BIOTECHNOLOGIA
BIOTECHNOLOGIA (ponad 20 definicji)  termin został wprowadzony i upowszechniony w latach
70-tych , wraz z rozwojem in\
ynierii genetycznej (jako jej synonim).
Tymczasem in\
ynieria genetyczna  zbiór technik: laboratoryjnych, biologicznych, molekularnych;
wykorzystywanych zarówno w biotechnologii jak i w innych dziedzinach (lata 20-te Instytut
Biotechnologii, lata 50-te czasopisma).
Biotechnologia jest dziedziną nauki i przemysłu obejmującą ró\
ne kierunki technicznego
wykorzystania procesów biologicznych (A.Chmiel)  biochemia.
MULTIDYSCYPLINARNA dziedzina nauki i techniki obejmująca:
- badania
- wytwarzanie
- wykorzystywanie:
- DNA / RNA
- białek / enzym
- drobnoustroje
- kultur komórkowych
w procesach :
- modyfikacji genetycznej
- biosyntezy
- biokatalizy (biotransformacji i biokonwersji)
- bioutylizacji
a tak\
e wyodrębnienie i modyfikację tak otrzymanych bioproduktów.
Biotechnologia (1-a z wielu definicji w USA)  obejmuje zastosowanie systemów biologicznych i
organicznych w procesach technicznych i przemysłowych).
BIOSYNTEZ
prowadzimy zazwyczaj przy u\
yciu komórek.
BIOKATALIZA na poziomie enzymów.
Enzym mo\
e być u\
yty w formie wolnej (rozpuszczalnej) lub immobilizowanej (z mo\
liwością
u\
ycia w następnych etapach)
Czasem mo\
emy zastąpić 1 enzym komórką dodając 1 konkretny substrat ; otrzymujemy zało\
ony
wynik.
KORZENIE BIOTECHNOLOGII
procesy spontaniczne
-ferment. napoje mleczne
wino  Bliski Wschód 12000 lat
piwo  Suwerowie 8000
- chleb  Egipt 6000
- spirytus  Chiny 3000
1857  L. Pasteur  narodziny mikrobiologii
EWOLUCJA
1.ERA PRE-PASTEUROWSKA (Staro\
ytn.  185-te)
Procesy spontaniczne.
Fermentowana \
ywność i napoje : chleb, wino, piwo, jogurty, sery.
2. ERA PASTEUROWSKA (lata 1860  1940)
Mikrobiologia kreuje nowy przemysł
- czyste kultury drobnoustrojów
- produkcja dro\
d\
y, etanolu, butanolu (przemysł kauczukowy), acetonu (materiał wybielający), kwasu
cytrynowego, mlekowego
- biologiczne oczyszczalnie ścieków
3. ERA PODSTAW NAUKOWYCH (lata 1940-1970)
Nauki biologiczne, chemiczne, in\
ynieryjne tworzą podstawy współczesne biotechnologii:
- projektowanie bioreaktorów
- procesy w warunkach sterylnych
- skrining i doskonalenie szczepów
- kultury komórkowe org. Wy\
szych
1
 - immobilizacja enzymów i komórek
- biokataliza
- nowe produkty: antybiotyki, aminokwasy, dekstrany enzymy, inhibitory
enzymów, immunomodulatory, leki steroidowe, szczepionki, witaminy,
nukleotydy.
Szczepienia p/ wirusowego zapalenia wątroby  izolowanie z kultur bakteryjnych, jednak istnieje projekt
otrzymywania jej z liści sałaty.
4.ERA BIOLOGII MOLEKULARNEJ (1970- 2000)
- fuzja komórek / protoplastów (otrzymywanie p/ciał monoklonalnych)
- in\
ynieria genetyczna
- bioinformatyka
- biofarmaceutyki:
leki DNA, szczepionki DNA, p/ciała monoklonalne
- diagnostyka molekularna
sondy genetyczne, odczynniki diagnostyczne DNA
- nowe koncepcje:
technologia antysensu, terapia genowa, komputerowe projektowanie leków,
zwierzęta i roślin jako bioreaktory.
5.ERA BIOLOGICZNA (po 2000 r.)
Oczekiwania:
- leki celowane
- nowe szczepionki (p/AIDS)
- bioelektronika (bioczipy)
- superenzymy (ap, rybo, syn, -..zymy)
- ulepszone białko spo\
ywcze
- asymilacja azotu przez rośliny
- energia /paliwa z surowców odnawialnych (biopaliwa, wodór, metanol, tlen)
- kompleksowa ochrona środowiska (spasanie bydła z grzybami produkującymi
Antybiotyki  m. ciała)
Dyscypliny budujące biotechnologię
- genetyka
- biochemia
- chemia
- ekonomia
- biologia molekularna, komórkowa
- immunologia
- ekologia
- mikrobiologia
Biotechnologia wykorzystywana jest w wielu dziedzinach m. innymi
- ochrona zdrowia
- analityka
- przemysł spo\
ywczy
- przemysł chemiczny
- hydrobiometalurgia
- paliwa
Podstawowe pojęcia:
- fermentacja  proces przy udziale mikroorganizmów
- technologia mikrobiologiczna
- technologia enzymowa
- in\
ynieria bioprocesowa (przeniesienie tego co robi się w laboratorium na
produkcję przemysłową, opracowanie bioreaktorów) bioreaktory (z probówki
do bioreaktora)
- in\
ynieria genetyczna
2
 - in\
ynieria komórkowa (in\
ynieria genetyczna na poziomie komórkowym 
fuzja komórek
- in\
ynieria białkowa (enzymowa)
1.Fermentacja  to najstarsza technologia stosowana przez człowieka.
Fervere  gotowanie, burzenie się, kipienie jako wizualny efekt towarzyszący spontanicznemu procesowi
zachodzącemu w sokach i moszczach owocowych oraz zacierach zbo\
owych.
L.Pasteur
-\
ycie beztlenowe
Biochemia:
- procesy kataboliczne, w których utlenienie substratu ! węglowodany, przebiegające z wydzieleniem
CO2 i nie wymagają O2 cząsteczek jako akceptora elektronów, jego rolę pełnią metabolity pośrednich
procesów degradacyjnych przyswajanych związków organicznych.
Technologia
- procesy mikrobiologiczne, w których ró\
ne związki organiczne ulegają przemianom chemicznym przy
udziale enzymów.
Technologia fermentacji = technologia mikrobiologiczna
Atuty biotechnologii:
- wykorzystanie surowców odnawialnych (węgiel pochodzi z sacharozy, glukozy, skrobii, tłuszczów)
- ró\
norodność produktów
- specyficzność i selektywność w zakresie:
- struktury produktu biosyntezy
- reakcji biotransformacji
- produkty (enancjomery) biologicznie czynne
- łagodne warunki procesu (temp., ph, ciśnienie, środowisko wodne)
- mała energochłonność (produkcja dekstranów)
- du\
y stopień bezpieczeństwa bioprocesów ( wyjątkiem są hodowle patogenów) np. produkcja
szczepionek
- stosunkowo niegroz
ne, łatwe do zneutralizowania ścieki i odpady.
Biotechnologia dla ochrony zdrowia.
Tradycyjny przemysł farmaceutyczny: antybiotyki, witaminy (C, B2,B12), aminokwasy (L), dekstrom,
1. immunomodulatory, alkaloidy,
2. leki steroidowe, enzymy.
Nowe leki oparte na technikach DNA
3. hormony peptydowe
4. czynniki odpornościowe, białka krwi(czynniki krzepnięcia trombolitycznego), enzymy.
Przemysł środków immunoprofilaktycznych
5. szczepionki, surowice
Produkcja testów diagnostycznych:
- sondy genetyczne, testy immunologiczne (biologia molekularna).
Kultury komórkowe in vitro (nieśmiertelne)
przeciwciała (ciała monoklonalne), białka lecznicze, skóra,
6. metabolity wtórne roślin.
Organizmy transgeniczne (rośliny, zwierzęta):
7. produkty peptydowe ( propozycja szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby).
Terapia genowa (biologia molekularna)
****
1. cyklosporyna A  przeciw odrzuceniu przeszczepu
2. fitosterole, stigma  diosgenina mo\
na wyeliminować kilka etapów syntezy chemicznej wprowadzając
1 etap enzymatyczny, czyli skrócony proces syntezy
3. hydroliza penicyliny G, V do kwasu penicylinowego przeprowadzonego w łagodnych warunkach
enzymatycznych (enzymatyczna hydroliza penicylin półsyntetycznych)
4. insulina; h. wzrost.
3
5. interfenory; interleukiny
6. stare technologie rozwijające się po II wojnie światowej
7. paklitaksel  namna\
anie wirusów
8. zwierzęta produkują dane białko w mleku (krowy, króliki, owce, kozy) rośliny transgeniczne: soja
kukurydza BADANIA
TECHNOLOGIA FARMACEUTYCZNA I MEDYCYNA W XX WIEKU
lata 1940-1960 - dominacja antybiotykowa  szczepionki
lata 70-te - kultury komórkowe in vitro, in\
ynieria genetyczna, przekraczanie barier, nowe
koncepcje biotechnologiczne
lata 80-te - biofarmaceutyki (czynnik rozwoju in\
ynierii genetycznej) , sondy DNA i testy
diagnostyczne
lata 90-te - lawinowy rozwój biologii molekularnej
- bioinformatyka, genomika, farmakogenomika
- rozwój molekularnych metod diagnostycznych
- nowe strategie pozyskiwania leków
- synteza i biosynteza kombinatoryczna, HTS
- nowe strategie leczenia: terapia genowa, indywidualizm
- biotechnologia tkanek i organów do przeszczepów
BIOFARMACEUTYKI  produkty polipeptydowo/ białkowe przechodzące ze z
ródeł
naturalnych lub wytwarzane przy udziale technologii:
- rekombinowanego DNA
- hybrydoma ( przeciwciała monoklonalne)
a tak\
e kwasy nukleinowe( np. do terapii genowej) polinukleotydy i ich pochodne (np. do terapii
antysensowej) przeznaczone do celów leczniczych.
Przykłady biofarmaceutyków :
- hormony polipeptydowe (insulina, glukagon, somatotropina)
- cytokiny ( interferony, interleukiny, TNF)
- przeciwciała monoklonalne
- czynniki wzrostu (czynniki wzrostu skóry, erytropoetyna)
- białka hemostazy ( cz. krzepn. VIII i IX)
- cz.. przeciwzakrzepowe i trombolityczne (A
PA, aktywator plazminogenu, alfaantytrypsyna, hirudyna)
- enzymy (DN-aza, galaktozydaza, glukocerebrazydaza)
- szczepionki ( DPT, Hep B i A+B, Haemophilus influenza)
Nakłady w USA > 5 mld USD
Rodzaj działalności
- opracowania biotechnologiczne 54%
- badania chorób 39%
- technologia powstawania leków 7%
Kierunki badań technologii farmaceutycznej
- genomika 31
- bioinformatyka 11
- chemia 24
- skrining leków 23
- terapia genowa 11
4
Rodzaje chorób:
- choroby układu krą\
enia 32 (np.statyny)
-choroby krwi 15
- choroby metaboliczne (wady genetyczne) 12
- nowotwory 11
- choroby zakaz
ne 10
- inne 20
Jest ok.100 substancji leczniczych nazywanych biofarmaceutykiem, a leków około kilkuset.
