AMINOKWASY
PEPTYDY
BIAA
KA
Tworzenie wiÄ…zania peptydowego w roztworze oraz
synteza na fazie stałej
på
Agnieszka Kwapisiewicz
Tworzenie wiÄ…zania peptydowego
METODY TWORZENIA WI
ZANIA PEPTYDOWEGO:
ü
Metoda karbodiimidowa (DCC)
ż
Metoda azydkowa
ü
Metoda bezwodnikowa
ü
Metoda aktywnego estru
ż
Metoda aktywnego amidu
ż
Metoda izocyjanianowa
ż
Metoda fosfoazowa
ż
Metoda ynaminowa
ż
Metoda chlorku kwasowego
ż
Wbudowanie grupy aminoacylowej
ż
Synteza peptydów poprzez N- karboksybezwodniki (NCA)
ż
Sprzęganie w reakcji redoks
ü
Synteza na fazie stałej
 WI
ZANIE
på
Już w 1902 r. Emil Fisher zauważył, że białka zawierają stosunkowo mało wolnych grup
PEPTYDOWE
aminowych i karboksylowych. Na tej podstawie zasugerował, że łączenie się aminokwasów
to reakcja kondensacji z udziałem grupy karboksylowej jednego z nich oraz grupy aminowej
kolejnego; w rezultacie powstaje wiÄ…zanie amidowe. Nazwane jest ono wiÄ…zaniem
peptydowym.
WI
ZANIE PEPTYDOWE
SYNTEZA PEPTYDÓW
METODA KARBODIIMIDOWA DCC
O-acyloizomocznik
Dicykloheksylokarbodiimid (DCC)
N -
hydroksysukcynoimid
dicykloheksylomoczn
ik
1-hydroksybenzotriazol
(HOBT)
METODA MIESZANYCH BEZWODNIKÓW
THF
-5 do -15 C
chloromrówczan izobutylu
BEZWODNIK
dicykloheksylomoczn
ik
Dicykloheksylokarbodiimi
d (DCC)
O-acyloizomocznik
Bogate w energiÄ™ estry
tlenowe  estry
aktywowane
METODA NA NOÅšNIKU STAA
YM
Całkowicie nowe podejście syntezy peptydów
opracował Merrifield w 1960r. Chodzi o syntezę
na nośniku stałym (SPPS- ang. solid-phase peptide
synthesis).Za to osiągnięcie Merrifieldowi
przyznano w 1984 r. NagrodÄ™ Nobla z chemii.
W metodzie tej blokuje się grupę ą-aminową aminokwasu, który ma
znalez
ć się na końcu C docelowego peptydu, a grupę ą-
karboksylowÄ… tego aminokwasu Å‚Ä…czy siÄ™ z nierozpuszczalnym
nośnikiem polimerowym; zwykle w tej roli stosowany jest
polistyren, czyli poli (fenyloeten)
POLISTYREN
Najczęściej stosowanym nośnikiem stałym jest kopolimer styrenu i
diwinylobenzenu. Diwinylobenzen zapewnia usieciowanie polimeru,
czyli mostki między łańcuchami. Stopień usieciowania można
kontrolować poprzez zmianę ilości diwinylobenzenu biorącego udział
w procesie polimeryzacji. Do syntezy peptydów stosuje się
polimer luz
no usieciowany (1-2%), tak aby rozpuszczalniki i substraty
mogły swobodnie wnikać do wnętrza perełek wykonanych z takiego
materiału. Rozpuszczalnik stanowi około 90% objętości spęczniałych
perełek, a zatem synteza zachodzi praktycznie w
roztworze, mimo, że łańcuch peptydowy jest przez cały czas połączony z
nośnikiem.
METODA NA NOÅšNIKU STAA
YM SPPS
DCC
O-acyloizomocznik
Jednym z najszerzej
stosowanych linkerów jest
alkohol 4-
alkoksybenzylowy,
połączona z nim żywica
tzw. ŻywicaWanga
ZALETY SYNTEZY PEPTYDÓW NA
NOÅšNIKU STAA
YM
Ø
A
atwość pozbycia się wszystkich produktów ubocznych kolejnych reakcji  przez
proste przemywanie żywicy polistyrenowej na sączku
Ø
Rosnący łańcuch jest przez cały czas przyczepiony do stałego nośnika i nie trzeba
go wyodrębniać
Ø
W metodzie tej nie pojawia się problem słabej rozpuszczalności peptydów, często
utrudniający syntezę w roztworze; peptyd jest przecież przyczepiony do nośnika
Ø
SPPS jest procesem stosunkowo prostym. Procedura została w pełni
zautomatyzowana i obecnie można po prostu kupić urządzenie, które wykonuje całą tę
pracÄ™.
