIPEPTYDZIE, ALE NIE
DOSTARCZA INFORMACJI O ICH KOLEJNOŚCI.
dr in\
. Aneta Białkowska
IDENTYFIKACJA N-TERMINALNEGO AMINOKWASU
dr in\
. Aneta Białkowska
IDENTYFIKACJA N-TERMINALNEGO AMINOKWASU
dr in\
. Aneta Białkowska
IDENTYFIKACJA N-TERMINALNEGO AMINOKWASU
dr in\
. Aneta Białkowska
IDENTYFIKACJA N-TERMINALNEGO AMINOKWASU
MIMO DUśEJ CZUA
OŚCI WI
KSZOŚCI OMÓWIONYCH
METOD OZNACZANIA AMINOKWASÓW N-KOC
COWYCH, NIE
MOśNA ICH STOSOWAĆ WIELOKROTNIE DO ANALIZY TEJ
SAMEJ PRÓBY POLIPETYDU, PONIEWAś PODCZAS
HYDROLIZY KWASOWEJ POLIPEPTYD ULEGA CAA
KOWITEJ
DEGRADACJI DO WOLNYCH AMINOKWASÓW.
dr in\
. Aneta Białkowska
IDENTYFIKACJA C-TERMINALNEGO AMINOKWASU
dr in\
. Aneta Białkowska
IDENTYFIKACJA C- LUB N-TERMINALNEGO
AMINOKWASU (HYDROLIZA ENZYMATYCZNA POLIPEPTYDU)
SPECYFICZNE EGZOPEPTYDAZY
KARBOKSYPEPTYDAZY AMINOPEPTYDAZY
(odszczepiają (odszczepiają
po jednej reszcie aminokwasowej od C- po jednej reszcie aminokwasowej od N-
końca począwszy) końca począwszy)
Karboksypeptydaza B
Karboksypeptydaza A charakteryzuje
odłącza od C-końca polipeptydu
się szeroką specyficznością, z C-końca
tylko aminokwasy zasadowe.
polipeptydu najszybciej uwalnia Tyr, Phe,
Trp, Leu, Ile, Met, Thr, Gln, His, Ala, Val, nie
uwalnia Pro, ani Arg, natomiast pozostałe
aminokwasy odłącza wolno lub bardzo wolno.
dr in\
. Aneta Białkowska
SEKWENCJONOWANIE BIAA
KA ENZYMATYCZNEGO
dr in\
. Aneta Białkowska
SEKWENCJONOWANIE BIAA
KA ENZYMATYCZNEGO
W CELU USTALENIA SEKWENCJI DA
UGIEGO POLIPEPTYDU NALEśY
GO NAJPIERW ROZCI
Ć NA MNIEJSZE FRAGMENTY SKA
ADAJ
CE
SI
Z 20-50 RESZT, KTÓRE PO ROZDZIELENIU PODDAJE SI

SEKWENCJONOWANIU.
SPECYFICZNE POCI
CIE POLIPEPTYDU MOśNA OSIAGN
Ć
METODAMI CHEMICZNYMI LUB ENZYMATYCZNYMI.
dr in\
. Aneta Białkowska
CHEMICZNA HYDROLIZA POLIPEPTYDÓW
dr in\
. Aneta Białkowska
ENZYMATYCZNA HYDROLIZA POLIPEPTYDÓW
ENDOPROTEINAZY
TRYPSYNA
CHYMOTRYPSYNA
(hydrolizuje białka po C-terminalnej stronie
(hydrolizuje białka po C-terminalnej stronie
reszt lizynowych i argininowych  a więc
reszt aminokwasów aromatycznych (Phe,
aminokwasów zasadowych  zostawiając te
Tyr, Trp)
reszty na końcach C peptydów powstających
w wyniku jej działania)
PROTEINAZA V8 (Staphylococcus aureus)
PROTEINAZA izolowana z opieńki
miodowej (Armillaria mellea)
(hydrolizuje białka po C-terminalnej stronie
reszt kwasu glutaminowego)
(hydrolizuje białka po N-terminalnej stronie
reszt lizyny)
dr in\
. Aneta Białkowska
SEKWENCJONOWANIE BIAA
KA ENZYMATYCZNEGO
METODA NAKA
ADAJ
CYCH SI
FRAGMENTÓW PEPTYDÓW
dr in\
. Aneta Białkowska
SEKWENCJONOWANIE BIAA
KA ENZYMATYCZNEGO-
SPEKTROMETRIA MAS
dr in\
. Aneta Białkowska
SEKWENCJONOWANIE BIAA
KA ENZYMATYCZNEGO -
BADANIA PROTEOMICZNE
PROTEOMIKA  ZAJMUJE SI
BADANIEM RZECZYWISTEJ
EKSPRESJI INFORMACJI GENETYCZNEJ, A WI
C SKUPIA SI
NA
BADANIU, KTÓRE BIAA
KA S
TAK NAPRAWD
PRODUKOWANE
PRZEZ DANY ORGANIZM B
Dy
KOMÓRKI OKREŚLONEGO TYPU.
