L A B O R A T O R I U M 7 - 8 / 2 0 0 9 SPRZ
T I APARATURA LABORATORYJ NA
|
Techniki chromatograficzne
stosowane
w oczyszczaniu białek
Część I  izolacja i wstępne frakcjonowanie białek
STRESZCZENIE Izolacja hromatografia to metoda roz- ny mieszaniny rozdzielanych substancji
i oczyszczanie są niezbędnymi etapami działu związków znajdujących się zawieszonych w buforze stanowiącym fazę
na drodze do poznania struktury, Cw roztworze ciekłym lub gazowym. ruchomą rozdzielane składniki oddziału-
sposobu działania czy funkcji biologicznej Mieszaninę rozdzielanych substancji ją z fazą stacjonarną w różnym stopniu,
badanego białka. Rozwój technik wprowadza się do układu składającego jedne mocniej, inne słabiej. Zatrzymane
chromatograficznych wykorzystywanych się z dwóch faz, z których jedna, zwana w wyniku oddziaływania ze złożem białka
w separacji biocząsteczek przyczynił ruchomą, przemieszcza się względem nie- są wymywane z kolumny buforem elucyj-
się do postępu w biochemii ruchomej  fazy stacjonarnej. Ze względu nym stopniowo, w zależności od mocy
i biotechnologii. W celu uzyskania na stan skupienia fazy ruchomej chro- oddziaływania z fazą stacjonarną. Elucja
pożądanego poziomu czystości produktu matografię można podzielić na cieczową rozdzielanych na złożu składników może
końcowego, większość procedur oraz gazową. W przypadku chromatografii mieć charakter izokratyczny albo gradien-
oczyszczania składa się kilku etapów. cieczowej, biorąc pod uwagę charakter towy. W przypadku elucji izokratycznej
SA
OWA KLUCZOWE oczyszczanie zjawisk decydujących o rozdziale, ale skład eluentu jest stały w czasie rozdzia-
białek, izolacja białek, wytrącanie białek także stan skupienia fazy stacjonarnej, łu, natomiast w elucji gradientowej skład
wyróżnia się chromatografię podziało- fazy ruchomej jest zmienny  powstaje
SUMMARY Protein isolation and wą oraz chromatografię adsorpcyjną. on poprzez mieszanie dwóch lub więcej
purifi cation are essential steps to the W pierwszym omawianym przypadku solwentów w różnym stosunku, który pod-
characteristics of the structure, mode zarówno faza ruchoma, jak i stacjonarna lega zmianom w trakcie trwania rozdzia-
of action and biological function of the sÄ… cieczami. O rozdziale danej substancji Å‚u chromatograficznego. Typowy zestaw
protein of interest. The development pomiędzy dwie niemieszające się ze sobą do oczyszczania białek oprócz kolumny
of chromatographic techniques fazy ciekłe decyduje zjawisko podziału. zawiera zwykle pompę, detektor, kolektor
used in biomolecule separation has Przykładem tego rodzaju chromatografii frakcji oraz rejestrator (rys. 1).
contributed to the advances made może być chromatografia podziałowa Ze względu na ciśnienie, pod jakim
in biochemistry and biotechnology. Most w normalnym lub odwróconym układzie tłoczona jest przez kolumnę faza rucho-
purifi cation procedures require more faz. W przypadku drugiego wspomniane- ma, wyróżnia się chromatografię niskoci-
than one step to achieve the desired go typu chromatografii fazą stacjonarną śnieniową (LPLC, ang. low pressure liquid
level of the fi nal product purity. jest powierzchnia ciała stałego, a rozdział chromatography). Jest to konwencjonalna
KEY WORDS protein purifi cation, opiera się na zjawisku adsorpcji. Przykła- metoda, w której stosowane ciśnienie mie-
protein isolation, protein precipitation dem tego rodzaju chromatografii może ści się w zakresie od 0 do ok. 0,5 MPa.
być np. chromatografia oddziaływań Wersją pośrednią jest średniociśnieniowa
hydrofobowych. chromatografia cieczowa (FPLC, ang.
