2012-10-20
BADANIE PA
YNU
MÓZGOWO-RDZENIOWEGO
Analityka ogólna i techniki pobierania materiału
ZAGADNIENIA
Ocena właściwości chemicznych PMR.
Oznaczanie glukozy w PMR.
Ocena barwionych preparatów cytologicznych
PMR.
22-23.11.11
1
2012-10-20
BIAA
KA W PMR
ó� Prawidłowe stężenie białka całkowitego w PMR:
- 0,15-0,4 g/l (15-40 mg/dl), przy czym wartości <45 mg/dl traktuje się
jako dopuszczalne (płyn z nakłucia lędz
wiowego)
- prawidłowy stosunek albumin/globulin: 2:1
Wzrost stężenia białka całkowitego:
- krwawienie podpajęczynówkowe
- ropne zapalenia mózgu
- wirusowe zapalenie OMR (prawidłowe lub nieznacznie podwyższone)
- guzy mózgu
y
RÓDA
O BIAA
EK PMR:
ó� Białka pochodzące z krwi (wyższe stężenie we krwi niż w PMR)
- większość białek PMR
- albumina, protrombina, IgG, IgA, IgM
ó� Białka pochodzące z OUN (wyższe stężenie w PMR niż we krwi)
- białko tau
- białko S-100
- NSE (enolaza neurospecyficzna)
- cystatyna C
ó� Białka pochodzące częściowo z krwi i częściowo z OUN
- sICAM-1 (cząsteczka adhezyjna)
- transtyretyna (prealbumina)
2
2012-10-20
IMMUNOGLOBULINY
ó� W warunkach fizjologicznych immunoglobuliny w PMR pochodzą tylko i
wyłącznie z krwi i dyfundują na drodze dyfuzji prostej.
ó� W warunkach patologicznych (np. infekcje, SM, wrodzone zakażenia OUN):
- immunoglobuliny mogą być również syntetyzowane wewnątrzoponowo przez
limfocyty B i komórki plazmatyczne w OUN.
- dysfunkcja bariery krew-płyn również zwiększa dyfuzję Ig do płynu.
" Dlatego informacja o współczynnikach immunoglobulinowych musi być
poparta informacją o QAlb
BIAA
KO W PMR- ANALIZA JAKOŚCIOWA
We wstępnej ocenie białek w PMR pomocne są odczyny białkowe,
dające informację na temat zawartości białka i stosunku albumin/globulin:
ó� Odczyn Pandy`ego
Do 1 ml odczynnika Pandy`ego (fenol) dodać 1 kroplę PMR.
- Powstanie zmętnienia świadczy o podwyższonej zawartości białka w płynie i jest
proporcjonalne do jego stężenia.
ó� Odczyn Nonne-Apelta
Do 0,5 ml PMR dodać 0,5 ml odczynnika Nonne-Apelta (nasycony r-ór
(NH4)2SO4. Inkubować przez 3 min. Ocenić zmętnienie.
- Zmętnienie świadczy o zwiększonej zawartości globulin do albumin.
ó� Odczyn Weichbrodta
Do 0,3 ml PMR dodać 0,7 ml odczynnika Weichbrodta (0,1% r-ór sublimatu).
Inkubować 3 min. Ocenić zmętnienie.
- Zmętnienie świadczy o podwyższonym stężeniu globulin.
3
2012-10-20
INTERPRETACJA I FORMUA
OWANIE WYNIKU
(ODCZYNY BIAA
KOWE)
ó� Brak zmętnienia: odczyn ujemny (-)
ó� Opalescencja: odczyn wątpliwy (+/-)
ó� Lekkie zmętnienie: odczyn dodatni (+)
ó� Średnie zmętnienie: odczyn dodatni (++)
ó� Silne zmętnienie lub kłaczki: odczyn dodatni (+++)
BIAA
KO W PMR- ANALIZA ILOŚCIOWA
Metoda Extona
Zasada metody: Białko wytrąca się roztworem kwasu sulfosalicylowego
z siarczanem sodowym. Stopień zmętnienia próbki, proporcjonalny do
stężenia białka, określa się spektrofotometrycznie poprzez pomiar
absorbancji przy =445 nm.
