dr in\
. Aneta Białkowska
IMMOBILIZACJA
ENZYMÓW I KOMÓREK
dr in\
. Aneta Białkowska
Biokatalizatory unieruchomione
Immobilizacja  przeprowadzenie biokatalizatora ze
stanu rozpuszczalnego w nierozpuszczalny
Immobilizacja  proces umo\
liwiajÄ…cy wielokrotne
wykorzystanie biokatalizatora
dr in\
. Aneta Białkowska
Typy biokatalizatorów unieruchomionych
Preparaty pojedynczych enzymów
Kompleksy dwóch lub większej ilości enzymów
Całe komórki bez zachowania ich funkcji \
yciowych
śywe komórki z zachowaniem ich aktywności
metabolicznej i zdolności do rozmna\
ania
Struktury subkomórkowe
dr in\
. Aneta Białkowska
Zalety wykorzystywania biokatalizatorów
unieruchomionych
Mo\
liwość łatwego oddzielenia
biokatalizatora od mieszaniny reakcyjnej
" mo\
liwość wielokrotnego stosowania
" mo\
liwość uzyskania produktu w czystej formie,
pozbawionej biokatalizatora
Mo\
liwość pracy w systemie ciągłym
Zwiększenie stabilności enzymów
Zwiększenie odporności na działanie
chemicznych odczynników denaturujących
Mo\
liwość stosowania enzymów w
środowisku rozpuszczalników organicznych
dr in\
. Aneta Białkowska
Ograniczenia w wykorzystywaniu
biokatalizatorów unieruchomionych
Proces immobilizacji podnosi koszty otrzymywania
preparatów enzymatycznych o cenę nośnika i
innych reagentów oraz koszty samego procesu
immobilizacji,
Immobilizacja mo\
e powodować częściową
inaktywację enzymów lub zmianę ich
specyficzności,
Enzym immobilizowany na nośnikach stałych jest
fizycznie ograniczony od fazy ciekłej, zatem jego
dostęp do substratu mo\
e być równie\
ograniczony
dr in\
. Aneta Białkowska
Przemysłowe zastosowanie
immobilizowanych enzymów
Enzym Zastosowanie
Izomeraza glukozowa Przetwórstwo skrobi
Glukoamylaza Przetwórstwo skrobi
Lipaza Produkcja tłuszczów jadalnych
Termolizyna Produkcja aspartamu
Inwertaza Produkcja cukru
inwertowanego
Amidaza penicylinowa Produkcja kwasu 6-
aminopenicylanowego
²-tyrozynaza Produkcja L-DOPA
Nitrylaza Produkcja akrylamidu
dr in\
. Aneta Białkowska
ZASTOSOWANIE CAA
YCH KOMÓREK JAKO
BIOKATALIZATORÓW
ZALETY WADY
1. eliminacja pracochłonnych i kosztownych 1. stosując immobilizowane komórki otrzymuje się
procesów związanych z izolacją oraz oczyszczaniem biokatalizatory o znacznie ni\
szej aktywności
enzymów, enzymatycznej. Przykładem mo\
e być amidaza
penicylinowa, której aktywność wynosi 400
2. zachowanie wy\
szej reaktywności i stabilności
u/g, gdy jest oczyszczona i bezpośrednio
biokatalizatora, gdy\
enzymy znajdujÄ… siÄ™ w swoim
związana z nośnikiem, natomiast aktywność
naturalnym środowisku (\
ywe komórki). Wynikiem
immobilizowanych komórek E. coli
tego jest zwiększenie ich stabilności termicznej,
zawierajÄ…cych ten enzym wynosi tylko 0,12
zmniejszenie wra\
liwości na termiczne zmiany pH i
u/g,
wpływ niektórych czynników chemicznych,
2. występują ograniczenia przenoszenia masy z
3. mo\
liwość prowadzenia procesów bardziej
powodu du\
ej gęstości komórek
zło\
onych, np. wymagających regeneracji kofaktorów
unieruchomionych na nośnikach,
(NAD, ATP),
3. stosowane do immobilizacji odczynniki mogÄ…
4. Å‚atwiejsze prowadzenie reakcji
zabijać komórki lub unieczynniać enzymy (np.
