2015-03-30
Wolne rodniki: reaktywne
formy tlenu i azotu
Stres oksydacyjny
Antyoksydanty. Polifenole
Natura wolnych rodników
Wolne rodniki sÄ… to czÄ…steczki lub atomy zdolne do samodzielnego
istnienia, posiadające jeden lub więcej niesparowanych elektronów
na powłoce walencyjnej
W większości są bardzo silnie reaktywne, a co za tym idzie -
reakcje są mało specyficzne
Najczęściej utożsamiane są z reaktywnymi formami tlenu (RFT)
Nie wszystkie RFT sÄ… wolnymi rodnikami i nie wszystkie wolne
rodniki należą do RFT
Natura wolnych rodników
" PowstajÄ… one w wyniku homologicznego
rozszczepienia wiÄ…zania lub w reakcjach
oksydacyjno-redukcyjnych (redox).
" Rozszczepienie wiązania następuje w wyniku
absorpcji promieniowania jonizujÄ…cego,
nadfioletowego, widzialnego lub cieplnego.
1
2015-03-30
Obecnie wiele procesów niekorzystnych dla organizmów
żywych tłumaczy się reakcjami wolnorodnikowymi.
Najważniejsze z nich to:
- starzenie siÄ™
- śmierć programowana (apoptoza)
- powstawanie komórek nowotworowych
- choroba Alzheimera
- artretyzm
- choroby serca
Również cytotoksyczność wielu leków ma swoje z
ródła
właśnie w generowaniu wolnych rodników lub reaktywnych
form tlenu.
Reaktywne formy tlenu indukujÄ… wiele
uszkodzeń struktur komórkowych
" Ogólnie reakcje wolnorodnikowe są reakcjami
łańcuchowymi.
" Wolne rodniki powstają w procesie łańcuchowym na
etapie inicjacji, uczestniczÄ… w nim w reakcjach
propagacji (rozprzestrzenianiu) i ulegajÄ… zanikowi w
procesie terminacji (zakończenia)
3
" Tlen molekularny (O2) oraz O2 tryplet, majÄ…cy dwa
niesparowane e na zewnętrznym orbitalu, są
najbardziej rozpowszechnionymi w przyrodzie
formami tlenu:
2
2015-03-30
Redukcja tlenu czÄ…steczkowego i
powstawanie RFT
1 O2 + e O2-" anionorodnik ponadtlenkowy
2 O2-" + H2O HO2" + OH-
wodoronadtlenek
3 HO2" + e + H+ H2O2 nadtlenek wodoru
4. H2O2 + e " OH + OH-
rodnik wodorotlenowy
Najważniejsze reaktywne formy tlenu (RFT)
anionorodnik ponadtlenkowy O2-"
nadtlenek wodoru H2O2
rodnik wodorotlenowy HO"
rodnik wodoronadtlenowy OH" 2
ozon O3
tlenek azotu NO"
nadtlenoazotyn O=N-OO-
podchloryn (anion kw. podchlorawego) ClO-
Toksyczne nierodnikowe metabolity
tlenu
" Ozon O3
" Nadtlenki:
Nadtlenek wodoru H2O2
Nadtlenki lipidów LOOH
" Kwas podchlorawy HOCl
" Chloraminy R R NCl
3
2015-03-30
MOŻLIWE y
RÓDA
A AKTYWNYCH
FORM TLENU
" ENDOGENNE
 Mitochondrialny transport elektronów (endooksydacja)
 Mikrosomalny łańcuch przenoszenia elektronów
(biotransformacja)
 Leukocyty i makrofagi (obrona immunologiczna)
" EGZOGENNE
 Promieniowanie UV i Rentgena
 Niektóre leki
 Dym tytoniowy i zanieczyszczenia powietrza
 Środki spożywcze
W warunkach fizjologicznych ok. 1-2% metabolicznego tlenu
ulega konwersji do form wolnorodnikowych.
Układ NADPH-zależnej oksydazy
" Efektywnym układem wytwarzającym anionorodnik
ponadtlenkowy O2" - jest układ NADPH-zależnej oksydazy
związanej z błoną granulocytów obojętnochłonnych.