4
2012-10-20
BIAA
KO W PMR
ó� Współczynniki stężeń płyn/surowica
- Białko w PMR i w surowicy (mg/dl)
- eliminacja wpływu wahań dobowych stężeń białek we krwi na ich stężenia w PMR
- eliminacja błędów analitycznych
- Wartość prawidłowa: dla Qalb <9
- 9- 14- 30- Qx >100- całkowite złamanie bariery
WSKAy
NIKI PA
YN/SUROWICA C.D.
ó� Współczynnik albuminowy (QAlb)- ocena sprawności bariery
krew-płyn
Im wyższy stopień dysfunkcji bariery krew-płyn, tym bardziej
nasilona dyfuzja albuminy z krwi do płynu, czego efektem jest
wzrost stężenia albuminy w płynie i wyższa wartość Qalb
Górna granica wartości prawidłowej QAlb w zależności od wieku dla
osób dorosłych:
Qalb= [(wiek w latach)/15] +4
*Prawidłowy Qalb w płynie pobranym z komór bocznych jest 3-krotnie niższy w
stosunku do płynu z worka lędz
wiowego
5
2012-10-20
WSPÓA
CZYNNIKI PA
YN/SUROWICA
ó� Współczynniki QIgG, QIgA, QIgM
(ocena wewnątrzoponowej syntezy immunoglobulin)
Zależność w warunkach prawidłowych:
QAlb> QIgG > QIgA > QIgM (uwarunkowane masą cząsteczkową białek)
- oznaczenie stężenia Ig w surowicy i PMR
- obliczenie górnej granicy wartości prawidłowej w zależności od Qalb wg.
wzorów:
- interpretacja wyników w oparciu o położenie na Reibergramach
WSKAy
NIK LINKA I TIBLINGA
ó� Wartości referencyjne: 0,3-0,7
ó� Wzrost > 0,7: wewnątrzoponowa synteza IgG (np. SM)
ó� Wartość < 0,3: uszkodzenie bariery krew-mózg
6
2012-10-20
INNE METODY STOSOWANE DO OZNACZANIA
BIAA
EK SPECYFICZNYCH
ó� Metody immunochemiczne:
- Immunoturbidymetryczne
- Immunonefelometryczne
- Immunoenzymatyczne
- Radioimmunologiczne
- Immunodyfuzja radialna
- Immunochemiluminescencyjne
INNE METODY STOSOWANE DO OZNACZANIA
BIAA
EK SPECYFICZNYCH
ó� Elektroforeza białek PMR
- Płyn 100-200x zagęszczony (kondensatory kolodionowe)
- pasmo prealbuminy (nieobecna w surowicy)
- Białko tau - desjalizowana transferyna (pomiędzy frakcją beta i
gamma)
ó� Większa zawartość �- globulin i mniejsza ł- globulin w stosunku do
surowicy
ó� Brak fibrynogenu
" Elektroforeza PMR wykonywana jest łącznie z elektroforezą
surowicy!
7
2012-10-20
FRAKCJE ELEKTROFORETYCZNE
Frakcja białkowa % białka całkowitego
Prealbuminy (transtyretyna) 2-3
albuminy 55-65
alfa 1- globuliny 5-7
alfa 2- globuliny 8-10
beta-globuliny 9-11
białko tau 3-4
gamma-globuliny 5-7
REIBERGRAMY
Interpretacja:
8
2012-10-20
JAKOŚCIOWA OCENA WEWN
TRZOPONOWEJ SYNTEZY
IMMUNOGLOBULIN
ó� Równolegle do badania ilościowego, należy przeprowadzić ocenę
jakościową w oparciu o ogniskowanie izoelektryzne
(rozdział białek w polu elektrycznym w zależności od ich
punktów izoelektrycznych. pH buforu zmienia się w sposób
ciągły od najwyższego przy katodzie do najniższego przy
anodzie)
np. w warunkach fizjologicznych frakcja IgG stanowi mieszaninę
białek pochodzących od różnych klonów. W stanach choroby (np.
infekcje wirusowe) zwiększa się produkcja IgG od jednego klonu,
skierowanych przeciwko jednemu lub kilku Ag tego patogenu
lub przeciw własnym Ag (choroby z autoagresji).