Opracowanie nowego leku pochodzenia naturalnego (droga klasyczna).
A. Skrining nowych naturalnych substancji leczniczych.
1. Wykrycie bioaktywnego produktu w materiale biologicznym
2. Wydzielenie i oczyszczenie bioproduktu
3. Wstępna ocena aktywności biologicznej  wynik pozytywny
B. Zaawansowane prace badawcze
4. Identyfikacja chemiczna bioproduktu ( modyfikacja, gdy właściwości są nieznane)
5. Modyfikacja chemiczna (poprawa parametrów leku) lub synteza analogów (np. przez
zamianę jednego atomu N, S  doksorubina miksotrakson)
6. Badania farmakologiczne  wynik pozytywny
C. Opracowanie leków
7. Forma leków
8. Badania kliniczne
Poszukiwanie nowego leku polega na wykorzystaniu molekularnej wiedzy biologicznej o chorobie w celu
wyselekcjonowania makromolekularnego miejsca uchwytu (receptora) dla leku i opracowanie na tej
podstawie właściwej techniki skriningowej, która mo\
e być u\
yta do selekcji tzw. związków wiodących 
małocząsteczkowych struktur w oparciu o które będzie projektowany nowy lek.
Strategia poszukiwania nowego leku na przełomie XX i XXI wieku
molekularna wiedza biologiczna o chorobie
�!
receptor makromolekularne miejsce uchwytu dla leku
�!
przyroda HTS (wysokosprawna technika skriningowa) �! synteza kombinatoryczna
�!
związek wiodący
�!
projektowanie leku (CAMD)
Nowoczesne podejście do badań:
Skrining przesiewanie, HTS przeprowadzanie du\
ej ilości testów w celu zbadania wielu próbek w
wielu kierunkach badań (tysiące próbek równocześnie w stosunku do tysięcy miejsc receptorowych)
nasza efektywność jest du\
a. Wykorzystuje się płytki ze studzienkami, na 1 płytce mogą być tysiące
takich studzienek i wykonują to automaty, całość jest skomputeryzowana (miniaturyzacja i
zwielokrotnienie próbek przy u\
yciu robotów i komputerów) ( w jednym podejściu mo\
na zbadać
bardzo wiele próbek równocześnie, w stosunku do bardzo wielu miejsc receptorowych. Olbrzymia
efektywność poszukiwań. To wszystko wykonuje się przez: miniaturyzację i zwielokrotnienie próbek
przy u\
yciu robotów i komputera. Chemik wybiera elementy (wyjściowy substrat) o określonej liczbie,
aby zsyntetyzować wszystkie mo\
liwe kombinacje np. synteza na nośniku stałym, w roztworach
(synteza kombinowana polega na łączeniu związków chemicznych, w ró\
nych wszystkich mo\
liwych
kombinacji, \
eby otrzymać jak najwięcej nowych substancji).W testach skriningowych nie rozdziela się
mieszaniny produktu, dopiero po wyniku testu wyodrębnia się (problemem jest rozdzielenie i
oczyszczenie, dlatego stosuje się skrining, najpierw w mieszaninie szuka się produktów selektywnych, a
póz
niej szuka się w mieszaninie związku wiodącego).
5
BIOINFORMATYKA
(molekularna) biologia komputerowa
Pozyskiwanie, przechowywanie, przetwarzanie oraz analiza i interpretacja informacji biologicznych przy
u\
yciu techniki komputerowej.
W przewa\
ającej części dotyczy to makromolekularnych baz danych (DNA /genomika/, białka
/proteomika/, węglowodany).
FARMAKOGENETYKA leczenie:
genetyczne uwarunkowanie skuteczność
podatności na choroby metabolizm
�! dział niepo\
ądany
ę! ę! ę!
polimorfizm genetyczny osobnicze struktury docelowe
struktur docelowych
�!
HTS Molekularne cel molekularny
badanie (target) miejsce uchwytu dla LEK
przesiewowe proponowanego leku
FARMAKOGENOMIKA ę! ę!
Genomika strukturalna
sekwencjonowanie DNA Proteomika kliniczna
białka receptorowe
Genomika białka przenośnikowe
Genomika funkcjonalna enzymy
Ekspresja genów
Celem poznanie paszportu genetycznego
Miejsce uchwytu proponowanego leku (target) np. białka receptorowe, komórki recepturowe (terapia
nowotworowa).
Od syntezy / biosyntezy zw. do wprowadzenia leku do lecznictwa.
Na 1 nowy lek nale\
y wytworzyć 50 tys. nowych związków , z czego 50 (0,1%) poddaje się badaniom
przeciwklinicznym, a tylko 5 (0,01%) dopuszcza się do badań klinicznych. Cykl od wytworzenia do
dopuszczenia : 10-12 lat. Koszty 200-250 mln USD na 1 lek (nawet 1 mld USD) w tym:
produkcja < 10% �! (chemicy, biolodzy, genetycy, lekarze, in\
ynierowie)
bad. przeciwklin. (?)< 15 %
bad. klinicz. < 75%
+ marketing dominujący całą produkcją / stanowi obecnie 30-40% ceny leku
Zapewnienie dobrej jakości produktu.
GMP kontrola dobrej jakości produktu
ę!
koncesje personel
normy kontrola dokumentacja produkcji
certyfikaty produkcja:
warunki, procesy
audyty,
walidacje
6
Zakres problematyki biobezpieczeństwa.
1. U\
ywane organizmy: praca z atenuowanymi i nieatenuowanymi wirusami przy produkcji szczepionek
2. Procesy i produkty: czy końcowy produkt jest bezpieczny ?, w czasie produkcji najbardziej
niebezpieczne są aerosole leków p/nowotworowych
3. Laboratoria i przemysł  du\
a skala, główne niebezpieczeństwo w przemyśle
4. Personel i inni ludzie  wa\
ne jest tu przeszkolenie pracowników
5. Środowisko  problem zagro\
enia dla środowiska ze strony odpadów
Np. produkcja szczepionek p/wściekliz
nie, antybiotyki p/nowotworowe w postaci aerosoli.
Procesy nale\
y tak przeprowadzać, by uniknąć zagro\
enia. Du\
e zagro\
enie, gdy pracujemy w
laboratoriach i w zakładach przemysłowych (personel musi być ciągle doszkalany)
Ocena zagro\
eń ze strony drobnoustrojów.
1. Chorobotwórczość infekcyjna (wirulencja)
2. Toksyczność produkcji
3. Efekty alergiczne
4. Ilość /masa/ drobnoustrojów /skala hodowlana/
5. Techniki pracy i rodzaje operacji technologicznych
6. A
atwość rozprzestrzeniania się zarazków
7. Zagro\
enie dla personelu i dla innych osób
8. Stosowane zabezpieczenia techniczne /opalanie ez, szafki z laminarnym nawiewem
9. Dostępność środków profilaktycznych i metod leczenia /szczepionki/
Klasy drobnoustrojów wg ryzyka mikrobiologicznego.
Klasa Opis Przyjęto wg. EFB - przykłady
Kl 1. bezpiecz. Nigdy nie były identyfik. Bacillus subtilis
jako czynniki chorob. dla Lactococcus lactis
człowieka, nie stanowią te\
Saccharomyces
zagro\
enia dla środowiska Cerevisiae
Kl.2. zagro\
. małe Mogą wywoływać choroby Bacillus cerens E. Coli
u ludzi, stanowią zagro\
enie Candida albicans
dla pracowników, nie rozprzestrz. Adenowirusy
się do środowiska, istnieją skuteczne HAV, Herpes
metody profilaktyki i leczenia
Kl.3. zagro\
śred. Chorobotwórcze o du\
ym zagro\
eniu Bacillus antracis
dla pracowników, ale w małym Salmonelle typhi
stopniu dla środowiska, skuteczne wirus HBV, HIV
metody profilaktyki i lecznictwa wścieklizny
Kl.4. zagro\
. du\
e Groz
ne dla wszystkich, brak wirus: Congo
skuteczności w profilaktyce i Ebola Lasa
lecznictwie Variole
Kl.E. zagro\
enie Patogeny roślinne i zwierzęce, Ehrcichie
dla środow. brak lub niewielkie zagro\
enie Mortirella
dla ludzi, często odpowiedzialne za Fusarium
powa\
ne straty ekonomiczne Poxviridae
Tworzenie się aerozoli:
- mieszanie i napowietrzanie cieczy
- wirowanie w otwartych naczyniach
- mielenie
- pobieranie prób
- przekłuwanie warstewki cieczy
7
- pękanie pęcherzyków
- uderzanie kropel o powierzchnię
- wibracje ultradz
więkowe
- obróbka cieczy pod ciśnieniem
c.d.GMP  zapewnienie dobrej jakości produktu, wprowadzenie
GMP  zarządzanie jakością zarządzanie procesem produkcyjnym, aby uzyskać najlepszą jakość
kontrola jakości
- personel  ciągłe szkolenie kadry
- dokumentacja produkcji b. wa\
na
- produkcja : warunki, procesy
- audyty, walidacje punkt wyjścia do GMP
- normy, certyfikaty, koncesje
GMP  du\
y koszt
Motywy zapewnienia jakości:
- wejście na rynek i utrzymanie się na nim
- wejście konkurencyjności
- zapewnienie wiarygodności producenta
- racjonalizacja zarządzania i procesu produkcyjnego
- minimalizacja strat
- minimalizacja kosztów
Dokumentacja
- księga jakości
- dokumentacja walidacyjna /dot. procedur, urządzeń
- koncesje, certyfikaty
- standardowe procesy operacji technologicznych
- specyfikacja surowców, materiałów i produktów
- instrukcje wykonawcze  krok po kroku
- harmonogramy
- zapisy /raporty/ protokoły dotyczące realizacji ka\
dej szar\
y produkcyjnej, inspekcji nawiew /
wewnętrznych, audytów.
Procedury jakości
Audyt  systematyczne niezale\
ne badanie czynności dotyczące zapewnienia jakości produkcji /procesu/
produktu
Audyty formalne dla uzyskania koncesji na produkcję i certyfikację zgodności z GMP prowadzi Nadzór
Farmaceutyczny MZiOS przy udziale Biura Oceny Systemów Jakości Instytutu Leków.
Kwalifikacje  udokumentowane wykazanie, ,\
e instalacja działa zgodnie z ustalonymi wymaganiami
procesowymi, materiały/ produkty są zgodne z ich specyfikacją.