" Wybuch tlenowy jest zachodzÄ…cym w pobudzonych
fagocytach procesem znacznego zwiększenia spożycia tlenu i
wytwarzania dużych ilości anionorodnika ponadtlenkowego
" W trakcie jego przebiegu dochodzi do powstania reaktywnych
oksydantów: O2-" , H2O2 , HO" a w przypadku neutrofilów
kwasu podchlorawego HOCl
4
2015-03-30
Układ NADPH-zależnej oksydazy
" Enzym ten aktywowany
obecnością bakterii katalizuje
redukcjÄ™ tlenu do anionorodnika
ponadtlenkowego O2" - i nadtlenku
wodoru (H2O2), a zjawisko to
określono mianem  wybuchu
oddechowego
" NADPH + 2O2
NADP+ + H+ + O2" -
" Redukcja anionu ponadtlenkowego
jest jednym z głównych
mechanizmów uczestniczących w
niszczeniu mikroorganizmów w
wyniku fagocytozy.
Struktura i funkcja mieloperoksydazy
Mieloperoksydaza jest głównym białkiem
wytwarzanym przez granulocyty obojętnochłonne, w
których odgrywa istotną rolę jako system obrony
gospodarza
" Katalizuje ona peroksydacjÄ™ jonu chlorkowego
z udziałem nadtlenku wodoru (H2O2 ), w wyniku
czego tworzy siÄ™ kwas podchlorawy, o silnym
działaniu bakteriostatycznym
" H2O2 + Cl- + H3O+ HOCl + 2H2O
Główne z
ródła rodnika hydroksylowego HO"
" Reakcja Fentona
Fe (II) + H2O2 Fe (III) + OH- + HO
" Reakcja Haber-Weissa w której nadtlenek wodoru
redukowany jest przez anionorodnik ponadtlenkowy w
obecności jonów Fe(III)
O2-" + H2O2 " OH + HO- + O2
" Reakcje te z udziałem metali (żelaza i miedzi) zachodzą
in vivo
5
2015-03-30
Tlenek azotu
" NO jest wolnym rodnikiem produkowanym w organizmie człowieka w:
komórkach śródbłonka naczyniowego
fagocytach, niektórych komórkach mózgu
" NO działa na komórki mięśni gładkich ścian naczyń powodując ich
relaksacjÄ™
" NO może reagować z O2·- i wytwarzać nadtlenoazotyn ONOO-, silny
utleniacz, niezbyt stabilny w fizjologicznym pH, jednak jego czas
półtrwania wynoszący około 1 sekundy sprawia, że może dyfundować do
komórek
Reaktywne Formy Azotu (RFN)
" Tlenek azotu (NO" ) odgrywa istotnÄ… rolÄ™ jako
cząsteczka przekazująca informację jak również
może mieć działanie toksyczne
" NO" może reagować z białkami i kwasami
nukleinowymi
" NO" może reagować z centrami nukleofilowymi
zawierajÄ…cymi siarkÄ™, azot, tlen
Produkty reakcji NO" z formami tlenu
" NO" + O2 ONOO" , NO2" , N2O3
" NO" + O2-2 ONOO- (nadtlenoazotyn)
" NO" + H2O2 O2
" Nadtlenoazotyn tworzy siÄ™ w stresie oksydacyjnym,
powstaje w stanach zapalnych i jest odpowiedzialny za
uszkodzenia różnych związków
6
2015-03-30
Rektywne formy tlenu uczestniczÄ… w
utlenianiu białek, lipidów i kwasów
nukleinowych.
Wszystkie reszty aminokwasowe obecne w białkach są
podatne na utlenianie, jednak największą wrażliwość na
działanie reaktywnych form tlenu (RFT) wykazują: cysteina,
metionina, tyrozyna i tryptofan.
Reszty cysteinowe sÄ… utleniane do reszt disiarczkowych, a
metioninowe do sulfotlenku metioniny.
Te modyfikacje aminokwasów w białkach in vivo są jedynymi,
które mogą zostać naprawione przez swoiste reduktazy .
Utlenienie reszt tyrozynowych prowadzi do powstania
3,4-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA) lub do utworzenia wiązań
krzyżowych między dwiema cząsteczkami tego aminokwasu z
utworzeniem 2,5-dityrozyny.