ó� należy porównać obraz elektroforetyczny z rozcieńczonej
surowicy oraz PMR i zinterpretować badanie.
INTERPRETACJA WYNIKÓW OGNISKOWANIA
IZOELEKTRYCZNEGO IGG
Ty Prążki w Prążki w płynie Interpretacja
p surowicy
1 brak brak obraz prawidłowy
2 brak obecne wewnątrzoponowa synteza IgG
(Choroby zapalne OUN)
Stwardnienie rozsiane
3 obecne prążki identyczne zapalenie ogólnoustrojowe z
jak w surowicy + zajęciem OUN
prążki dodatkowe (Neurosarkoidoza)
4 obecne prążki wyłącznie zapalenie ogólnoustrojowe,
identyczne jak w bierna dyfuzja IgG z krwi do
surowicy płynu
(Zespół Guillaina-Barre)
5 jeden lub kilka obraz identyczny gammapatie, np. szpiczak
silnie wysyconych jak w surowicy bierna dyfuzja z krwi do płynu
prążków
(monoklonalne)
9
2012-10-20
OCENA WEWN
TRZOPONOWEJ SYNTEZY PRZECIWCIAA
-
INDEKSY PRZECIWCIAA
SPECYFICZNYCH
(WSKAy
NIK HAGEDRONA)
ó� Ocena stężenia przeciwciał przeciwko poszczególnym
czynnikom patogennym (antygenom)
ó� Oznaczenie stężenia danego przeciwciała w surowicy i
płynie metodami immunochemicznymi (wysoka czułość)
ó� Obliczenie współczynników dla danego przeciwciała
ó� Obliczenie indeksu przeciwciała (AI):
np. AIIgGpatogen= QIgGpatogen/QIgG
* w zależności która wartość jest niższa QIgG czy Qlim (IgG), tę wartość należy
wstawić do wzoru.
WARTOŚĆ PRAWIDA
OWA: AI=0,7-1,3
Wartości e" 1,4 (wewnątrzoponowa synteza immunoglobulin danej klasy
Wartość < 0,7 (błąd analityczny)
BADANIA PODSTAWOWE
ó� Glukoza w PMR
- podstawowy substrat energetyczny neuronów
- stężenie prawidłowe w PMR: 50-60% stężenia w surowicy ok. 40-75
mg/dl
Podwyższone stężenie:
- brak znaczenia diagnostycznego w przypadku prawidłowego
stężenia we krwi
- Cukrzyca
- Urazy i udary mózgu
Obniżone stężenie:
- Bakteryjne, grzybicze i gruz
licze zapalenia OMR
- procesy nowotworowe w OUN
- - hipoglikemia
*krew i surowica powinny być pobrane do badania co najmniej po 4 godzinach od posiłku!
10
2012-10-20
GLUKOZA W PMR
Metoda heksokinazowa- Glukoza pod wpływem heksokinazy zostaje
ufosforylowana do glukozo-6-fosforanu, który pod wpływem dehydrogenazy jest
specyficznie utleniany do 6-fosfoglukonianiu, redukując NADP+ do NADPH2.
Pomiaru absorbancji dokonuje się przy 340 nm. Obserwuje się wzrost absorbancji
proporcjonalny do stężenia glukozy.
heksokinaza
glukoza + ATP glukozo-6-P + ADP
dehydrogenza glukozo-6-P
glukozo-6-P + NADP+ 6-fosfoglukonian + NADPH + H+
Interferencja: hemoliza próbki
BADANIA PODSTAWOWE
Chlorki w PMR
- stężenie prawidłowe: 112-130 mmol/l
Metoda Zall a, Fisher a i Garner a.