Walidacja  udokumentowana weryfikacja prawidłowości procedury/ czynności/ materiału/ instalacji/
procesu/ systemu oraz ich zgodności z zasadami GMP
GMP: Pomieszczenie do produkcji /bio/ farmaceutyków jałowych
Projekty i wykonanie pomieszczeń:
- śluzy dla personelu i materiałów
- nawiew / filtry HEPA(high efficiency particulate air filter), nadciśnienie/ i wywiew powietrza
- brak miejsc kłopotliwych dla utrzymania w czystości
8
- u\
ycie materiałów trwałych /stal kwasoodporna, poliester, PCV, laminaty winylowe, specjalne powłoki
malarskie
- szczelność i gładkość powierzchni
- łukowe łączenie płaszczyzn
- przeszklenie ścian w celu ich obserwacji z zewnątrz
- staranne wykonanie /wykończenie/
Utrzymanie czystości pomieszczeń, urządzeń i materiałów
- procedury mycia, czyszczenia, odka\
ania, sterylizacji
- procedury CIP / cleaning in place/
Mikrobiologia  bakterie, grzyby, kultury komórkowe
Bacteria used in biotechnology  głównie saprofityczne
Gram  positive /częściej u\
ywany/
Lactobacillus - mlekowe
Lactococcus (streptococcus)
Leuconostoc - dekstran
Brevibacterium - aminokwasy  kw. Glutaminowy, lizyna
Corynebacterium:
- steroidy Arthrobacter
Bacillus  produkcja białek, enzymów
Clostridium  produkcja acetonu, butanolu
Actinomyces antybiotyki
Streptomyces witaminy,enzymy
- gentamycyna Micromonospora
Nocardia antybiotyki
Gram  negative
- Acetobacter
- Gluconobacter  wit. C /produkcja/
- Pseudomonas
- Xamtomonas
- Zymomonas  prod. etanolu, konkurencja dro\
d\
y w Ameryce Środkowej
- Escherichie  acylaza penicylinowa, aspartaza  E.Coli
Escherichie coli  badanie nr 1 w biotechnologii
Produkcja:
- kw. asparaginowego /kw. fumarowy do kwasu asparaginowego
- asparaginazy - /stosowane w białaczkach  rozkład asparaginy do kwasu fumarowego i NH3/ - enzym
uniemo\
liwiający rozwój komórek potrzebujących asparaginy
- acylazy penicylinowej  produkcja penicyliny / leczenie białaczki, komórki nowotworowe są
niedo\
ywione/
- produkty r DNA
�!
rekombinowane DNA
Nr 1. w in\
ynierii genetycznej:
- była genetycznie najlepiej poznana
- łatwa do hodowli  glukoza, czasami cytrynian, sole mineralne
- najszybciej rozmna\
a się / szybciej się rozmna\
a w warunkach tlenowych , o 20 razy szybciej/,
najlepszy wzrost na podło\
ach kompleksowych  20 min. 1 pokolenie, okres generacji nawet 18
minut.
Szczep K 12 E. Coli  punkt wyjścia dla wielu badań:
9
- brak czynnika przyczepności i zdolności do adhezji na komórkach gospodarza
- brak odporności na lizę w osoczu krwi
- brak odporności na fagocytozę
- niekompletny lipopolisacharyd błony komórkowej / nieaktywna endotoksyna/
- swoiste wymagania do wzrostu
- nie mogą zasiedlić jelit
Te właściwości nie pozwalają przejść bakteriom poza laboratorium  stąd uznajemy je za bezpieczne.
Rozwój filogenetyczny bakterii podręcznik
Budowa morfologiczna  Brevibacterium zbli\
one do corynebacterium ró\
ne formy morfologiczne
Actinomyces  występują łańcuszki bakterii
Nocardia i Streptomyces  układ charakterystyczny dla promieniowców *
GRZYBY PRODUKUJ
CE ANTYBIOTYKI
1)Penicylinum chrysogenum
penicylina G /naturalna/ i V /nie jest produktem naturalnym/
Chcemy wyprodukować tylko penicylinę G, penicylinę V wytworzyli technolodzy dodając czynny
prekursor /reszta kwasu fenoksyoctowego/ doustna, obecnie słu\
ą do syntezy penicylin
półsyntetycznych.
2)Acremonium chrysogenum
/Cephalosporinum acremonium/
Cefalosporyna C
3)Penicilium griseofulvum
Gryzeofulwina  antybiotyk p/grzybowy
4)Peaciliomyces Varioti
Variotyna
5)Fusidium Coccineum
Kwas fusydowy
6)Tolypocladium inflatum
Cyklosporyna  czynnik immunosupresyjny przy przeszczepach.
*(Nacordie i streptomyces /antybiotyki wytwarzane  gentamycyna
- ryfamycyna
- streptomycyna
występują strzępki jak u grzybów, są to bakterie bo nie mają jądra,
chromosom pojedynczy GENOFOR
występuje problem mieszania, napowietrzania, lepkości, gęstości).
Bacillus /bardzo wa\
ny rodzaj w biotechnologii/ produkcja enzymów do ró\
nych celów:
- produkcja bacytracyny, kolistyny, polimyksyny /antybiotyk polipeptydowy/, stosowany w sposób
ograniczony ze względu na toksyczność
- w przemyśle ze względu na wa\
ne enzymy
Warunki hodowli bakterii:
Składniki biomasy /i podło\
y hodowlanych/
C do 50% O do 30% H do 8%
Ze związków org. będących z
ródłem energii / gł. Węglowodany/
Warunki tlenowe akceptor elektronów /O2/ dostarczamy z powietrzem, a nie z biomasy.
N do 14%
�!
NH4, NO3, a-kwasy, polipeptydy (musza ulec degradacji  wolniej przyswajają)
P do 3% -PO4 S do 1% - SO4
K, Na, Mg, Ca, Cl kofaktory enzymów  potrzebne w ilości 0,1  1 � mol/l
�!
10
Ca2+ w formie dipikolinianu wapniowego, odpowiedz. Jest za ciepłooporność
przetrwalników.
Zn, Mn, Cu, Co, Fe  potrzebne w ilości 0,1  100 � mol/l
�!
składniki wielu układów enzymatycznych
z zanieczyszczeń surowców i H2O
W przemyśle u\
ywamy H2O technologicznej  uzdatniona woda wodociągowa, najlepiej ze studni
artezyjskiej  czyste mikrobiologicznie i bez zanieczyszczeń biologicznych.
PREKURSORY W PROCESACH BIOSYNTEZY  (tabela znajduje się w ksią\
ce)
Prekursor Produkt Drobnoustrój
Cl CTC  chlorotetracyklina Streptomyces amofaciens (?)
kobalt Co, CN Kobalamina Propionibacterium sp
Glicyna L-seryna Corynebacterium glycinophilum
Fenylooctan penicylina G Penicilium chryzogenum
Fenoksyoctan penicylina V
Tryptofan alkaloidy
Składniki kompleksowe podło\
y
Namok kukurydziany /stosowany jako proszek/ - 45-55% suchej masy, wolne aminokwasy, peptydy,
zw. azotowe, witaminy, kwas mlekowy, sole mineralne  N, P, cukry 5% s.m. /produkt fermentacji
mlekowej ziaren kukurydzy i bakterie powodują rozkład białek kukurydzy/.
Melasa 80-85% s.m., związki azotowe sole mineralne, sacharoza  48050% suchej masy i melasa 
produkt odpadowy z produkcji cukru.
Serwatka u\
ywana jest w przemyśle mleczarskim , związki azotowe, jako popiół, sole mineralne, lipidy.
Namok  produkt fermentacji ziaren kukurydzy, bakterie produkujące kwas mlekowy powodują
hydrolizę wielu składników, uwalniają składniki rozpuszczalne, przechodzą do fazy
ciekłej, dobra po\
ywka dla bakterii. Dawniej u\
ywany do produkcji penicyliny.
Melasa  produkt odpadowy z produkcji cukru, mo\
na otrzymać czysty cukier, ale z powodu obecności
zanieczyszczeń tylko 50% .Słu\
y do otrzymywania brązowego cukru w przemyśle spo\
ywczym. Produkt
odpadowy w przemyśle farmaceutycznym. Aby u\
yć do procesu technologicznego nale\
y zmniejszyć
stę\
enie jonów, mo\
na wytrącać na gorąco lub na jonitach: Cu, Zn.
Przykłady maksymalnej szybkości asymilacji cukrów i oddychania w hodowli P.chryzogenu
Cukier Asymilacja g/l/h Oddychanie mmol O2 l/h
Glukoza 0,71 13,4
Sacharoza 0,46 6,7
Laktoza 0,32 4,9
Laktoza /najsłabiej przyswajany cukier - zysk energetyczny wolniejszy/ wolno przyswajana, bardzo
sprzyja biosyntezie penicyliny. Podło\
e do produkcji penicyliny zawiera glukozę i laktozę. Komórki
grzyba szybko wykorzystują glukozę, szybko rozmna\
ają się uzyskując du\
ą biomasę /czyli najpierw
u\
ywana jest glukoza do przyrostu biomasy/. Po wykorzystaniu glukozy mechanizm represji
katabolicznej ustępuje, zaczyna działać mechanizm indukcji enzymów i przyswajana jest laktoza ze
znacznie mniejszą szybkością.
Represja kataboliczna  blokada enzymów do wykorzystania laktozy, gdy glukoza się skończy, represja
cofa się, następuje indukcja substratowa przyswajania laktozy  przyswajana wolniej od glukozy. W
momencie szybkiego wzrostu zachowane są enzymy niezbędne do syntezy penicyliny.
Melasa  mo\
e być u\
ywana do celów spo\
ywczych, do produkcji cukru brązowego, problemem jest
du\
e stę\
enie soli mineralnych  mogą hamować wzrost bakterii  jony są wytrącane lub usuwane na
jonitach /chodzi o Mn i Fe/.
Kontrolowany niski poziom glukozy  dozowanie glukozy, zniesiona wówczas represja kataboliczna,
komórki rosną wolno, produkują penicylinę represję kataboliczną mo\
na znieść przez podawanie w
11
sposób ograniczony glukozę zniesiona jest represja kataboliczna, komórki rosną wolno, penicylina jest
produkowana.
- Wzrost  2 zale\
ności od temperatury reakcji.
PODZIAA

- psychrofile bezwzględne  10% dro\
d\
e piwowarskie /10�C - 20�C/
- psychrofile względne ok.20�C
najbardziej nas interesują
-mezofile - 24�C najlepsza temperatura do produkcji penicyliny
-termofile względna  ok.50�C  prod. kwasu mlekowego
- termofile bezwzględne  ok. 70�C istnieją bakterie \
yjące w temp. Powy\
ej 100�C, mają inną
strukturę białkową, mo\
na z nich pozyskiwać polimerazę /uzyskuje się dla PCR/ DNA podniesienie
temperatury w reakcji enzymatycznej przyspiesza jej szybkość, ale zwykłe enzymy ulegają denaturacji.
U\
ywanie enzymów termostabilnych odpada problem technologiczny schładzania środków reakcji.
Dro\
d\
e temp. 10�C
Wpływ ph  podręcznik
- kreda
- woda amoniakalna
- jonity
Często metabolity zakwaszają środowisko, dlatego dodaje się substancje, które je neutralizują, np.
kreda, jonity, Mo\
e tak\
e zachodzić alkalizacja środowiska.
Ocena wzrostu.
Pomiar wzrostu: mikrobiologia
- liczenie kolonii  posianie na płytki i liczenie kolonii  nie jest to dobra metoda w biotechnologii
- pomiar po wysuszeniu / nie mo\
e występować zawiesina/ - nie jest to tak\
e dobra metoda i stosowana
dla klarownych podło\
y
- analiza białka / podło\
e nie mo\
e mieć białek/ - ocena wzrostu na podstawie przyrostu białka
- pomiar DNA  pomiar przyrostu DNA, sposób idealny, ale du\
y błąd , bo w komórce jest mało DNA
- pomiar szybkości oddychania /nie mierzymy ilości biomasy, szybkość oddychania zale\
y od wzrostu
biomasy w bioreaktorach bezpośrednio  często stosowana metoda/ szybkość wzrostu zale\
y od
szybkości oddychania
- pomiar O2 doprowadzanego do bioreaktora
- pomiar O2 w powietrzu wylotowym
- bilans O2 w procesie biosyntezy
- wykorzystujemy do oceny dozowania cukru jeśli spada szybkość oddychania, mo\
e to oznaczać
spadek cukru.