BiorÄ…c pod uwagÄ™ technikÄ™ pracy, fast protein liquid chromatography), w przy-
można wyróżnić chromatografię kolum- padku której ciśnienie zwykle mieści się
nową, cienkowarstwową lub bibułową. w przedziale od 0,5 MPa do 2 MPa. Naj-
W oczyszczaniu białek największe zna- bardziej zaawansowaną i skomplikowaną
czenie ma kolumnowa chromatografia technicznie wersjÄ… jest wysoko sprawna
cieczowa. Kolumna to rurka szklana, chromatografia cieczowa (HPLC, ang.
plastikowa bÄ…dz
metalowa, wypełniona high performance liquid chromatography),
dr Urszula BÅ‚aszczyk
odpowiednim złożem, które stanowi fazę w której stosowane ciśnienie wynosi po-
KATEDRA TECHNOLOGII FERMENTACJI I MIKROBIOLOGII TECHNICZNEJ
UNIWERSYTET ROLNICZY W KRAKOWIE
stacjonarnÄ…. Po wprowadzeniu do kolum- nad 2 MPa (2-35 MPa).
42
SPRZ
T I APARATURA LABORATORYJ NA L A B O R A T O R I U M 7 - 8 / 2 0 0 9
|
Typowy rozdział chromatograficzny organizmów wyższych. Uzyskane w ten
miejsce iniekcji próbki
obejmuje następujące etapy: sposób proteiny określa się białkami re-
" zrównoważenie kolumny odpowiednim kombinantowymi. Procedura oczyszcza-
buforem o określonych pH oraz sile nia takich białek jest stosunkowo prosta
pompa
jonowej, i pozwala na otrzymanie znacznych ilo-
" wprowadzenie do kolumny rozdziela- ści pożądanego produktu. W przypadku
zbiornik z eluentem
nej mieszaniny związków, białek rekombinantowych do ich sekwen-
" oddziaływanie (np. adsorpcja) rozdzie- cji można dołączyć sekwencje kodujące
lanych cząsteczek białka z odpowied- krótkie peptydy bądz
domeny innych bia-
nim złożem chromatograficznym, łek, które pozwalają na ich oczyszczanie
kolumna
" wymywanie niezwiązanych ze złożem w sposób szybki, w jednym etapie, zwykle
składników (w przypadku chromato- z wykorzystaniem chromatografii powino-
grafii adsorpcyjnej), wactwa. Dołączona do izolowanego białka
" elucja (izokratyczna lub gradientowa) sekwencja peptydowa nie może jednak
związanych ze złożem chromatogra- zmieniać znacząco jego aktywności czy
ficznym cząsteczek z użyciem odpo- struktury. Najczęściej do białek rekombi-
rejestrator detektor kolektor frakcji
wiedniego buforu (zwykle o składzie nantowych dołączone są peptyd złożony
innym niż bufor wykorzystany do rów- z sześciu reszt histydyny lub transferaza
noważenia kolumny), S-glutationowa (GST). W pierwszym wa-
Rys. 1. Uproszczony schemat zestawu do chromatografii
" wymycie wszystkich substancji z ko- niskociśnieniowej (pompa może być umieszczona przed
riancie białko oczyszczane jest na zasadzie
lub za kolumnÄ…)
lumny, regeneracja złoża i ponowne powinowactwa na złożu z unieruchomio-
zrównoważenie kolumny. nymi jonami niklu, w drugim  na złożu
roślinnych. Coraz częściej, aby otrzymać z unieruchomionym glutationem.