ETAPY W BADANIACH PROTEOMICZNYCH:
1. elektroforeza dwuwymiarowa
2. spektrometria mas
dr in\
. Aneta Białkowska
SEKWENCJONOWANIE BIAA
KA ENZYMATYCZNEGO -
BADANIA PROTEOMICZNE
ELEKTROFOREZA DWUKIERUNKOWA
1. ELEKTROFOREZA W PIERWSZYM WYMIARZE
Prowadzona jest z u\
yciem gradientu pH. Ka\
de białko migruje do
takiego miejsca na \
elu, w którym przestaje być obdarzone ładunkiem
(czyli do swojego punktu izoelektrycznego) i tam się zatrzymuje.
Technikę tę nazywamy ogniskowaniem izoelektrycznym.
2. ELEKTROFOREZA W DRUGIM WYMIARZE
Prowadzona jest w obecności dodecylosiarczanu sodu, zró\
nicowanie
migracji białek opiera się w tym wypadku na ró\
nicach w ich masach
cząsteczkowych.
Metodą elektroforezy dwuwymiarowej mo\
na rozdzielić ponad 1000
białek. Jest to przy tym metoda bardzo czuła: pozwala na wykrywanie
białek na poziomie fentomolowym (10-15 mola).
dr in\
. Aneta Białkowska
SEKWENCJONOWANIE BIAA
KA ENZYMATYCZNEGO -
BADANIA PROTEOMICZNE
Obraz po dwuwymiarowej elektroforezie białek ekstraktów komórkowych. Ogniskowanie
izoelektryczne przeprowadzono w poziomie, a elekktroforezę w obecności SDS  w pionie. Zdjęcia
zaczerpnięte z bazy danych SWISS-2DPAGE.
dr in\
. Aneta Białkowska
SEKWENCJONOWANIE BIAA
KA ENZYMATYCZNEGO -
BADANIA PROTEOMICZNE
Obraz po dwuwymiarowej elektroforezie białek ekstraktów komórkowych. Ogniskowanie
izoelektryczne przeprowadzono w poziomie, a elekktroforezę w obecności SDS  w pionie. Zdjęcia
zaczerpnięte z bazy danych SWISS-2DPAGE.
dr in\
. Aneta Białkowska
SEKWENCJONOWANIE BIAA
KA ENZYMATYCZNEGO -
BADANIA PROTEOMICZNE
dr in\
. Aneta Białkowska
OKREŚLENIE TRÓJWYMIAROWEJ STRUKTURY
(KONFORMACJI) BIAA
KA ENZYMATYCZNEGO
1. Rentgenografia strukturalna
Opiera się na rejestracji obrazów dyfrakcyjnych promieni
rentgenowskich, powstających na skutek subtelnych interakcji tego
promieniowania z chmurami elektronowymi atomów, tworzących
analizowany kryształ. Na podstawie rejestracji obrazów
dyfrakcyjnych promieniowania X przechodzącego przez kryształ pod
ró\
nymi kątami wyznacza się trójwymiarową mapę gęstości
elektronowej w komórce elementarnej kryształu.
2. Modelowanie molekularne
Opiera się na domniemaniu, \
e dwa białka wykazujące homologię co
do sekwencji aminokwasowej mają podobną strukturę przestrzenną.
Usługa słu\
ąca do przewidywania struktury o nazwie SWISS-MODEL
jest dostępna na stronie ExPASy
(http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html).
dr in\
. Aneta Białkowska
OKREŚLENIE TRÓJWYMIAROWEJ STRUKTURY
(KONFORMACJI) BIAA
KA ENZYMATYCZNEGO