- przyrost masy lub liczby komórek, to wzrost
Promieniowce, grzyby mogą wytwarzać agregaty w postaci kłaczków lub kuleczek; proces wzrostu
następuje na końcu strzępki.
Problem temperatury  PRACA Z KOLB
 ciepło odprowadza się szybko, dlatego hodowlę prowadzi
się na termostacie.
Bioreaktory  trzeba odprowadzić ciepło, \
eby utrzymać stałą, odpowiednią do procesu temperaturę.
CECHY DROBNOUSTROJÓW  wa\
ne cechy decydujące o ich przydatności w przemyśle.
- du\
a szybkość przemiany materii
- zdolność przeprowadzenia du\
ej ilości reakcji, co decyduje szerokiej gamie wykonanych produktów
- mo\
liwość dokonywania zmian genetycznych /nadprodukcja metabolitów/
- produkcja metabolitów /w ilości znacznie przewy\
szającej potrzeby własne4 drobnoustrojów
- zdolność przystosowywania się do ró\
nych warunków środowiskowych
Produkty mikrobiologiczne, to: biomasa komórki drobnoustrojów, /dro\
d\
e piekarskie, szczepionki/.
- produkty przemian katabolicznych  etanol, kwas mlekowy
- produkty syntez  aminokwasy, nukleotydy
- produkty specyficzne: antybiotyki, alkaloidy  b. kw. glutaminowego /biotyna/
- produkty biofarmacji: sterydy - .b. kw. mlekowego / witaminy, aminokwasy/
12
- enzymy
Cechy drobnoustrojów przemysłowych są to: hemo-organo-heterotrofy /z
ródło wapnia  związki
org./, z
ródło energii  zw. chemiczne, z
ródło elektronów  zw. organiczne
- stabilność genetyczna i fenotypowa
- fagooporność
- niedu\
e wymagania pokarmowe
- tolerancja na zmiany stę\
enia składników podło\
a
- szybki wzrost i szybkie tworzenie produktów
- wydajność, czystość, łatwość wydzielania produktu
- mała wra\
liwość na zmiany: ph, temperatury
- małe zapotrzebowanie na O2
Aktywność drobnoustrojów zale\
y od uwodnienia środowiska, temperatury, ph, potencjału
oksydacyjno-redukcyjnego, ciśnienia atmosferycznego, napięcia powierzchniowego.
Uwodnienie środowiska dostępność jej dla drobnoustroju zale\
y od EFEKTU OSMOTYCZNEGO
oddziaływania m. cz. wody o substancji. w niej zawartymi i EFEKTU ADSORPCYJNEGO w
odniesieniu do wody zaadsorbowanej na pow. ciał stałych. Dostępność wody charakterystyczna jest, jako
AKTYWNOŚĆ WODNA prę\
ność pary wodnej nad roztworem do pr. pary wodnej nad czystą wodą =
p.p.w. w otoczeniu f. gazowej aktywność wodna = PN/pow / ph nadmiar jonów H+/ OH- zaburza
procesy metaboliczne, jony H+ czy OH-, decydują o stopniu dysocjacji związków zawartych w podło\
u.
Niezdysocjowane formy łatwiej mogą wnikać do komórek i wykonywać działania toksyczne.
Wymagania pokarmowe drobnoustrojów. Podło\
a kompleksowe wody: trudny do określenia skład
jakościowy, ilościowy i zmienność i nieodtwarzalność składu chemicznego surowców kompleksowych
/z
ródła węgla i energii glukoza, maltoza, laktoza, sacharoza, skrobia, melasa, serwatka czy celuloza da
Aspergillus i Fusarium/. Bogatym z
ródłem soli mineralnych jest: melasa buraczana. W procesie
biosyntezy kwasu cytrynowego przy u\
yciu As.niger i nadmiar stę\
enia \
elaza mo\
e być neutralizowany
przez jon Cu 2+ antagonizm jonowy. W przypadku, kiedy niezbędne jest obni\
enie st. niektórych
pierwiastków w podło\
u: uzyskujemy to przez: zastosowanie substancji chelatujących, jonowymieniaczy
lub na drodze wytrącania osadów. W składzie podło\
y wa\
ną rolę odgrywają PREKURSORY I
SUBSTRATY bezpośrednio zu\
ywane do wytworzenia produktów, bez uprzednich przekształceń w
metabolizmie drobnoustrojów: fenylooctan penicylina 6: szybka i wydajna produkcja, biosynteza
ukierunkowana na jeden z kilku mo\
liwych produktów. Do podło\
a mo\
na dodać środki osłaniające:
PENICYLINY, TETRACYKLINY, ZW.NITROFURANOWE /przed zaka\
eniem obcą mikroflorą/.
Typ wzrostu  > podręcznik
13
 14
 15
 16
Wzrost w pop wyra\
amy w oparciu o pomiar liczby komórek /kom./cm3/h/ masy i objętości /stę\
. masy
kom. 9/dm3/h/ odnosi się do pojemności komórki. Wzrost populacji wzrost komórek oraz ich
rozmna\
anie.
Wzrost nieograniczony  nie zale\
y od stę\
enia substratów .wzrost nie jest limitowany. Wzrost przebiega
z szybkością maksymalną stałą.
Wzrost ograniczony limitowany tak jak w przypadku krzywej Michaelita  Mentena, szybko maleje
wraz z ubytkiem substratu.
- ograniczony wzrost ST. toksycznym metabolitu lub substratu np. węglowodany, zw. steroidowe
Częstym czynnikiem hamującym wzrost jest nagromadzenie toksyczności produktu metabolizmu. Kp
stała hamowania.
dx/dt  szybkość objętościowa. W miarę wzrostu drobnoustrojów wydzielają toksyczne substancje. Je\
eli
substrat jest toksyczny, to nale\
y połączyć 2 wzory. Ks stała półnasycenia, czyli stę\
enia substancji
przy którym �= � �max
17
Proces ciągły  stała szybkość wzrostu  stałe ST. biomasy.
Zale\
ność między wzrostem a stę\
eniem produktu  podręcznik
18
 19
 20
Kataboliczne procesy degradacyjne /rysunek w ksią\
ce/ dostarczające energii są z
ródłem
metabolizmów pośrednich zu\
ywanych w procesie biosyntezy /oddychanie tlenowe  dominuje w
przemyśle. Fermentacja beztlenowa te\
jest wykonywana. Inne nie są stosowane. Efekt energetyczny
oddychania: GLIKOLIZA cukier dostaje resety fosforanowe, póz
niej kolejne 2 z ATP. Substraty
niezbędne w oddychaniu tlenowym /fosforylacja substratowa/
- galaktoza, glikogen, glukoza, mannoza, fruktoza
- ATP /2/ 2 cząsteczki ATP  zysk energetyczny /2 wło\
one, 4 otrzymane 4-2=2/
- pirogronian /2 cząsteczki/ produkt hydrolizy 2-trion
fosfoenolopirogronian, 4 ATP
�!
Jest to bilans materiałowy metabolizmu glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych. Saccharomyces
cerevisiae
W biotechnologii dominują warunki tlenowe.
Inne mo\
liwości degradacji cukrów brak fruktozy
- szlak heksozomonofosforan /pentazowy/ - do reakcji wchodzi glukozo-6-fosfor. i powstaje
zredukowany fosforan NADF- wykorzystywany w reakcjach syntez komórkowych /dostawa energii
do r. enzymatycznych/. Mamy mo\
liwość asymilacji pentoz szlak wa\
ny dla komórek. Powstały
związek 3-C fosforyzowany, mo\
e być dalej utleniany w cyklu Krebsa /3-tny węglowy/ i do szlaku gdzie
są triozy. Oba szlaki mogą funkcjonować w 1 organizmie, w ró\
nym natę\
eniu. Gdy komórki wolniej
rosną  dominuje glikoliza i szlak Krebsa.
Procesy degradacyjne a rodzaje syntez
heksoza nukleotydy, histeryka
�!
fosforan dihydrokryacetonu glicerol
fosfo-endo pirogronson aminokwasy, acetylo-CoA kwasy tłuszczowe B.WAśNE
�!
szczawiooctan jabłczan
21
Reakcje anaplerotyczne  wspomagające, dzięki nim szlak Krebsa mo\
e funkcjonować
dostarczanie substr. np. regeneracja szczawiooctanu do cyklu Krebsa, dostarczenie jabłczanu!
cykl kwasu glioksylowego, wspomaga cykl Krebsa pozwala na włączenie jeszcze jednej cząsteczki
acetylo-CoA  włączenie dodatkowo kolejnej grupy acetylo-Co-A.
Koordynacja metabolizmu.
1. Równowaga między procesami dostarczającymi i zu\
ywającymi metabolity pośrednie np. Acetylo-
Co-A
2. Równowaga między reakcjami katabolizmu a sumą potrzeb energetycznych komórki.
Mechanizmy regulacyjne koordynacje odbywają się na ró\
nych poziomach.
1. Regulacja ilości enzymów
2. Regulacja aktywności enzymów
3. Przedziałowość komórki  produkty nie ulegają rozproszeniu, pozostają --------------------i mogą być
wykorzystywane do większej precyzyjnej kontroli syntezy /np. gdy mamy walkę o te same
metabolity/
4. Transport komórek  przez błony wewnątrz i zewnątrz komórkowe
5. Sprzę\
enie energetyczne
Regulacja ilości enzymów
1. Na poziomie transkrypcji
- ogólnometaboliczne /nadrzędne/
- ppGpp  aktywacja polimerazy RNA
-represja katabolizmu
- cykliczny AMP
- zmiana powinowactwa polimerazy RNA
- m. swoiste wybiórcze: indukcja substratowa,
2. na etapie translacji synteza białek na rybosomach
3. proteoliza na etapie komórki
Mechanizm represji katabolicznej :
- blokowanie przyswajania  w obecności & (?) następuje blokada przyswajania laktozy  synteza
antybiotyków �- laktanowych  penicyliny /represja produktem końcowym- jego nadmiar blokuje
syntezy/ zahamowana:
Indukcja substratowa laktoza
Regulacja aktywności enzymów
- aktywacja
- inhibicja
- deaktywacja
- enzymy allosteryczne
- kowalencyjna modyfikacja
- kompleksy wieloenzymowe
Przykłady inhibicji:
- inhibicja przez produkt /wszystkie w nadmiarze/
- inhibicja /1 w nadmiarze/
- inhibicja ka\
dy z kolejnych  jedna reakcja mo\
e być katalizowana przez kilka enzymów. Ka\
dy
z produktów końcowych reguluje aktywność swojego białka, dlatego wyłącza tylko swoją część procesu
/występowanie izoenzymów - tego typu stany nie są wykorzystywane /
Sprzę\
enie energetyczne
2 dysymilacji 1 mola /180g/ glukozy
38 moli ATP  w war. H
2 mole ATP  w wart. Bez H
1 mol ATP potrzebny jest do syntezy ok. 10g biomasy
22
 Z asymin. 1 mola glukozy
77 g biomasy glukozy
3,6 g biomasy beztlenowej
Efekt Pasteura
Ingeruje: glikolizę, cykl Krebsa, łańcuch oddechowy i fosforylację oksydacyjną.
W obecności O2 silnie hamowana jest glikoliza w warunkach beztlenowych następuje nasilenie glikolizy.