WYBÓR y
RÓDA
A pożądane białko, doprowadza się do jego
POÅ»
DANEGO BIAA
KA nadprodukcji w komórkach bakteryjnych IZOLACJA I WST
PNE
Białka można izolować z różnego rodzaju (głównie Escherichia coli), drożdżowych FRAKCJONOWANIE BIAA
EK
materiału biologicznego, np. z komórek (głównie Saccharomyces cerevisiae), jak rów- Przystępując do oczyszczania białka, na-
mikroorganizmów, tkanek zwierzęcych czy nież w hodowlach linii komórkowych leży pamiętać o kilku istotnych sprawach.
reklama
Znakomite osiÄ…gi
10 pików w ciągu 10 sekund, stosując RSLC firmy Dionex
System UltiMate 3000 RSLC
 optymalny dla HPLC i UHPLC:
" przepływ do 5 ml/min przy ciśnieniu do 800 bar
" całkowity cykl nastrzyku próbki poniżej 15 s
" temperatura pieca: 5 110°C
" szybkość zbierania danych do 100 Hz
w całym zakresie długości fal
Dodatkowe informacje na temat Ultimate 3000 Rapid
Separation LC na stronie www.dionex.com/RSLC
tel. [phone] e-mail: [e-mail]
fax [phone] www.polygen.com.pl
Passion. Power. Productivity.
43
L A B O R A T O R I U M 7 - 8 / 2 0 0 9 SPRZ
T I APARATURA LABORATORYJ NA
|
Przystępując do izolacji i oczyszczania wybranego białka, należy zastanowić się, jakie są cel i skala tych procesów
W trakcie preparatyki istotne jest zacho- tiotreitol czy ðbð-merkaptoetanol. Pewne usuniÄ™ciem z roztworu, dlatego zamiast
wanie właściwości izolowanej makroczą- białka do zachowania swoich właściwości nich czasem stosowane są czynniki cha-
steczki. By nie doprowadzać do utraty biologicznych potrzebują jonów metali, otropowe, które przy ograniczeniu od-
aktywności biologicznej białka, zwykle np. Ca2+ czy Mg2+; czasem jednak ich działywań hydrofobowych równocześnie
pracuje się w obniżonej temperaturze, obecność prowadzi do niekorzystnych pozwalają makrocząsteczkom pozostać
co wiąże się z ograniczeniem rozwoju procesów, i wtedy do roztworu dodaje w środowisku wodnym. Do związków cha-
mikroorganizmów i ze spowolnieniem się związki kompleksujące (np. EDTA). otropowych należą m.in. chlorowodorek
procesów degradacji izolowanych ma- W trakcie pracy z białkami należy rów- guanidyny, a także mocznik. Substancje
krocząsteczek w wyniku działania enzy- nież unikać denaturacji powierzchniowej te są szczególnie przydatne w trakcie
mów litycznych (np. proteaz). Procesy (pienienia roztworu). oczyszczania białek rekombinantowych,
izolacji i oczyszczania należy prowadzić W pierwszym etapie izolacji interesują- gdyż pozwalają utrzymać w środowisku
w odpowiednim zakresie pH (zwykle ce badacza białko musi zostać uwolnione wodnym ciałka inkluzyjne.
5-9), w którym wybrane białko wykazuje do roztworu, o ile nie jest wyodrębnia- W kolejnym etapie pozyskiwania pożą-
wysoką aktywność, ale z drugiej strony ne z płynnego materiału biologicznego, danego białka zwykle stosuje się wstępne
również odpowiednią stabilność. Ważne np. krwi. W tym celu doprowadza się oczyszczanie za pomocą frakcjonowania
są także siła jonowa roztworu (zwykle do zniszczenia ścian i błon komórkowych solami, najczęściej siarczanem(VI) amonu,
0,05-0,1 M) i rodzaj soli użytych do spo- poprzez działanie lizozymem, sonifika- lub czasem ekstrakcję rozpuszczalnikami
rządzania buforów. Aby zahamować dzia- cję z wykorzystaniem ultradz
więków, organicznymi, takimi jak aceton czy eta-
łalność enzymów litycznych, w trakcie homogenizację, rozcieranie z piaskiem nol. Wytrącanie białek, poza tym, że jest
preparatyki stosuje się inhibitory, takie itp. Białka rozpuszczalne stosunkowo pierwszym krokiem w ich oczyszczaniu,
jak np. PMSF czy chlorowodorek benza- łatwo poddają się ekstrakcji wodnymi pozwala również na zwiększenie stężenia
midyny. Czasami zastosowanie znajdują roztworami, np. buforem o określo- uzyskanych próbek.