W wyniku utlenienia tryptofanu powstaje formylokinurenina i
kinurenina, natomiast reszty histydyny zostajÄ… utlenione do
2-oksohistydyny, kwasu asparaginowego i asparaginy
Niebezpieczeństwa reakcji wolnorodnikowych
" Wolne rodniki w większości posiadają silne właściwości utleniające
(inaczej określane jako prooksydacyjne).
" Peroksydacja lipidów jest najbardziej znanym łańcuchowym
procesem wolnorodnikowym zachodzącym w żywych organizmach
" W wyniku ataku reaktywnych form tlenu następuje utlenianie
nienasyconych kwasów tłuszczowych (czyli posiadających co
najmniej jedno wiązanie podwójne)
7
2015-03-30
Peroksydacja lipidów
Wolne rodniki tlenowe są zdolne do utleniania lipidów.
" Rodnik wodorotlenowy (HO"
" ) jest
"
"
zdolny do atakowania
nienasyconych kwasów tłuszczowych
obecnych w fosfolipidach i innych
lipidach błony inicjując w ten sposób
peroksydację lipidów.
" Kiedy lipidy zostanÄ… aktywowane do
wolnych rodników R" poprzez
"
"
"
usunięcie wodoru przez inicjator
wolnorodnikowy (X"
" ), wchodzÄ…
"
"
bardzo szybko w reakcjÄ™ z wolnym
tlenem.
" Tworzy się wówczas rodnik
nadtlenkowy (peroksy) ROO" , a
"
"
"
proces ten nazwano peroksydacjÄ….
Produktami peroksydacji lipidów są:
" malonylodialdehyd (MDA)
" 4-hydroxy-trans-nonenal
" hepta-2,4-dienal
" hydroxyoctanal
" etan
" pentan
Stres oksydacyjny
" Stres oksydacyjny jest stanem charakteryzujÄ…cym siÄ™ nadmiernÄ…
aktywnością RFT w wyniku zachwiania równowagi między
wzmożonym wytwarzaniem RFT, a ich usuwaniem przez
ustrojowe systemy antyoksydacyjne
8
2015-03-30
" W celu utrzymania równowagi redox, organizm
chroni się przed nadmiarem RFT/RFN w różny
sposób, wykorzystując endogenne i egzogenne
antyoksydanty.
Ochrona przed reakcjami wolnorodnikowymi
Linie obrony
1. Pierwsza linia obrony - prewencja
2. Druga linia obrony - interwencja i terminacja
(przerwanie)
3. Naprawa uszkodzeń
1. Pierwsza linia obrony - prewencja
Wykorzystywane sÄ… mechanizmy zapobiegajÄ…ce powstawaniu
RFT czy wolnych rodników.
Ich zadaniem jest przechwytywanie substancji takich jak
ksenobiotyki i jony metali przejściowych, co uniemożliwi im
wchodzenie w reakcje prowadzÄ…ce do produkcji RFT
9
2015-03-30
2. Druga linia obrony - interwencja i terminacja
(przerwanie)
System obrony stanowiÄ… zwiÄ…zki unieszkodliwiajÄ…ce RFT,
powszechnie określane jako przeciwutleniacze lub
antyoksydanty, które można podzielić na dwie grupy - czynniki
nieenzymatyczne i enzymatyczne
U zdrowego człowieka istnieją 3 klasy
antyoksydantów uczestniczących w usuwaniu
RFT:
" Antyoksydanty pierwszej linii obrony: do której
zaliczany jest układ enzymatyczny złożony z
enzymów: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalaza
(CAT), peroksydaza glutationowa (GSH-Px),
ceruloplazmina
Antyoksydanty drugiej linii obrony
" Antyoksydanty drugiej linii obrony majÄ… charakter
nieenzymatyczny i usuwajÄ… one wolne rodniki zanim
te rozpoczną łańcuch reakcji wolnorodnikowych.
" Należą tu obecne w komórce substancje redukujące
takie jak: kwas askorbinowy, glutation (GSH), alfa-
tokoferol, beta karoten, kwas moczowy i inne np.
albumina, bilirubina
10
2015-03-30
Antyoksydanty trzeciej linii obrony
" Uczestniczą w naprawie struktur komórkowych
uszkodzonych przez atak wolnych rodników.