Zdjęcie przedstawia zestaw do prowadzenia syntezy peptydów na nośniku stałym
WADY SYNTEZY PEPTYDÓW NA NOŚNIKU
STAA
YM SPPS
Rosnący łańcuch peptydowy przez cały czas pozostaje połączony
ze stałym nośnikiem. Oznacza to, że jeśli z jakiegoś powodu
reakcja sprzęgania nie zachodzi do końca na pewnym etapie, to
w produkcie końcowym obecna jest pewna populacja
czÄ…steczek z brakujÄ…cÄ… resztÄ… aminokwasowÄ….
Pozbycie się takich produktów delecji może nastręczać wielu
trudności. Dlatego też powszechną praktyką jest sprawdzanie na
każdym etapie kompletności reakcji sprzęgania, tak aby w razie
potrzeby można ją było powtórzyć. W tym celu niewielką ilość
żywicy poddaje się testowi na obecność pozostałych wolnych grup
aminowych (reakcji ninhydrynowej).Jeśli także i powtórne
sprzęganie nie przebiega do końca, ułomny peptyd można na
trwałe zablokować, by zapobiec jego dalszemu wydłużaniu.
ZABEZPIECZANIE A
AC
CUCHÓW
BOCZNYCH
Tab. Dwie główne strategie ochrony łańcuchów bocznych w metodzie SPPS
Blokowanie Odblokowanie Blokowanie Odblokowanie
N ą Ną łańcucha łańcucha
bocznego bocznego
T  BOC TFA pochodne Bz HF
F moc piperydyna pochodne t-BU TFA
Zasadniczą sprawą jest to, aby ochrona łańcucha bocznego przetrwała reakcje odblokowania
N- terminalnego aminokwasu
Skróty:
T-BOC  grupa t-butoksykarbonylowa
Treonina
F moc- grupa fluorenylometoksykarboksylowa
TFA- kwas trifluorooctowy
Bz  ugrupowanie benzylowe; np.eter benzylowy w przypadku Thr
T-Bu - t-butanol np. sulfid dibutylowy w przypadku Cys
HF- ciekły fluorowodór
Cysteina
Odszczepienie, oczyszczenie i charakteryzowanie
produktu-peptydu
Odszczepianie peptydów od żywicy prowadzone jest zwykle z jednoczesnym usunięciem
osłon z grup funkcyjnych łańcuchów bocznych aminokwasów, np. z zastosowaniem
mieszaniny TFA/Fenol/H2O/TIPS (88:5:5:2). Reakcja, z zastosowaniem powyższej
mieszaniny, prowadzona jest przez 120 min w temperaturze pokojowej w atmosferze gazu
obojętnego (argonu). Po tym czasie żywica jest odsączana i przemywana dwukrotnie
niewielkimi ilościami TFA, a następnie z przesączu wytrącany jest peptyd za pomocą
zimnego Et2O. WytrÄ…cony peptydy jest odsÄ…czany i po rozpuszczeniu w wodzie lub 20%
AcOH liofilizowany. Najczęściej używanym sposobem oczyszczania peptydu jest
preparatywna chromatografia HPLC w odwróconym układzie faz.
LITERATURA :
ż
Shawn Doonan, Białka i peptydy, wyd. naukowe PWN , Warszawa 2008
ż
H. D. Jakubke, H. Jeschkeit, Aminokwasy ,peptydy ,białka, wyd. naukowe
PWN, Warszawa 1982
ż
J. McMurry, Chemia Organiczna, cz.4, wyd. naukowe PWN, Warszawa 2005
ż
http://ewelina.adamska.w.interia.pl/3.pdf
ż
http://www.ppc.univ.gda.pl/instrukcje/chembiol_cw1.pdf
ż
http://en.wikipedia.org/wiki/Peptide_synthesis
Dziękuję za uwagę