również substancje o charakterze bak- nej sile jonowej. Niektóre jednak, np. Wytrącanie białek z roztworu za po-
teriostatycznym, które ograniczają roz- białka związane z błonami komórko- mocą soli, zwane również wysalaniem,
wój bakterii, np. azydek sodu. Niektóre wymi, wymagają użycia odpowiednich związane jest z procesem niszczenia
białka, ze względu na wyeksponowane detergentów, takich jak Triton X-100, otoczki hydratacyjnej wokół białka
na zewnątrz wolne grupy tiolowe, które czy rozpuszczalników organicznych.  powoduje to wzmocnienie oddziaływań
mogą ulec utlenieniu w trakcie oczysz- W przypadku zastosowania związków hydrofobowych pomiędzy makrocząstecz-
czania, wymagają obecności w roztworze powierzchniowo czynnych mogą po- kami i tworzenie agregatów białkowych.
czynników redukujących, takich jak di- jawić się problemy z póz
niejszym ich Po dodaniu dostatecznej ilości wody
44
fot. Sartorius Stedim Biotech
SPRZ
T I APARATURA LABORATORYJ NA L A B O R A T O R I U M 7 - 8 / 2 0 0 9
|
warstwa hydratacyjna ulega ponownemu
odtworzeniu, a osad wytrąconego białka
rozpuszcza się i najczęściej wykazuje swo-
je poprzednie właściwości biologiczne.
Ponieważ każde białko posiada charak-
terystycznÄ… strukturÄ™ i Å‚adunek, a jego
rozpuszczalność zależy od wielu czynni-
ajbardziej
ków, takich jak: ich budowa chemiczna,
obecność soli w roztworze, pH roztworu,
Nzaawansowanym
jego temperatura, polarność rozpusz-
i skomplikowanym
czalnika, dlatego poprzez odpowiedni
dobór stężenia siarczanu amonu można
technicznie sposobem
przeprowadzić stopniowe frakcjonowanie
oczyszczania białek
białek obecnych w roztworze. Niektóre
z nich w związku ze swoimi właściwości jest wysoko sprawna
będą wypadać przy niższym, natomiast
chromatografia cieczowa
inne przy wyższym stężeniu soli. Stęże-
nie (NH4)2SO4 potrzebne do wysolenia  HPLC (ang. high
danego białka bywa różne dla różnych
performance liquid
protein i zwykle musi zostać ustalone
chromatography).
doświadczalnie. Najłatwiej wysolić białko
w jego punkcie izoelektrycznym, czyli
w takim pH, w którym ładunek wypad-
kowy na jego powierzchni jest równy
zero. Spośród stosowanych do wytrąca-
nia białek soli to właśnie siarczan amo-
nu jest najczęściej wybierany ze względu
UrzÄ…dzenie do chromatografii cieczowej (LC) firmy Dionex (USA)
na korzystne właściwości (m.in. wysoką umożliwiające klasyczną analizę HPLC
rozpuszczalność i dużą siłę jonową).