wieloenzymatycznych,
katalizatory i inicjatory polimeryzacji,
5. immobilizacja zwiększa odporność na ataki obcej
odczynniki sieciujÄ…ce)
mikroflory i fagów, choć dłu\
sze stosowanie niesie ze
4. mogą być katalizowane ró\
ne reakcje uboczne
sobÄ… ryzyko zaka\
eń
poprzez inne enzymy zawarte w komórce. Mo\
e
to zmniejszyć wydajność procesu i
zanieczyszczać produkty końcowe,
5. niekontrolowany wzrost komórek
immobilizowanych mo\
e być równie\

problemem. Åšwie\
e komórki mogą bowiem
odrywać się od powierzchni nośnika i
zanieczyszczać produkty oraz wykorzystywać
substrat jako z
ródło do wzrostu
dr in\
. Aneta Białkowska
Metody unieruchamiania biokatalizatorów
A  adsorpcja, B  wiązanie kowalencyjne, C, D, E  pułapkowanie,
F  kapsułkowanie, G  zamykanie pomiędzy membranami, H 
sieciowanie, I  naturalna flokulacja biomasy
dr in\
. Aneta Białkowska
METODY UNIERUCHAMIANIA ENZYMÓW I KOMÓREK
A  UNIERUCHAMIANIE NA POWIERZCHNI NOÅšNIKA
B  UNIERUCHAMIANIE WEWN
TRZ NOÅšNIKA
dr in\
. Aneta Białkowska
Podstawowe sposoby unieruchamiania
biokatalizatorów
Wiązanie na powierzchni nośnika:
adsorpcja fizyczna
Jest to metoda najprostsza i najtańsza, ale nie zapewniająca trwałego związania
enzymu z matrycÄ…, gdy\
zmiana siły jonowej lub pH środowiska reakcji mo\
e
powodować desorpcję białka enzymatycznego.
Stosowane są nośniki organiczne i nieorganiczne.
Do organicznych zaliczamy: pochodne celulozy, polimery, \
ywice jonowymienne,
chityny, kolagen i inne.
Do nieorganicznych zaliczamy: materiały ceramiczne, szkło porowate, wymieniacze
jonowe, tlenki metali, węgiel, ferromagnetyki.
dr in\
. Aneta Białkowska
Podstawowe sposoby unieruchamiania
biokatalizatorów
Wiązanie na powierzchni nośnika
wiązanie kowalencyjne (bezpośrednie przyłączenie biokatalizatora do
nośnika bądz
pośrednie przyłączenie za pomocą czynnika
sprzęgającego).
Cząsteczka białka enzymatycznego wiązana jest z nośnikiem poprzez wolne grupy karboksylowe  COO (Asp, Glu,
C-terminalne), fenolowÄ… (Tyr), sulfhydrylowÄ… (Cys), aminowe (Lys), imidazolowÄ… (His), grupy hydroksylowe (Thr,
Ser) oraz reszty glikozydowe w glikoproteinach i inne. Sposób związania enzymu z nośnikiem zale\
y od typu
przeprowadzonej reakcji chemicznej (najczęściej są to wiązania peptydowe, estrowe, diazoniowe, itp.).