Jon chlorkowy (Cl-) zmieszany z roztworem niezdysocjowanego rodanku rtęciowego
preferencyjnie wiąże się z rtęcią tworząc chlorek rtęciowy. Uwalniany jon rodankowy SCN-
łączy się z jonami żelazowymi dając silnie zabarwiony rodanek żelazowy absorbujący
światło o długości fali 500 nm. Intensywność zabarwienia jest wprost proporcjonalna do
stężenia jonów chlorkowych w badanej próbce.
Stężenie podwyższone:
- stany zapalne mózgu i rdzenia kręgowego
- guzy mózgu
Stężenie obniżone:
- gruz
licze zapalenie OMR
- kiła układu nerwowego
- Pląsawica
- grzybicze zapalenie
11
2012-10-20
BADANIA UZUPEA
NIAJ
CE
ó� Mleczany
- reszty kwasu mlekowego powstające z komórkach na skutek
niedoboru tlenu;
- stężenie mleczanów w PMR jest niemal niezależne od
stężenia w surowicy (produkcja w OUN)
- parametr oceny procesów zapalnych w OUN
ó� Stężenie prawidłowe: < 2,1 mmol/l
Wzrost stężenia:
- choroby z dysfunkcją bariery krew-płyn
- hipoksemiczne uszkodzenia mózgowo-rdzeniowe
- krwawienie podpajęczynówkowe
- obrzęk mózgu
- zwiększona granulocytoza płynu
- procesy nowotworowe w OUN
- zakażenia bakteryjne > 3,5 mmol/l
- zakażenia wirusowe < 3,5 mmol/l
- Zakażenie grzybicze, gruz
lica OUN,
BADANIA UZUPEA
NIAJ
CE
ó� Białko tau
ó� 99% białka w PMR pochodzi z komórek OUN
ó� stężenie prawidłowe: < 300 pg/ml
Podwyższone stężenie:
- choroba Alzheimera
Obniżone stężenie:
- neuroborelioza i inne choroby zapalne
ó� Białko S-100b
- izoforma ważna diagnostycznie w monitorowaniu
uszkodzeń w OUN, np. po urazach
- Stężenie prawidłowe: < 1,4 ng/ml
12
2012-10-20
BADANIA UZUPEA
NIAJ
CE
ó� Białko 14.3.3
- białko produkowane w komórkach nerwowych.
- nie występuje w prawidłowym PMR
Występowanie:
- Choroba Creutzfeldta-Jakoba
ó� NSE (enolaza neurospecyficzna)
produkowana przez kom. nerwowe i neuroendokrynne.
Stężenie prawidłowe: < 12,5 ng/l
Wzrost stężenia:
- uszkodzenie neuronów, np. przy udarach
ó� Inne: �-amyloid > 500 pg/ml
LITERATURA
1. Mantur M, Lewczuk P. Płyn mózgowo-rdzeniowy. Badanie i
interpretacja wyników. Wydawnictwo Ekonomia i Środowisko,
Białystok, 2002.
2. Dembinska-Kieć A, Naskalski JW. Diagnostyka laboratoryjna z
elementami biochemii klinicznej. Urban & Partner, Wrocław, 2010.
3. Uszyński M (red.). Płyny z jam ciała. Powstawanie i badania
laboratoryjne. PZWL, Warszawa, 1998.
4. Guder WG i wsp. Próbki: od pacjenta do laboratorium. MedPharm
Polska, Wrocław, 2009.
5. Angielski S (red.). Biochemia kliniczna i analityka. PZWL, Warszawa,
1980.
6. Brunzel NA. Diagnostyka laboratoryjna. Płyn mózgowo-rdzeniowy i
inne płyny ustrojowe. Kemona H, Mantur M (red.). Elsevier U&P,
Wroclaw, 2010.
13