Efektorami są: ATP, ADP, AMP, NAD, NADH
Regulacji podlegają:
fosfofruktokineaza, aldolaza izocytrynianowa, kinaza pirogronianowa, dehydrogenaza pirogronianowa,
dehydrogenaza i syntetaza w c. Krebsa  hamowane są przez ATP i cytrynian, NADH+
Potencjał utleniająco- redukujący / NAD/ NADH/
Relacje ilościowe: NAD/NADH
Zale\
ą od bilansu przemian katabolicznych i anabolicznych
I wartości utleniania
NAD  stymulacja reakcji katabolicznych
NADH  hamuje reakcje kataboliczne, sprzyja syntezie ATP
NADPH  podstawowy czynnik regulujący zu\
ywany w procesie biosyntezy
NADPH+NAD+"!NADP+ +NADH
Efekt Crabtree (represja glukozowa oddychania)
W tlenowych hodowlach drobnoustrojów obserwuje się hamowanie oddychania komórkowego w
wartościach wzrastającego stę\
enia glukozy ponad 1-2 g/l
Indukowane są enzymy glikolizy.
Blokowane są przemiany cyklu Krebsa i łańcuch oddychania.
Wspólnie produkowany metabolizm dro\
d\
y pojawia się etanol.
W efekcie mamy do czynienia z tlenową fermentacją alkoholową.
Potencjał energetyczny komórki:
Kiedy równowaga między katabolizmem a anabolizmem występuje E.C. ma wartość 0,75. W tych
warunkach komórka ma więcej ATP ni\
AMP. Jeśli komórka jest zbyt uboga energetycznie, wartość E.C.
jest mniejsza, spada szybkość anabolizmu. Wzrasta szybkość katabolizmu E.C.  wraca do stanu
równowagi. Kiedy E.C. większy jest  katabolizm spada, anabolizm wzrasta.
TRANSPORT BIAA
EK PRZEZ BA
ONY
Pozakomórkowe białka są produktami na rybosomach i wydzielane do płynu pozakomórkowego np.
enzymy /często chcielibyśmy by pewne peptydy były wydzielane do podło\
a/. Pozostałe białka pozostają
w komórce. Biofarmaceutyki, są to białka, które chcemy \
eby były wydzielone do podło\
a przez bakterię.
Rybosomy są umiejscowione przy błonie komórkowej, tu zachodzi synteza białek, białka transportowane
na zewnątrz mają segment hydrofilowy i hydrofobowy  ten odcinek jest niepotrzebny i odcinamy w
czasie transportu na zewnątrz.
Enzymy o strukturze IV rzędu  enzymy regulatorowe, a białka je budujące to białka allosteryczne i
mo\
na sterować ich aktywnością, mają miejsce do którego przyłącza się substancje, miejsce kataboliczne,
mogą hamować reakcje.
Wiele czynników mo\
e regulować przebieg reakcji
Reakcje allosteryczne mogą być regulowane przez produkt końcowy szlaku np. ATP, AMP, zewnętrzne
inhibitory. W miarę ę! stę\
enia substratu do tego enzymu mogą przyłączać się jego kolejne cząsteczki
zwiększając jego aktywność.
Segment hydrofilowy  znajduje się na zewnątrz błony, a hydrofobowy wchodzi w środek błony i gdy
du\
a część łańcucha jest wchłonięta przez komórkę, następuje cięcie.
Struktura III i IV rzędowa białek
Białka łączą się ze sobą  struktura IV rzędowa  są one odpowiedzialne za syntezę wielu produktów. SA
one podatne na ró\
ne procesy regulacyjne.
23
Enzymy allosteryczne regulowane przez proces końcowy szlaku, np. zahamowanie przez ATP i inne
substancje mogą te enzymy być regulowane tak\
e przez substrat przyłączenie kolejnych cząsteczek ę!
aktywności enzymu.
Ingerencja mutacja punktowa w DNA w obrębie genów strukturalnych /zmiany w strukturze -
mutacje w miejscach regulatorowych zniesienie regulacji procesów.
- mutacje związane z syntezą białek na rybosomach
- zmiany w regulacji szlaków metabolicznych proces związany ze sprzę\
eniem zwrotnym mutacje
powodują zaburzenie tego procesu zmiana w budowie miejsca allosterycznego w enzymie, gdzie
przyłącza się produkt, \
eby go zahamować du\
a nadprodukcja metabolitu. Idealnie jest, gdy metabolit
wydalany jest z komórki /st. toksyczne/
- zmiany na etapie transportu do komórki .
PERMALIZACJA  proces, który ma na celu ę! przechodzenia substratów przez błonę np. przez dodatek
detergentu, częściowo autoliza.
Szczep produkcyjny np. liofilizat długoterminowe przechowywanie
24
 25
 26
 27
Ulepszyć szczep dla technologa, to zakłócenie fizjologii metabolizmu np. ingerencja w genom
drobnoustr. i wytworzenie konkretnego produktu; zmiana 1 nukleotydu mutacja punktowa mutacja
w obrębie genów regulator.; struktury białkowej zniesienie regulacji procesów, zmiany w strukturze.
Enzym mo\
e być produkowany niezale\
nie od warunków środowiskowych stałe konstytutywne
produkty białkowe
- mutacje zmiany strukturalne na rybosomach  produkt końcowy szlaku metabolicznego nie hamuje
na zasadzie sprzę\
enia zwrotnego reakcji enzymu, utraci powinowactwo do produkcji końcowego
szlaku /enzym/ enzym metaboliczny jest nieregulowany.
Mutacje samorzutne  jedna mutacja na 10-7  10-5 procesów komórkowych to jest mało
28
Mo\
na zwiększyć do 10-4 do 10-1
Słu\
ą do tego czynniki mutagenne
- promieniowanie UV
- hydroksyloamina /niechętnie stos. tax./
- n-methylo-N  nitro  N - nitrozoguanidyna
UV  promieniowanie dalsze  powoduje szereg ró\
norodnych mutacji, łatwo dostępnych. Wa\
ny jest
zakres promieniowania ok. 250-260�m największa częstość mutacji /przy tej długości fali/.
Równie\
promieniowanie bli\
sze, o mniejszej częstotliwości te\
jest wykorzystywane. A
atwo jest
regulować dawkę: odległość lampy i czas naświetlania. Metoda jest odtwarzalna, łatwo powtórzyć
warunki.
Zabezpieczenie przed promieniowaniem: szyba szklana. Przygotowuje się zawiesinę komórek w
odpowiednim roztworze: H2O destyl.,fizjol. 10-20 ml na płytce Petriego, na mieszadełku
magnetycznym do płytki. Dipol aby były ciągłe miedziane, by nie ostawały się na dnie by dostęp
czynnika był taki sam. Cienka warstwa H2O pozwala na dotarcie promieni do wszystkich komórek.
Istnieją mechanizmy naprawcze odnajdujące zmienione miejsca w DNA i naprawiają przez wycięcie
błędnego miejsca i komórka jest w stanie prawidłowo dosyntezować wycięty nukleotyd dzięki drugiej
nici DNA. Po promieniowaniu uszkodzenie wymaga światła do naprawy fotoreaktywacja.
Na kilka godzin przed analizą trzeba wstawić do ciemnego pomieszczenia /obrona przed
fotoreaktywacją/.
Istnieją mechanizmy naprawcze, które potrafią przywrócić całkowicie lub które naprawiają z błędami
wtórne zmiany są często bardzo trwałe, a czasem nawet wydajność określonego produktu.
Bezpośrednio po mutacji nie nale\
y szukać mutantów, zawiesina pozostawia na kilkanaście godzin,
zajście zmian wtórnych i dopiero selekcja mutantów.
Nitrozoguanidyna /w widełkach nić pojedyncza, poza nimi podwójna/ wywołuje mutacje punktowe,
częstość występowania mutacji jest inna w widełkach replikacji i poza nimi w widełkach działa 200x
aktywniej, znane są mapy genetyczne drobnoustrojów przemysłowych.
W DNA /w jednym chromosomie znajdują się  pęczki genów odpowiedzialne za jedną cechę/.
Aby wywołać mutację w określonym miejscu nale\
y działać nitrozoguanidyną, gdy w tym właśnie
miejscu będą widełki replikacyjne.
Je\
eli wiemy, \
e nitroguanidyna działa w widełkach, trzeba nią podziałać, gdy proces replikacyjny
dojdzie do tego genu.
Aby utrafić w widełki nale\
y komórki wprowadzić w tę samą fazę głodzenie aby wszystkie
komórki były w tym samym miejscu cyklu komórkowego. Z normalnych warunków kom. odwirowujemy
od podło\
a i następuje tylko dokończenie zaczętego procesu replikacyjnego; \
aden nowy proces się nie
zaczyna. Komórki są w 1 fazie spoczynkowej; gdy je wprowadzić na podło\
e, to wszystkie zaczną
replikację w jednym czasie.
2x
2x
2x
0 t
Wzrasta dwukrotnie liczba komórek / to trwa krótko/, ale po pewnym czasie komórki prowadzą procesy
metaboliczne. /Komórki rozmna\
ają się mniej regularnie, zanika początkowy proces synchronizacji/.
Mutagenem nale\
y działać na początku, w określonym czasie.
Gdy komórki traktujemy zbyt długo i zbyt ę! stę\
. mutagenem, wtedy du\
o mutacji spowoduje śmierć
komórki lub spowoduje zmiany niekorzystne w komórce. Nieliczne mutanty mają zwiększoną wydajność.
Mutantów nie nale\
y szukać od razu po mutacji. Najpierw grzybnię nale\
y pociąć, póz
niej namno\
yć i
doprowadzić do powstania pojedynczych komórek, w których znajdują się. Pozostałe mutacje
wykorzystujemy  tu proces sporulacji. U promieniowców występuje grzybnia, zatem mutacja nie zajdzie
we wszystkich komórkach /ta sama mutacja/. Musimy namno\
yć pojedyncze komórki. Prowadzimy
29
hodowlę, namno\
ymy, dostajemy zarodniki mają pojedynczy materiał genetyczny i wtedy
prowadzimy selekcję. Do mutacji tez lepiej u\
yć zarodniki ę! dawki i stę\
. najlepiej z UV.
Mutageny alkilujące:
Etyenoimina
Metanosulfonian metylu
Dimetyloguanidyna
Selekcja mutantów
Metoda słupków agarowych:
Mutageneza�!
�!
Posiew na płytki
*wycinanie słupków agarowych
Wstawianie do H2O /24h  7 dni/ inkubacja
Po okresie inkubacji słupki agarowe /grzyby dłu\
ej/ .
*Wysiew na płyty z podło\
em z organizmem testowym. Ró\
na wielkość  zahamowanie wzrostu/ strefy
wzrostu/ organizmów testowych. Największa strefa wybór kolonii do dalszej pracy, bo produkują
najwięcej antybiotyku.
*Je\
eli auksotrofia to wielkość wzrostu świadczy o lepszej wydajności kolonii /produkcja witamin, a-
kwasów/.
AUKSOTROFY  wymagają organ. y
ródeł C, N, mogą potrzebować czynników wzrostu witamin.
W poszukiwaniu mutantów auksotrofów:
�!
Zawiesina komutacyjna
�!
Dodatek penicyliny, (\
eby zahamować wzrost komórek) hodowla w podło\
u min. /glukoza- jako
jedyny zw. org. + soki min./
�!
wirowanie i mieszanie komórek w wodzie osmot./H2O destyl./
�!