Najczęściej stosowane nośniki to agar, agaroza, chityna, celuloza, kolagen, polimery organiczne (poliuretany,
polistyren, nylon), substancje nieorganiczne (szkło porowate, tlenek glinu, silika\
el, magnetyt, tlenek niklu, itp.).
dr in\
. Aneta Białkowska
Odczynniki wiÄ…\
Ä…ce stosowane w metodach
immobilizacji
Związki dwufunkcyjne wchodzące w skład układu
enzym-nośnik:
" aldehyd glutarowy
" diaminy
" kwasy dikarboksylowe
ZwiÄ…zki aktywujÄ…ce grupy funkcyjne, ale nie
wchodzące w skład układu enzym-nośnik:
" karbodiimid
" epichlorohydryna (1-chloro-2,3-epoksypropan)
" chlorek tosylu (chlorek p-toluenosulfonowy)
dr in\
. Aneta Białkowska
Immobilizacja enzymów z
zastosowaniem aldehydu glutarowego
dr in\
. Aneta Białkowska
Immobilizacja enzymów z zastosowaniem
karbodiimidu (EDC)
EDC  N-[3-dietyloaminopropylo]-N-etylokarbodiimid
dr in\
. Aneta Białkowska
Podstawowe sposoby unieruchamiania
biokatalizatorów
Wiązanie wewnątrz nośnika:
wiązanie w matrycy nośnika (tzw. pułapkowanie)
Metoda polega na zmieszaniu biokatalizatora z monomerem lub rozpuszczalnym
polimerem i przeprowadzeniu procesu polimeryzacji lub usieciowania w celu
utwardzenia \
elu (w formie kulek, bloków, włókien). W tym wypadku cząsteczki
enzymów (lub komórki drobnoustrojów) zamykane są wewnątrz nośnika w sposób
mechaniczny i nie ma zagro\
enia utraty ich aktywności enzymatycznej, co mo\
e
zachodzić przy tworzeniu wiązań chemicznych. Istotnym problemem jest natomiast
uzyskanie \
elu o odpowiedniej porowatości, zapewniającej zatrzymanie biokatalizatora
wewnątrz i jednoczesne zabezpieczenie właściwej dyfuzji substratów i produktów.
Sposoby pułapkowania:
\
elowanie, np. agar lub \
elatyna;
krio\
ele, np. \
ele alkoholu poliwinylowego zestalajÄ…ce siÄ™ w -20°C;
precypitacja polimerów w rozpuszczalnikach organicznych np. octan celulozy
rozpuszczający się w chlorku metylenu; dla immobilizacji komórek stosuje się tlenki
nieorganiczne (tlenek tytanu), silika\
ele;
polimeryzacja, polegajÄ…ca na zatrzymaniu biokatalizatora w trakcie tworzenia \
elu
poliakrylamidowego (monomer  akryloamid jest substancjÄ™ bardzo toksycznÄ… dla
komórek więc stosuje się czasem substancje osłonowe);
polikondensacja, zasada tej metody jest analogiczna do polimeryzacji z tą ró\
nicÄ…, \
e
wykorzystuje siÄ™ oligomery.
dr in\
. Aneta Białkowska
Podstawowe sposoby unieruchamiania
biokatalizatorów
II. Wiązanie wewnątrz nośnika:
wiązanie w matrycy nośnika (zamykanie wewnątrz
półprzepuszczalnych membran)
Materiał biologiczny jest zamykany w mikrokapsułkach (np. liposomy,
kapsułki nylonowe, polimocznikowe, pochodne celulozowe) lub
pomiędzy półprzepuszczalnymi membranami, przez które mogą
dyfundować substraty i metabolity.