" Należą tu np. enzymy uczestniczące w naprawie
DNA lub np. reduktaza sulfotlenku metioniny
redukująca utlenione grupy metylowe w białkach
Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD)
występuje w trzech formach:
" Cynkowo-miedziowa SOD (CuZnSOD) występująca w
cytoplazmie i płynach pozakomórkowych
" Manganowa SOD (MnSOD) zlokalizowana w mitochondriach,
jest syntetyzowana w odpowiedzi na czynnik indukcyjny,
którym jest anionorodnik ponadtlenkowy
" Żelazowa SOD (FeSOD) jest enzymem konstytutywnym,
wytwarzanym nawet w warunkach beztlenowych
Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD)
" Katalizuje reakcjÄ™ dysmutacji anionorodnika
ponadtlenkowego do nadtlenku wodoru i tlenu
czÄ…steczkowego
" Zapobiega również tworzeniu rodnika
wodorotlenowego w reakcji katalizowanej przez
jony metali przejściowych
" Reakcja dysmutacji anionu ponadtlenkowego
O2-" + O2-" + 2H+ çÅ‚çÅ‚ H2O2 + O2
11
2015-03-30
Katalaza (CAT)
" Działa gdy stężenie H2O2 w komórce jest wysokie.
" Jest hemoproteinÄ… zawierajÄ…cÄ… 4 grupy hemowe,
zlokalizowanÄ… w peroksysomach
" Rozkłada nadtlenek wodoru, gdzie jedna cząsteczka
H2O2 jest donorem a druga akceptorem elektronu
" H2O2 + H2O2 çÅ‚çÅ‚ 2H2O + O2
Peroksydaza glutationowa (GSH-Px)
" Główny czynnik detoksykacyjny ponieważ może
rozkładać nie tylko nadtlenek wodoru (H2O2) ale
również nadtlenki lipidów (ROOH) wykorzystując
glutation jako dawcę elektronów
" Wyizolowano trzy typy GSH-Px i wszystkie okazały
się enzymami selenozależnymi (Se)
Peroksydaza glutationowa (GSH-Px)
" Enzym katalizuje reakcje:
" H2O2 + 2 GSH GSSG + H2O
" 2GSH + R-OOH GSSG + H2O + ROH
" LipidOOH + 2 GSH GSSG + LipidOH
12
2015-03-30
Reduktaza glutationowa (GR)
" Białko cytoplazmatyczne
" Enzym redukuje utleniony glutation (GSSG)
wykorzystujÄ…c NADPH
" GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+



Rys. 2.6
Aktywność podstawowych enzymów antyoksydacyjnych (Według
Bartosz, 2004).
Ceruloplazmina Cp
" Jest białkiem osocza i zaliczana do antyoksydantów
pierwszej linii.
" Dzięki obecności jonów Cu(I) i Cu(II) w cząsteczce, może
utleniać jony Fe(II) do mniej reaktywnych Fe(III).
" Jej działanie antyoksydacyjne polega na katalizowaniu
wbudowywania Fe(III) do apotransferyny i apoferrytyny.
" Związanie Fe(III) z białkiem zmniejsza możliwość
tworzenia rodnika wodorotlenowego w reakcji Fentona.
" Jest także zdolna do reakcji z anionorodnikiem
ponadtlenowym.
" 4Fe(II) + O2 + 4H+ 4Fe(III) + 2H2O
13
2015-03-30
Obrona nieenzymatyczna
ZREDUKOWANY GLUTATION (GSH)
" Zredukowany glutation (GSH) odgrywa główną rolę w
systemie enzymów uczestniczących bezpośrednio i
pośrednio w działaniu antyoksydacyjnym
" GSH jako kosubstrat peroksydazy glutationowej (GSH-Px)
bierze udział w reakcjach redukcji nadtlenku wodoru i
nadtlenków lipidów
" PowstajÄ…cy w tych reakcjach disulfid glutationu (G-SS-G)
jest redukowany przez NADPH w reakcji katalizowanej
przez reduktazÄ™ glutationowÄ… (GSSG-R)
" PodstawowÄ… rolÄ… glutationu w organizmie jest
utrzymywanie grup sulfhydrylowych w stanie
zredukowanym
Glutation utrzymuje białka zawierające grupy  SH w postaci
zredukowanej
P-SH + P -SH + O2 P-S-S-P + H2O
P-S-S-P
G-SH
P-SH + G-S-S-P
G-SH
G-S-S-G + HS-P
Tioredoksyna
" Układ tioredoksyny obejmuje tioredoksynę i reduktazę
tioredoksyny .