Hodowla w podło\
u wzbogaconym wzrost auksotrofów
Czasami cykl trzeba powtórzyć, bo nie zaszedł w 100%. Zawiesinę komórek ró\
nych /auksotr/ - nale\
y
wyizolować.
Auksotrofy nale\
y wyizolować: komórki z zawiesiny nanosi się na płytki, komórki rosną w podło\
u
bogatym, rosną wszystkie komórki, przenosimy je na nowej płytce o podło\
u minimalnym, gdy tam jakaś
kolonia nie wyrośnie, to podejrzewamy, \
e jest to kolonia auksotroficzna, aby potwierdzić robimy odciski
tym samym stemplem na podło\
u bogatym tam musi się pojawić. Porównujemy z pierwotna płytką.
*Mutanty
- regulatorowe np. u\
ywane do produkcji lizyny. Mutant o zmienionym miejscu regul. /allosterycznym/ w
zakresie jego powinowactwa do lizyny.
Mo\
emy u\
yć antymetabolitu /np.z 1 at S/ S - /2- aminoetyl/ L-cysteina i zastępuje tu funkcję regulatora,
ale nie zostaje u\
yta do syntezy białka; zahamowany zostaje 1 /enzym/ syntezy lizyny. Po mutacji
zawiesinę komórek wysiewamy na specjalne płytki Petriego.
Je\
eli nie będzie mutantów regul. /mierniki stę\
enia na lizynę/, to czym ę! stę\
enie aminoetylocysteiny
tym mniej kolonii.
Je\
eli pojawią się mutanty regul. , to pojawią się normalne du\
e kolonie, to z tego obszaru izolujemy te
kolonie.
W wyniku mutagenezy szczepy są ulepszane. W latach 70-tych powstała mo\
liwość krzy\
owania
szczepów REKOMBINACJA MITOTYCZNA. Znaleziono sposób, aby w warunkach laboratoryjnych
dochodziło częściej do rekombinacji METODA FUZJI PROTOPLASTÓW.
30
Krzy\
owanie szczepów
Aby poprawić ró\
ne szczepy, tracą cechy biologiczne np. sporulację. Krzy\
ując 2 szczepy o 2 cechach
pozytywnych. Obok wymiany genetycznej mo\
e występować rekombinacja. Komórki somatyczne mogą
ulegać fuzji bez udziału procesu płciowego. Jeśli komórki rodzicielskie są komórkami haploidalnymi
dochodzi do łączenia się jąder i powstają komórki diploidalne. Diploid rozpada się z powrotem na 2
haploidy typu dzikiego, ale mo\
e zajść wymiana materiału genetycznego. Rekombinanty otrzymują
materiał od obu komórek wyjściowych.
Cały ten szlak odbywa się w komórkach wegetatywnych pomimo, \
e nie ma rozmna\
ania płciowego
/mejozy/, mo\
e zajść rekombinacja.
Czynniki mutagenne sprzyjają zmianom genetycznym np. kofeina gł. do mitotycznego CROSSING
OVER.
Protoplasty  otrzymuje się działając na komórki enzymami, które rozkładają ścianę komórkową.
Enzymy te, to m.in. LIZOZYM doskonale hydrolizuje ścian komórek bakterii.
LIZOZYM  narzędzie w laboratorium, hydrolizując ścianę bakterii G, musimy dodatkowo działać
detergentem.
Grzyby wytwarzają wiele enzymów proteolitycznych, celulitycznych wykorzystywanych. do
protoplastyzacji ścian bakterii. Inne z
ródła u\
ywane do hydrolizy ścian komórek, to:
Helix pomatia sok \
ołądkowy ślimaka. Rzadko do protoplastyzacji u\
ywa się samych enzymów.
Raczej u\
ywamy mieszanin ró\
nych enzymów.
Grzyby rodz. Trihoderma (?) enzym.
Częściej u\
ywa się kompleksy enzymów proteolitycznych
*Protoplastyzacja  w środowisku musi być zapewnione odpowiednie ciśnienie atmosferyczne, w jakim
są zawieszone komórki; do podło\
a dodano sacharozę, sorbitol, mannitol: 0,8; 1; 1,2 mola ; sole
mineralne: MgSO4 /stę\
.--//--/ musi być zapewnione odpowiednie środowisko, \
eby ściana komórkowa
nie uległa rozerwaniu.
Po kilkudziesięciu minutach obserwujemy powstanie sferoplasty, póz
niej protoplasty /idealny pęcherzyk/.
Jeśli pęcherzyk umieścimy w wodzie  ulega on rozerwaniu w związku ze spadkiem ciśnienia
osmotycznego.
Między 2 szkiełka dodajemy H2O destylowaną i protoplasta ulega rozerwaniu dowód.
Komórki wegetatywne nie tworzą teraz skupisk, mamy zawiesinę protoplastów; mo\
emy mieszać nawet
protoplasty 2 ró\
nych szczepów, gatunków bardzo odległych.
*Mo\
emy łączyć komórki o bardzo odległym materiale, w wyniku takich krzy\
ówek mo\
emy m.in.
otrzymać antybiotyk, który naturalnie w przyrodzie nie występuje.
Mo\
emy łączyć komórki nale\
ące do 3 ró\
nych gatunków. Mo\
na /w przypadku protoplastów?
Krzy\
ować gatunki nale\
ące do ró\
nych rodzajów. Protoplasty chętnie tworzą konglomeraty /tylko
przylegają/.
połączenie komórek, nie chcą się łączyć
PEG Glikol polietylenowy o odpowiedniej masie cząsteczek 4-5; 6 tys. Daltonów dodajemy do
środowiska i przyleganie protoplastów zachodzi na większych powierzchniach, błony integrują ze sobą,
przenikają, wytwarzają 1 wspólny protoplast.
Wówczas mo\
na spowodować fuzję jąder i rekombinację. Dalej wyselektowujemy krzy\
ówki /hybrydy/
regeneracja ściany komórkowej  utworzenie pełnowartościowej komórki w podło\
ach wzbogaconych
/specjalne podło\
e dodatek a-kwasów, witamin/ wśród zregenerowanych komórek szuka się
krzy\
ówek o korzystnych cechach biologicznych.
Np. Acremonium chrysogenes wytwarzający o 40% więcej cefalosporyny. In\
ynieria genetyczna 
rozwój lata 70-90-te SYNONIM:
Technologia rekombinowanego DNA
31
 -Enzymy  ligazy  przeczytać
- Wektory  przenośniki DNA
- Markery
Wektory ekspresyjne  pozwalają na uzyskanie wysokiej ekspresji białka
Wektor ekspresyjny  wartości ogólne
-tak mały, jak to mo\
liwe
- autonomiczna replikacja /najczęściej/ bez względu na replikację gospodarza
- łatwe detekcje obecności w komórkach
- stabilność strukturalna /łatwo zachodzą delecje w komórkach zsyntezowanych/
- stabilność segregacyjna /aby do ka\
dej komórki trafiały plazmidy/
-regulacja liczby kopii /nadmiar mo\
e doprowadzić do katabolizmu komórkowego/ czasem występuje 1
dodatkowa kopia enzymu, aby zwiększyć wydajność komórki o 25%
-wydajna ekspresja sklonowanego genu
- ochrona produktu przed proteolizą  je\
eli komórka ma nadmiar białka, wówczas enzymy
proteolityczne tną białko /odzysk a-kwasów/ oraz DNA. Plazmid musi być tak skonstruowany, by
zsyntezowane białko nie było traktowane jak obce. Do obcego genu dodaje się fragment genu pobranego
od przyszłego gospodarza gen hybrydowy. Zabezpieczamy się przed proteolizą białka. Po procesie
mamy białko z dodatkiem fragmentu, więc metodą enzymatyczną tniemy to białko fuzyjnie.
Białka fuzyjne do obcego genu dodaje się fragment genu pobranego od przyszłego gospodarza. Gen
jest hybrydowy z nieznaną dla drobnoustroju informacją genetyczną. W ten sposób zabezpiecza się przed
proteolizą obcego białka przez gospodarza. Problem mamy fragment niechcianego białka, które trzeba
odciąć za pomocą enzymów proteolitycznych.
Pierwotne z
ródło bakterie, grzyby, komórka ludzka.
Geny:
1.y
ródłem genom dawcy, izolujemy, tniemy enzymami restrykcyjnymi DNA i szukamy potrzebnego
nam fragmentu.
2.Znalezienie m-RNA w komórkach które są wyspecjalizowane w zakresie syntezy konkretnego białka,
np. w trzustce produkcja insuliny, z tych komórek pozyskujemy m-RNA. M-RNA słu\
y jako matryca do
syntezy DNA za pomocą odwrotnej transkryptazy / lepsza metoda/
3.Precyzyjne uwolnienie genu w genomie biorcy w sposób celowany głównie u bakterii za pomocą PCR
/polimerazowa reakcja łańcuchowa/ metoda bardzo celowana  łatwiej wykonać w komórkach bakterii
ni\
ludzkich. Musimy znać sekwencje nukleotydów, głównie na początku i na końcu odcinka
syntezowanego DNA.
4.Synteza chemiczna  trzeba znać kolejność nukleotydów w genie, zupełnie zautomatyzowana. Metoda
bardzo lubiana. Wykorzystywana zwłaszcza do produkcji insuliny. Synteza chemiczna 2 genów do
produkcji łańcucha A i B insuliny. śeby zsyntetyzować  trzeba znać kolejność nukleotydów w genie.
Znamy kolejność a-kwasów w insulinie na tej podstawie uzyskuje się sekwencję nukleotydów.
Obecnie metoda tania i zautomatyzowana.
Bakterie Grzyby
E.Coli S.Cerevisiae
B.subtilis Hansenule polymorpha
Brevibacterium Pichia pastoris
Clostridium Kluyveromyces lactis
Lactobacillus A.niger
Pseudomonas A.nidulens
Streptomyces P.Chrysogenum
*Wektory do manipulacji genetycznych u drobnoustrojów: plazmidy, fagi, kosmidy
*Wektory do manipulacji genetycznych u wy\
szych Eukaryota
Dla roślin i kultur roślinnych in vitro:
- poch. wirusów roślinnych, np.: wirusa mozaiki kalafiora
- bakterie z rodziny Agrobacterium  risogenes  korzenie transgeniczne, tubefaciens  powodują raka
drzew.
32
Dla zwierząt i kultur komórek zwierzęcych in vitro:
- pochodzenie wirusów np. SV 4O, papilioma, wirus krowianki, retrowirusy, adenowirusy
Synteza ekspresji : Zalety: Wady:
- Plazmidy  bakterie - du\
a wydajność - produkcja białek wewn. komórek
E.Coli - łatwość izolacji nieaktywnych biologicznie
-tania produkcja - ogran. systemy sekrecyjne
-brak modyfikacji potranslacyjnych
- toksyny bakterii
-Plazmidy dro\
d\
y - mo\
liwość glikolizylacji białek - ni\
sza wydajność ni\
w
- produkt mo\
e być poza bakterii
komórką, brak toksyn - nie zawsze właściwa
modyfikacja potranslacyjna
- Wirusy - du\
a wydajność - trudności techniczne
- właściwa modyfikacja - mała liczba opracowanych
systemów
Wirus krowianki  dawca fragmentu DNA Wirus chorobotwórczy DNA
- infekujemy je tym wirusem
- obca sekwencja atomowa jest sekwencja wirusa krowianki
- komórka zwierzęca
Następuje wymiana homologicznie przypadkowa, niezbyt często, ale mo\
na wyselekcjonować wirusy
zrekombinowane.