Do wysalania białek może zostać rów- z próbki drobnocząsteczkowych substan- które nie wpływają znacząco na jakoś
nież wykorzystany np. chlorek sodu, cji (np. soli). Cząsteczki o wymiarach uzyskanego produktu. Zwykle procedu-
jednak jest on trochę mniej efektywny, znacznie większych niż średnica porów ra oczyszczania białek składa się z kilku
a ponadto może powodować większy sto- w błonie pozostają w woreczku dializa- etapów. Przy optymalizacji procesu, poza
pień nieodwracalnej denaturacji białka. cyjnym, natomiast mniejsze cząsteczki, żądaniem wysokiej wydajności, należy
Drugą metodą wytrącania białek w tym małe jony, swobodnie przechodzą również zwrócić uwagę na minimalizację
z roztworów jest ekstrakcja z użyciem przez otwory membrany i pojawiają się kosztów i czasu potrzebnego na otrzy-
rozpuszczalników organicznych. Wiąże w dializacie na zewnÄ…trz woreczka dia- manie pożądanej proteiny. qð
się ona z obniżeniem stałej dielektrycz- lizacyjnego.
Piśmiennictwo
nej środowiska i ograniczeniem działania W kolejnym etapie otrzymywania biał-
1. Dubin A.: Wprowadzenie do chemii białek. Seria
wody jako dobrego rozpuszczalnika dla ka, tym razem już oczyszczaniu właści-
Wydawnicza Wydziału Biotechnologii Uni-
cząstek polarnych. Taki proces wytrącania wym, należy zastanowić się nad wyborem
wersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2003.
należy prowadzić w obniżonej tempera- odpowiedniej kombinacji technik chro-
2. Harris E.L.V., Angal S.: Protein Purification
turze (0°C lub niższej), aby nie nastÄ…piÅ‚a matograficznych. Metody te rozdzielajÄ…
Methods: A Practical Approach. IRL Press,
nieodwracalna denaturacja białek. białka w zależności od ich specyficznych Oxford 1995.
Na wstÄ™pne frakcjonowanie biaÅ‚ek po- wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci, takich jak: wypadkowy Å‚adu- 3. Janson J.C. and Rydén L.: Protein Purifica-
tion: Principles, High Resolution Methods and
zwala również ultrafiltracja, w której ma- nek, hydrofobowość, kształt i wielkość
Applications. Wiley-VCH, New York 1998.
krocząsteczki różnicowane są ze względu cząsteczek oraz zdolność do wiązania
4. Kozik A., Rąpała-Kozik M., Guevara-Lora I.:
na ich wielkość, a co za tym idzie  masę pewnych ligandów.
Analiza instrumentalna w biochemii. Wybrane
cząsteczkową. Metoda ta jest również
problemy i metody instrumentalnej biochemii
przydatna do zagęszczania próbek. PODSUMOWANIE
analitycznej. Seria Wydawnicza Instytutu
Otrzymane po wytrąceniu solami Przystępując do opracowywania proce- Biologii Molekularnej Uniwersytetu Jagiel-
lub ekstrakcji rozpuszczalnikami orga- dury izolacji i oczyszczania wybranego lońskiego, Kraków 2001.
5. Kryściak J.: Chemiczna analiza instrumentalna.
nicznymi osady białek zostają oddzielo- białka, należy zastanowić się, jakie są cel
Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa
ne od roztworu za pomocą wirowania. i skala procesu, jakie będzie zastosowa-
1999.
W przypadku białek wytrącanych na dro- nie otrzymanego produktu oraz jak wy-
6. Scopes R.K.: Protein Purification: Principles
dze wysalania często w dalszym etapie soki stopień czystości preparatu należy
and Practice. Springer, New York 1994.
oczyszczania są one poddawane dializie, uzyskać. Istotne jest rozróżnienie zanie-
7. Walkowiak B.: Techniki chromatografii cieczowej.
która poprzez zastosowanie półprzepusz- czyszczeń, które muszą zostać usunięte
Przykłady zastosowań. Amersham Pharmacia
czalnej membrany pozwala na usunięcie w trakcie procesu oczyszczania od tych, Biotech, MORPOL, Lublin 2000.
45
fot. Selvita