" Tioredoksyna jest białkiem o masie 12-kDa obecnym we
wszystkich organizmach.
" W miejscu aktywnym tioredoksyny znajdujÄ… siÄ™ 2 sÄ…siadujÄ…ce
reszty cysteiny, które mogą występować w 2 formach:
zredukowanej (-SH, ditiolowej) i utlenionej (S-S).
" W swojej aktywnej formie tioredoksyna jest czynnikiem
redukującym, który usuwa RFT i utrzymuje inne białka w ich
stanie zredukowanym.
" Utleniona tioredoksyna jest regenerowana przez działanie
reduktazy tioredoksyny, która z kolei ulega redukcji przez
NADPH.
14
2015-03-30
ALBUMINA
" Albumina reagując z RFT pełni funkcję tzw.
 samobójczych zmiataczy chroniąc makrocząsteczki o
ważniejszych funkcjach biologicznych.
" Taka miejscowo uszkodzona czÄ…steczka albuminy ulega
szybko proteolitycznej degradacji i jest natychmiast
zastÄ…piona przez nowo zsyntetyzowanÄ… czÄ…steczkÄ™.
" Albuminy w osoczu chronią błonę erytrocyta przed
szkodliwymi uszkodzeniami wywołanymi przez RFT.
" Działanie antyoksydacyjne albumin warunkują grupy SH-
" Albuminy wiążą jony miedzi w krążeniu i hamują
tworzenie rodnika wodorotlenowego z nadtlenku wodoru.
Rola melatoniny jako antyoksydanta
" Melatonina z uwagi na łatwość przenikania przez błonę
komórkową oraz barierę krew-mózg należy do silnych
antyoksydantów.
" W przeciwieństwie do innych antyoksydantów organizmu
nie podlega ona cyklowi redox.
" Raz utleniona melatonina nie może ulec ponownej redukcji
do swojego poprzedniego stanu, gdyż w wyniku reakcji z
wolnymi rodnikami tworzy ona szereg stabilnych
produktów.
" Dlatego też zaliczana jest do tzw. antyoksydantów
 samobójczych .
TOKOFEROLE
" ą-tokoferol zlokalizowany jest wewnątrz błony
biologicznej, w lipoproteinach i korze nadnerczy
" Ä…-tokoferol reaguje z tlenem i wychwytuje rodnik HO"
" Główne jego działanie w błonie biologicznej sprowadza
się do przerwania reakcji łańcuchowej poprzez
przekazanie wodoru rodnikom peroksy i alkoksy
" Regeneracja ą-tokoferolu wymaga udziału witaminy C i
glutationu (GSH)
15
2015-03-30
Współdziałanie tokoferolu i kwasu askorbinowego
Rola witaminy C (kwasu
askorbinowego) jako antyoksydanta
W wyniku oddania elektronu askorbinian (AH ) przechodzi w postać
rodnikową A"  (rodnik askorbylowy), ktory może być w dalszym ciągu
utleniany do dehydroaskorbinianu (DHA).
Rola Koenzymu Q jako antyoksydanta
Neutralizuje wolne rodniki
ważny antyoksydant obecny w lipidach
występuje naprzemiennie w formie zredukowanej i
utlenionej
Uczestniczy w regeneracji tokoferolu.
Współdziała z kwasem dihydroliponowym.
Dihydroliponowy kwas redukuje ubichinon do ubichinolu
Hamuje peroksydację lipidów
16
2015-03-30
Udział witamin w usuwaniu wolnych
rodników
Kwas moczowy
" Kwas moczowy u człowieka jest " Kwas moczowy
końcowym produktem utleniania
w metabolizmie puryn
" U człowieka połowa zdolności
antyoksydacyjnej w osoczu
pochodzi z kwasu moczowego
" Jest to główny antyoksydant
śliny.
