Ćw. 5  Antygeny zgodności tkankowej.
Test mikrolimfocytotoksyczny wg Terasaki.
Antygeny zgodności tkankowej  glikoproteiny powierzchniowe obecne w błonach komórkowych,
występują u kręgowców, są odpowiedzialne za odrzucanie przeszczepów allogenicznych.
" MHC  Major Histocompatibility Complex  zespół genów kodujących antygeny zgodności
tkankowej, położonych u człowieka na chromosomie 6.
" HLA  Human Leukocyte Antigens  antygeny zgodności tkankowej występujące u człowieka.
Długośd przeżycia przeszczepów narządowych jest uwarunkowana stopniem zgodności HLA
między dawcą a biorcą przeszczepu (antygeny transplantacyjne).
Rys. Schemat mapy genetycznej układu HLA.
Klasy MHC:
�� MHC klasy pierwszej:
" prezentują antygeny limfocytom Tc, doprowadzając do lizy komórki
zainfekowanej np. wirusami lub bakteriami wewnątrzkomórkowymi,
np. Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis
" występują na powierzchni wszystkich komórek jądrzastych (nieliczne na
erytrocytach)
" są kodowane przez polimorficzne geny okupujące trzy loci: HLA-A, HLA-B, HLA-C, w obrębie
każdego locus opisano od kilku do kilkunastu swoistości antygenowych
" u człowieka ze względu na diploidalny komplet chromosomów i dziedziczenie MHC jako
cechy kodominującej zwykle wykrywa się po dwa antygeny z każdego locus
" Budowa:
- łaocuch ciężki  ą (45 kDa)
ż� fragment zewnątrzkomórkowy - 3 domeny "� ą1, ą2 (tworzą
rowek wiążący 9aa antygen ), ą3
ż� fragment hydrofobowy  częśd transbłonowa
ż� fragment hydrofilowy  częśd cytoplazmatyczna
- łaocuch lekki  �2-mikroglobulina (�2m) (12 kDa)  kodowany
przez gen na chromosomie 15, czynnik  wyciągający łaocuch ą na
zewnątrz komórki
�� MHC klasy drugiej:
" prezentują antygen limfocytom Th, doprowadzając do aktywacji układu
immunologicznego poprzez wpływ na:
- odpowiedz
humoralną: Th2 - IL-4, IL-5 IL-6
- odpowiedz
komórkową: Th1  IL-2, IFN-ł, TNF-ą, TNF-�
" występują na powierzchni limfocytów B, makrofagów, komórek
dendrytycznych i nabłonkowych grasicy
" są kodowane w regionie D, który składa się z kilkunastu blisko
położonych loci, zgrupowanych w subregiony: HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR
" wykryto kilkaset swoistości antygenowych kodowanych przez te geny
" Budowa:
- łaocuch ą (33 kDa) i łaocuch � (29 kDa)  częśd
wewnątrzkomórkowa, transbłonowa i zewnątrzkomórkowa
- częśd zewnątrzkomórkowa  domeny ą1 i ą2 oraz �1 i �2
- domeny ą1 i �1  tworzą rowek wiążący 20aa antygen
�� MHC klasy trzeciej:
" Składowe dopełniacza: C4, C2, B
" Występują w plazmie krwi i odgrywają niewielką rolę w odrzucaniu przeszczepów
Funkcje MHC:
" Główna funkcja MHC to wiązanie i prezentacja antygenu limfocytom T
" Heterozygoty wykazują lepszą możliwośd prezentacji większej ilości antygenów, a
polimorfizm MHC zwiększa przeżycie niektórych osobników w populacji podczas epidemii
śmiertelnych chorób !!!
" Różnorodnośd cząsteczek MHC jest wynikiem przystosowania się układu immunologicznego
do walki z mikroorganizmami
Metody identyfikacji HLA:
" Typowanie serologiczne oparte na przeciwciałach anty-HLA, najczęściej monoklonalnych (np.
test Terasaki)
" Typowanie genetyczne określające polimorfizm na poziomie DNA
" Analiza fragmentów restrykcyjnych produktu PCR (PCR-RFLP) i porównanie z określonymi
wzorcami
Typowanie HLA jest istotne w:
- transplantologii
- diagnostyce chorób powiązanych z HLA (np. korelacja między ekspresją HLA-B27 a
zesztywniającym zapaleniem kręgosłupa)
- ustalaniu ojcowstwa
- medycynie sądowej
Test mikrolimfocytotoksyczny wg. Terasaki (wykrywanie HLA kl. I)
Izolacja limfocytów - wykonanie:
1. Odwłóknioną przez wytrząsanie z perełkami szklanymi krew rozcieoczono PBS w stosunku 1:1
2. Otrzymaną zawiesinę nawarstwiono na Lymphoprep w proporcji 2:1 (np. 6ml krwi i 3ml
Lymphoprepu) i wirowano przez 15 min (400xg)
3. Zebrano limfocyty z interfazy (pierścieo znajdujący się między Lymphoprepem a osoczem) i
płukano je 2-3x PBSem oraz rozcieoczono PBS do gęstości 2x106 kom/ml
4. Limfocyty kontrolne, przechowywane w ciekłym azocie odmrożono przez zanurzenie
ampułki w wodzie o temp. 37�C, następnie płukano PBS i przygotowano zawiesinę o gęstości
2x106 kom/ml
Test Terasaki - wykonanie:
1. 72-dołkowe płytki Terasaki na których przeprowadza się test należy odpowiednio oznakowad
i wszystkie zagłębienia wypełnid do 2/3 objętości olejem parafinowym (uwaga! na dnie
zagłębieo nie może byd pęcherzyków powietrza)
2. Do każdego zagłębienia, pod parafinę, wkrapla się przy pomocy mikrostrzykawki Hamiltona o
pojemności 50 �l po 1 �l surowicy wzorcowej anty-HLA (uwaga! Przy każdej zmianie surowicy
strzykawkę trzeba dokładnie przepłukad w PBS (10x), aby uniknąd przeniesienia surowicy z
jednego dołka do drugiego)
3. Zagłębienie oznaczone 1A przeznaczone jest na kontrolę żywotności limfocytów, więc
zamiast surowicy wzorcowej dodajemy tu 1 �l PBS (kontrola negatywna) natomiast do dołka
1B dodajemy wzorcowe limfocyty i wybraną wzorcową surowicę (kontrola pozytywna)
4. Do wszystkich dołków (z wyjątkiem 1B) dodajemy po 1 �l zawiesiny badanych limfocytów o
gęstości 2x103 kom/1 �l PBS
5. Płytki inkubujemy z wytrząsaniem przez 30 min w 20�-24�C
6. Następnie do każdego dołka dodajemy po 5 �l króliczego dopełniacza i inkubujemy próbki z
wytrząsaniem przez 60 min w 20�-24�C
7. Po inkubacji do każdego dołka dodajemy po 5 �l 5% roztworu eozyny żółtawej, a po 3 min po
5 �l 38% roztw. formaldehydu
Dopełniacz łączy się z komórkami opłaszczonymi przeciwciałami i powoduje ich lizę. W dołkach, w
których limfocyty uległy zniszczeniu zaszła reakcja pomiędzy antygenem HLA a skierowanym
przeciw niemu przeciwciałem- wynik dodatni.