Zrekombinowany wirus krowianki do produkcji szczepionek.
Grupy biofarmaceutyków o budowie polipeptydowej /białkowej/
- hormony
- hematopedyczne czynniki wzrostu
- cytokiny:
interferony
interleukiny
- czynniki krzepliwości krwi
- leki trombolityczne i p/zakrzepowe
- enzymy terapeutyczne
- szczepionki
- przeciwciała monoklonalne
1.Erytropoetyna du\
y zysk w sprzeda\
y  dominuje na rynku farmaceutycznym
Interferony
Insuliny
Przeciwciała monoklinalne
Insuliny: /Lispro- zamiana Pro na Lys
- Humulin /E.Coli/
-Novalin / S. Cerevisiae/
- Humalog /E.Coli/
Potranslacyjna modyfikacja preproinsuliny
Modyfikacja cząsteczek mo\
e zwiększyć lub zmniejszyć jej działanie.
Preproinsulina odłączenie sekwencji sygnałowej, proinsulina odłączenie fragmentu C, insulina /2
łańcuchy A i B/
33
21r. odkrycie insuliny /wydzielenie z trzustki zwierząt
22r. pierwsze podanie insuliny
23r. Eli Lilly  produkcja insuliny świńskiej
23r. utworz. Noro, Nordisk - insulin laboratoryjnych
63r. ChRL  synteza chemiczna insuliny ludzkiej
70-te  Eli Lilly finansuje projekt biotechnologiczny insuliny
78r. Genentech  biosynteza ludzkiej insuliny u DNA w E.Coli
87r. Insulina DNA z dro\
d\
y  Noro
2000r. Gensulin  polska ludzka insulina DNA IBA/ Bio.
Biosynteza insuliny:
*Syntetyny genetyczne zmodyfikowanej preinsuliny:
Fragment genu ludzkiego dysmutazy ponadtlenkowej zamiast oryginalnej sekwencji sygnałowej
Dipeptyd lys-arg zamiast peptydu C (15 reszt aminokwasowych)
System ekspresji
E.Coli  plazmidowy wektor ekspresyjny z unikalnym promotorem
Biosynteza:
bioreaktory 10L 150L 1500L
Produkt biosyntezy
- nieaktywne b. fuzyjne, w postaci ciał inkluzyjnych w komórkach
Proces izolacyjny i przetrwania
- liza i dezintegracja komórek  odwirowanie ciał inkluzyjnych
- rozpuszczenie ciał inkluzyjnych w środowisku alkalicznym  obróbka enzymatyczna za pomocą
karboksypeptydazy /białka bez zbędnych fragmentów/
In\
ynieria genetyczna w biotechnologii antybiotykowej.
1.Klonowanie genów regulatorowych
2.Ustalenie wąskiego  gardła w szlaku biosyntezy i klonowanie dodatkowej kopii genu produkującego
lizyn tego etapu np. szlak do biosyntezy cefalosparyny
3.Izolowanie genu
4.Klonowanie genu kodującego dodatkowy specyficzny enzym, umo\
liwiający wytworzenie antybiotyku
zmodyfikowanego
Amykacyna  półsyntetyczna, zmodyfikowana kanamycyna A /nale\
y do aminoglikozydów/,
produkowana przez S. Kanamyceticus /Streptomyces kan./. Aby uniknąć podstawień enzymatycznych,
które unieaktywniają antybiotyki i podstawiają du\
ą gr. Steryczną  gr.kw. 4  amino  2-
hydroksymasłowy. Bakterie z rodziny Bacillus mają enzym, który przyłącza taką resztę  naturalna
biosynteza. Wystarczy 1 etap syntezy  etap mikrobiologiczny.
Do producenta penicyliny / do komórki P.chryzogenum/ wprowadzamy dodatkowe geny odpowiedzialne
za przekształcenie penicyliny w cefalosporyny.
Penicylinom chryzogenum mo\
e produkować struktury cefalosporynowe w organizmie wytwarzającym
penicyliny.
Klasyczna A i nowa B droga syntezy witaminy C
glukoza D-sorbitol L-sorboza
Ervinia kw. 2-okso-L-
herbicola (B) glukonowy
korynebacterium
kw. 2,5-diokso- kw.
D-glukuronowy askorbinowy
34
E herbicola /gat. Utlen.
 bakteria występująca na owocach np. jabłkach
D  glukozę  a produkt jest redukowany przez Corynebacterium  do kwasu 2-akso-glukonowego.
Bioprocesy
Procesy fermentacyjne:
Komórki Enzymy pozakomórkowe
- szybko rosnące /enzymy/ - dekstran  enzym dekstranosacharoza
- limitacja wzrostu / karboksypeptydazy/ hydroliza sacharozy + synteza
- nierosnące /biotransformacja dekstranu
steroidów/
�! �!
komórki enzymy
- w zawiesinie /biotransf. Steroidów/ - rozpuszcz. /hydroliza skrobii/
- immobilizowanie (unieruchamianie) /kw.L-asparagin/ - immobilizowanie
mylazy penicylinowe
produktem jest kwas
6- aminopenicylinowy
Immobilizacja  unieruchamianie:
- zjawisko powszechne w przyrodzie
- stare technologie drobnoustrojowe /zło\
a zraszane (ścieki) i produkcja octu
- unieruchamianie enzymów /30 lat nowych technik i wdro\
eń przemysłowych
- unieruchamianie komórek drobnoustrojów /20 lat nowych zastosowań/
- unieruchamianie komórek zwierzęcych /20 lat wdro\
eń nowych technologii
- unieruchamianie komórek roślinnych /15lat bez sukcesów przemysłowych/ - produkt zostaje w
komórce, dlatego wielokrotne wykorzystanie komórek unieruchomionych jest niemo\
liwe.
Biokatalizatory immobilizowane
Enzymy, komórki , organelle występują w stanie pozwalającym na ich wielokrotne u\
ycie.
- związane z mechanicznym nośnikiem
- związane z makromolekularnym nośnikiem rozpuszczalnym
- zatrzymane/zawracane w / do określonej przestrzeni bioreaktora
- sieciowane chemiczne
- pozostające podło\
e /np. na podło\
u komórkowym
- komórki tworzące agregaty  kuleczki
Sposoby immobilizacji enzymów /komórek/
Część I: na powierzchni /np.aldehyd glutarowy, dianina/
1.Bez mechanicznego nośnika
- sieciowanie odczynnikiem dwufunkcyjnym
- flokulacja polielektrolitami u niektórych zachodzi samorzutnie np. dro\
d\
e piekarskie /kłaczkujące/.
Polielektrolity wyzwalają wytworzenie kłaczków.
- samoagregacja komórek
2.Na powierzchni nośnika
- absorpcja /adhezja na drewnie, celulozie, Sephadex-ie, jonitach, krzemionce&
- wiązania kowalencyjne np. peptydowe, estrowe, węgiel-węgiel, węgiel  azot przy pomocy dzianin, kw.
dikarboksylowych bromocyjanu, izomocznika /nośnik + odczynnik wią\
ący
Część II: wewnątrz nośnika
3.Wewnątrz nośnika  matrycy.
- w \
elu alginianowym, karagenowym, kolagenowym, pAA, polistyrenowym. Alginian \
eluje, gdy wśród
są jony dwuwartościowe
35
- w matrycach ceramicznych /kom. zwierzęce/ tzw. świece
- we włóknach np. nylonowych, kolodionowych i kapsułkowanie /popłukiwanie włóknami  kolodion/
Alginian:
- \
eluje, gdy w środowisku są jony dwuwartościowe, na wolne gr.OH
- otrzymywany z wodorostów morskich
- te\
u\
ywany w przemyśle spo\
ywczym
- najczęściej u\
ywamy Ca2+ do jego \
elowania
4.Z u\
yciem membran półrozpuszczalnych
- w komórkach naturalnych np. erytrocytach /w środowisku hipotonicznym/
- w komórkach sztucznych np. liposomach /mikro/ kapsułkach wykonanych, kolodionowych
- membrany płaskie lub rurki /wę\
yki np. nylonowe, silikonowe, celulozowe/
*Białko mo\
na zamknąć w erytrocytach i nie daje odczynu immunologicznego.
Zalety biokatalizatorów immobilizowanych:
- wzrasta stabilność
- wielokrotne u\
ycie lub procesy ciągłe
- wysokie stę\
enie biokatalizatora
- wy\
sza produktywność bioreaktora i zredukowana jego pojemność
- lepsza kontrola procesu
- często łatwiejsza technologia
- wy\
sza wydajność i czystość produktu
- mniejsze zu\
ycie surowców i materiałów
- redukcja ścieków i odpadów
- mniejsze koszty robocizny
BIOREAKTOR  urządzenie, zbiornik zamknięty i otwarty  w procesach ciągłych, pozwala na
prowadzenie biosyntezy, biotransformacji, bioanalizy w warunkach kontrolowanych z zachowaniem
aseptyki. /ph, temperatura, skład po\
ywki, mieszanie, napowietrzanie/.
*Istnieją procesy, w których wystarcza czystość chemiczna, a nie mikrobiologiczna warunki
chemiczne nie sprzyjają infekcjom np. produkcja kwasu asparaginowego: podajemy z
ródło N i C, ale nie
ma pozostałych składników do procesu mikrobiologicznego.
Nie ma P po prostu w podło\
u brak wszystkich składników potrzebnych do rozwoju drobnoustrojów.
Zdecydowana większość procesów wymaga aseptyczności.
BUDOWA BIOREAKTORA
- szklane
- szkło + stal kwasoodporna
- stal kwasoodporna
PODSTAWOWE TYPY BIOREAKTORÓW
- proces w warunkach beztlenowych  bez mieszadła
- mieszadło
- dysk z łopatkami /6-8/
- proces tlenowy  doprowadzenie powietrza np. mieszadło ma wydrą\
ony wał, przez który
doprowadzane jest O2 i odpowiednia konstrukcja daje zasysanie powietrza.
Przewa\
nie mo\
emy u\
yć odpowiedniego ciśnienia pokonującego słup cieczy. Kilkaset obrotów / minutę
 obrót mieszadła (500/1000) w warunkach przemysłowych 100-400/min
Im dłu\
szy promień tym prędkość obrotowa większa /bardzo wa\
na, bo decyduje o warunkach
mieszania/.
- Ar lift  w środku jest dyfuzor, rura wewnętrzna
- wywołany ruch cząsteczek; średnia rury decyduje szybkości poruszania się cząsteczek
36
- gdy nie ma rury wewnętrznej, doprowadzone powietrze powoduje, \
e cząsteczki się unoszą , istnieje
przepływ zewnętrzny
- bioreaktory kolumnowe, wie\
owe np. do utylizacji ścieków, zakopany w ziemi, doprowadza powietrze
na kilku poziomach, uzyskuje się burzliwe mieszanie , zmniejszenie burzliwości przepływu przez
rozszerzenie górnej części, a zwę\
enie dolnej.
TACA nie jest to idealny model do produkcji  środowisko niejednorodne.