" Kwas moczowy wiąże żelazo
i miedz
i neutralizuje
rodnik HO" i rodniki
nadtlenkowe
POLIFENOLE
" Stanowią dużą grupę związków występujących w
świecie roślinnym
" Flawonoidy można dalej podzielić na 6 głównych
podklas w oparciu o różnice w obrębie
heterocyklicznego pierścienia są to: flawony,
flawonole, flawanony, katechiny, antocyjanidyny i
izoflawony
17
2015-03-30
Flawonoidy:
" Do najważniejszych bioflawonoidów należą:
" rutyna (np. w gryce i tytoniu),
" hesperydyna (np. w skórce owoców cytrusowych),
" katechina (np. w winie),
" kwercetyna (np. w Å‚usce cebuli i tytoniu).
" Ich z
ródłem są owoce, warzywa, herbata, kawa i wino,
zwłaszcza czerwone (dzienne spożycie waha się od kilku mg
do 1 g, co uzależnione jest od ilości spożywanych warzyw i
owoców).
Przykłady struktur polifenoli
DZIAA
ANIE ANTYOKSYDACYJNE
POLIFENOLI
" Flawonoidy razem z witaminÄ… C i E hamujÄ…
peroksydację lipidów obecnych w fosfolipidach błon
komórkowych
" Mają zdolność wychwytywania wolnych rodników
" Mają zdolność chelatowania jonów metali grup
przejściowych uczestniczących w powstawaniu
wolnych rodników
" Wykazują właściwości ochronne wobec endogennych
antyoksydantów
18
2015-03-30
Polifenole wykazują zdolności przeciwutleniające związane z ich
budową chemiczną, m.in. z obecnością grup hydroksylowych, które
biorą udział w redukcji wolnych rodników.
Podczas tej reakcji polifenol oddaje jeden elektron
przekształcając się w rodnik aroksylowy, który jest jednak
stabilizowany dzięki obecności pierścienia aromatycznego.
Polifenole
" Polifenole mogÄ… poprzez orto-dihydrofenolowÄ… strukturÄ™
chelatować jony miedzi lub działać jako donor wodoru
usuwajÄ…c wolne rodniki
" ROO" + AH ROOH + A"
" RO" + AH ROH + A"
" Lub regenerować ą  tokoferol poprzez redukcję rodnika ą-
tokoferolu (utlenionej formy witaminy E)
Pewne dane wskazują, iż polifenole działają nie tylko jako anty-
ale też w odpowiednio wysokim stężeniu i pewnych warunkach,
jako prooksydanty.
ZwiÄ…zki te sÄ… traktowane przez organizm jako ksenobiotyki,
ulegają przemianom metabolicznym, częściowo modyfikującym
ich właściwości, a ich stężenie w organizmie często jest zbyt
małe, aby można było uznać bezpośrednie działanie
antyoksydacyjne za jedyny ochronny wpływ na komórki
organizmu.
Prawdopodobnie istotne znaczenie majÄ… interakcje polifenoli z
komórkowymi szlakami sygnałowymi oraz wpływ na ekspresję
genów, m.in. tych odpowiedzialnych za syntezę enzymów
antyoksydacyjnych
19
2015-03-30
Antocyjany są naturalnymi barwnikami roślinnymi należącymi do
grupy flawonoidów.
W stanie naturalnym występują w postaci glikozydów.
Ich z
ródłem w diecie człowieka są przede wszystkim warzywa i
owoce kolorowe.
W przemyśle spożywczym są stosowane jako naturalne barwniki
żywności.
Liczne badania wskazują, że antocyjany mogą wywierać korzystny
wpływ na zdrowie człowieka, a wynika to przede wszystkim z ich
właściwości przeciwutleniających.
Badania pokazują, że antocyjany wykazują również działanie
przeciwmiażdżycowe, przeciwzapalne, przeciwalergiczne, a nawet
przeciwnowotworowe.
Spożywanie surowców bogatych w tę grupę związków może
korzystnie oddziaływać na wzrok i układ sercowo-naczyniowy
20