Na membrany i do kapsułkowania u\
ywa się takich materiałów, jak
silikon, nylon, polioctan, celuloza i poliwęglany. Techniki zamykania
komórek są dość proste i tanie do przeprowadzenia, jednak mogą mieć
zastosowanie wyłącznie do przemian substratów małocząsteczkowych
dr in\
. Aneta Białkowska
Metody unieruchamiania enzymów
(inny podział)
Metody
immobilizacji
enzymów
Fizyczne Chemiczne
Pułapkowanie Zamknięcie Kowalencyjne
Adsorpcja na
wewnÄ…trz wewnÄ…trz wiÄ…zanie z
nierozpuszczalnej Sieciowanie
struktury określonej nierozpuszczalną
matrycy
polimeru przestrzeni matrycÄ…
dr in\
. Aneta Białkowska
Charakterystyka metod unieruchamiania
enzymów
Fizyczne metody immobilizacji
(pomiędzy enzymem a zło\
em tworzÄ… siÄ™ wiÄ…zania jonowe, wodorowe,
obecne są równie\
oddziaływania hydrofobowe i /lub siły van der
Waalsa)
Zachowanie struktury enzymu
A
atwość przeprowadzenia procesu immobilizacji
Niski koszt procesu immobilizacji
Wymywanie enzymu ze zło\
a (metoda adsorpcji)
Konieczność stosowania niskocząsteczkowych
substratów (zamykanie pomiędzy membranami
półprzepuszczalnymi)
dr in\
. Aneta Białkowska
Charakterystyka metod unieruchamiania
enzymów
Chemiczne metody immobilizacji (polegajÄ… na
tworzeniu wiązań kowalencyjnych łączących biokatalizator z
nierozpuszczalnÄ… matrycÄ…, sieciowaniu enzymu z zastosowaniem
wielofunkcyjnych odczynników lub wiązaniu biokatalizatora z innymi
cząsteczkami (np. innym białkiem lub rozpuszczalnym syntetycznym
polimerem), poprzez tworzenie wiązań sieciujących, co umo\
liwia
wydzielenie go z mieszaniny reakcyjnej przy u\
yciu techniki ultrafiltracji)
Stabilność układu enzym-matryca
Mo\
liwa zmiana struktury enzymu i częściowa utrata
aktywności
Skomplikowana procedura immobilizacji
Wysoki koszt procesu immobilizacji, wymagajÄ…cy
u\
ycia dodatkowych związków sieciujących lub
aktywujących grupy funkcyjne zło\
a lub/i enzymu
dr in\
. Aneta Białkowska
CECHY DOBREGO NOÅšNIKA
du\
a trwałość chemiczna i biologiczna, która pozwoli na długotrwałe wykorzystanie
immobilizowanego biokatalizatora;
wysoka odporność mechaniczna, niezbędna w środowiskach, w których obecny jest,
np. piasek, silnie niszczący materiał lub te\
zachodzi intensywne mieszanie
(oczyszczalnie ścieków);
du\
a powierzchnia czynna, pojemność i porowatość. Parametry te pozwalają na
efektywniejsze wykorzystanie preparatu ze względu na zwiększony kontakt między
biokatalizatorem a środowiskiem i łatwiejszą dyfuzję;
mo\
liwość otrzymania ró\
nych form dogodnych z technologicznego punktu widzenia;
bezproblemowe przeprowadzenie nośnika w formę zdolną do reakcji wiązania z
biokatalizatorem (aktywacja);
wysoka hydrofilowość, umo\
liwiająca zachodzenie reakcji sprzęgania enzymu z
nośnikiem w środowisku wodnym;
przy sprzęganiu kowalencyjnym nośnik powinien łączyć się tylko z tymi grupami
funkcyjnymi, które nie uczestniczą w procesie katalizy;
nośnik nie powinien ograniczać działania enzymu;
niska cena i dostępność;
łatwość w izolacji nośnika z immobilizowanym biokatalizatorem ze środowiska
reakcji po zakończeniu procesu;
mo\
liwość regeneracji nośnika i jego ponownego wykorzystania do immobilizacji.
dr in\
. Aneta Białkowska
NOŚNIKI ENZYMÓW
Rozpuszczalne Nierozpuszczalne
Rozpuszczalny dekstran
Glikol polioksyetylenowy
Organiczne Nieorganiczne
Alkohol poliwynylowy
Krzemionka
Tlenki metali
Ziemia okrzemkowa
Hydroksyapatyt
Szkło porowate
śel krzemionkowy
Syntetyczne Naturalne
Poliakrylamid Chityna
Poliuretan Chitozan
Polipropylen Skrobia modyfikowana
Polistyren Agar
Silikony Alginian
śywice jonowymienne Kolagen
śywice epoksydowe