Mieszadła:
- łopatkowe
- śmigłowe lub typu śruby okrętowej
- mieszadło wprowadzone w drgania pionowe
kultury roślinne  du\
e mieszadło
kultury zwierzęce  mieszadło \
aglowe o du\
ej powierzchni
łopatkowe śmigłowe lub typu śruby okrętowej
najlepszy sposób mieszania, rzadko stosowane
łagodny sposób mieszania
umo\
liwia prze\
ycie bakteriom,
grzybom
Czasem trzeba u\
yć kilka wirników, wa\
ne są proporcje wirnika do średnicy bioreaktora
1/3 wirnik bioreaktor, bakterie
� grzyby i promieniowce
- wąskie przegrody 1/10 średnicy bioreaktora uniemo\
liwia przemieszanie się cieczy i nie ślizga się po
powierzchni bioreaktora
- łopatki niszczące parę
- zawór odprowadzający
- � zwykle wypełniony
Hialuronian /kwas hialuronowy, HA/
Polisacharyd o masie powy\
ej 106 DA
Zbudowany z resztek kwasu �-D  glukuronowego i �  N acetylo-glukozoaminy
- du\
a lepkość /w kosmetyce/
- biozgodność
- brak reakcji immunologicznych
- du\
a wchłanialność H2O 6l/g
Hilan /Hylan/ - /diwinylosulfonowa pochodna HA/
Usieciowana pochodna HA, tworzy \
el o du\
ej lepkości i plastyczności.
Kwas hialuronowy występuje w:
37
- pozakomórkowa macierz skóry
- ciecz szklista - oko
- ciecz maziowa stawów
- chrząstki, kości
- otoczka paciorkowców gr. A i C
Funkcja biologiczna
- lepsza w tkankach
- smarowna w stawach
- środek zatrzymujący H2O
HA i jego katabolizm /hialuronidaza/ odgrywają rolę w:
- proliferacji komórek
- rozwoju tkanek
- wzroście i starzeniu się organizmu
- stanach zapalnych stawów i skóry /u sportowców/
Zastosowanie medyczne
- stany zapalne
- leczenie ran
- regeneracja skóry i innych tkanek
Zakres
- chirurgia oka
- medycyna sportowa
- dermatologia
- kosmetyka
Pozyskiwanie
- grzebienie kogutów
- ło\
yska zwierząt
- biosynteza bakteryjna
BIOTECHNOLOGIA HA
y
ródło HA
- streptococcus zooepidermicus /patogen koni/ i inne pozbawione hialuronidazy /bakt. koni/
- rekombinanty E.Coli /innych bakterii, dro\
d\
y/
- linie komórkowe
- synteza enzymatyczna /enzymatyczna synteza hialuronianowa/
*Synteza  potrzebne ATP
*Synteza nie wymaga energii z ATP, jest w jednym z substrat
Biosynteza bakteryjna
Hodowla w podło\
u z cukrem, 37�C, ph 7,5,
2-4 doby, wydajność 5-10g HA/litr /większość procesów w środowisku kwaśnym/
- odwirowanie komórek
- wytrącanie HA etanolem lub siarczanem amonowym
- odwirowanie HA
- rozpuszczenie w H2O /dobrze po podgrzaniu/
-ewentualnie częściowa degradacja hialuronidazą
- ultrafiltracja lub filtracja \
elowa  dają czystszy produkt
Mo\
liwa jest równie\
ekstrakcja w układzie powierzchniowym czynnego kompleksu anion  kation.
*Dekstran  raczej polimer liniowy.
Leuconostoc mesenteroides producent
- z dominacją wiązań alfa-1,6; wiązania alfa-1,3(1,4  1,2  najrzadziej występują). Synteza prowadzona
jest poza komórką bakteryjną, komórki syntetyzują, najpierw enzym dekstranosacharaza enzym, który
tnie sacharozę, a póz
niej tworzy dekstran nazwa poprawna enzymu. Jedynym z
ródłem C /węgla/ mo\
e
być glukoza, nie maltoza. Bakterie mogą rozwijać się na ró\
nym podło\
u, ale nie syntezują
dekstranu./enzym nie ma powinowactwa do maltozy/. Produktem biosyntezy jest mieszanina ró\
nych
38
dekstranów /liniowe, nieliczne, mniej lub bardziej rozgałęzione. Są to największe polimery o milionach
Da. W lecznictwie wykorzystywane są te o kilku tys. Da. Wykonuje się hydrolizę enzymatyczną lub
kwaśną dekstranu macierzystego. Mo\
na te\
bezpośrednio syntezować dekstran o zbli\
onej wielkości
/selekcja szczepów lub procesy syntezy enzymatycznej/. Najlepszy dekstran 100000.
Substratem jest sacharoza, reszty glukozy są przenoszone na akceptor /np. dekstran o małych
cząsteczkach 10,25tys.D w stę\
eniu mniejszym 1%.
Optymalne warunki zapewnia stę\
enie 10% sacharozy, stosuje się jednak wy\
sze stę\
enie dodając
kolejne porcje sacharozy, nawet do 20%, \
eby uniknąć du\
ego stę\
enia produktów /ph 5-5,5  synteza
fermentacyjna.
Po procesie biosyntezy dostaje się gęstą i lepką zawiesinę. Dekstran ------------- ? na komórki bakteryjne,
jest w niej du\
o nieprzereagowania składników /np. produkt wyjściowy, kwas mlekowy/ z podło\
a 
problem przy wydzielaniu  wytrącaniu z etanolem 1:1
Zanieczyszczenia mo\
na oddzielać na sorbentach /absorpcja jonity/ i otrzymuje się produkt będący
półproduktem do otrzymania dekstranu leczniczego.
Synteza enzymatyczna /lepsze technologie/ - bez procesu fermentacyjnego, aby uzyskać produkt
końcowy  dekstran.
Modyfikacja polega na namno\
eniu komórek. Otrzymane stę\
enie sacharozy jest znacznie ni\
sze 2%,
następuje silna indukcja dekstranosacharazy; nie ma syntezy produktu przy tak niskim stę\
eniu cukru.
Po namno\
eniu komórek i uzyskaniu du\
ej ilości enzymu przygotowuje się roztwór cukru o stę\
.10% i
dodaje się do tego zawiesinę pohodowlaną uzyskaną w 1-szym etapie /fermentacja/. Mo\
na dodać
znacznie mniej jej w stosunku do stę\
enia sacharozy /np.1/5/. Te same warunki, intensywne mieszanie,
uzyskuje się mniej zanieczyszczonego produktu.
Po namno\
eniu komórek i syntezie enzymu wytrąca się enzym typowymi sposobami stosowanymi dla
białek /etanolem wysalanie/ enzym mo\
na oczyścić na kolumnach /chromatogr. \
elaza, jonowymienna/,
usuwa się zanieczyszczenie z podło\
a. Enzym mo\
na zliofilizować i przechowywać w roztworze lub na
sucho i w odpowiednim momencie u\
yć
Jest najbardziej kontrolowana, dostaje się czysty dekstran, niezanieczyszczony o najbardziej zbli\
onej
wielkości do dekstranu klinicznego.
Największe  klasyczne fermentany (fermentazy?)
Najmniejsze  enzymatyczne.
40,70 tys. aby uzyskać trzeba wszystkie zhydrolizować.
Synteza kwasowa wykonana z roztworu kwasowego, o temp.100�C została zastąpiona syntezę
enzymatyczną.
Enzym dekstranowa /hydrolizuje dekstran/, występuje u niektórych grzybów z rodzaju Penicylinom.
Po namno\
eniu grzyba enzym wydziela się i u\
ywa do hydrolizy dekstranu. Środowisko lekko kwaśne,
bez kwasów mineralnych, 40-50�C. Przygotowuje się roztwory dekstranu, po rozpuszczeniu w gorącej
H2O stę\
eniu ok.5%, do hydrolizy enzymatycznej mo\
na u\
yć nieco większego stę\
enia. Trudno jest
kontrolować stopień hydrolizy, jest to proces przypadkowy, nie wiemy w którym miejscu hydroliza
nastąpi i o jakiej długości będą cząsteczki. Hydroliza enzymu nieco lepiej da się kontrolować. Pomiar
lepkości pozwala podjąć nam decyzję czy zatrzymać hydrolizę czy wydzielać dalej.
*Nale\
y rozdzielić frakcje dekstranu; etanol, metanol, aceton w ilościach ok. 40%, wytrąca się dekstran o
największych cząsteczkach, ten przeznaczony jest do dalszej hydrolizy. Dodatkowo jeszcze 10% etanolu
dawka kliniczna.
W roztworze pozostaje dekstran małocząsteczkowy, jest wykorzystywany w biotechnologii, jako starter
do syntezy dekstranu; terminator jego druga funkcja. W miarę ę! łańcucha polimeru enzym traci
powinowactwo do kolejnych cząsteczek glukozy i enzym odczepia się od cząsteczek o odpowiedniej
wielkości i przyłącza się do dekstranu małocząsteczkowego. Gdybyśmy dali za mało dekstranu
małocząsteczkowego ten proces trwałby w nieskończoność.
Zastosowanie dekstranu:
- wypełniacz plazmy, osocze
- preparat do leczenia ran, oparzeń
- leczenie anemii /Fe + dekstran/
- antykoagulanty
* Biochemia, biotechnologia
39
 - sefadexes w chromatografii \
elowej pozwala na rozdzielenie białek na 2 frakcje o ró\
nej wielkości
- polielektrolit
- do u\
ycia w 2 fazach wodnych
Cyklodekstryna
W lecznictwie cyklodekstryna �, tworzy pierścień w którym dobrze mieszczą się małe cząsteczki leku,
zawiera 7 reszt glukozy.
Drobnoustroje syntetyzują enzym, który mo\
na wykorzystać do biosyntezy cyklodekstryny.
Rodzaje Bacillus: circulans megaterium
�!
wytw. antybiotyków aminoglikozydowych /jako jedyne z
ródło genu do syntezy
antyb. np. amikacyny przez promieniowanie
Micrococcus z
ródło genu glukozylotransferazy cyklodekstrynowej.
Gen jest wprowadzony do E. Coli lub do gat. Bacilles substr. na plazmidach, zapewnia najlepszą
wydajność.
Zastosowanie - \
ywność, leki, kosmetyki, przemysł chemiczny
Biosynteza  u\
ycie szlaków enzymów lub pojedynczych enzymów.
Biotransformacja
*enzymatyczne /najczęściej jednoetapowe/ przekształcenie egzogennego związku chemicznego 
naturalnego substratu lub ksenobiotyku do strukturalnie podobnego produktu nie dostarczając zazwyczaj
energii ani prekursorów do syntez komórek.
Proces biotransformacji mo\
e być prowadzony przy u\
yciu komórek /drobnoustrojów roślinnych lub
zwierzęcych/, organelli komórkowych lub wyizolowanych enzymów.
Enzymy o niecałkowitej specyficzności mogą prowadzić reakcje ró\
nych związków chemicznych.
Najbardziej efektywne są procesy mikrobiologiczne.
biokatalizator mo\
e być w stanie wolnym lub immobilizowanym.
Cechy reakcji biotransformacji
1.Specyficzność typu reakcji
* utlenienie
- hydroliza, odwodnienie
* redukcja
* hydroliza
* izomeryzacja
* kondensacja
2.Specyficzność substratowa
3.Regiospecyficzność /specyfika miejsca reakcji/
4.Mo\
liwość reakcji w miejscach mało reaktywnych
5.Stereospecyficzność /substratu, produktu/
6.Wysoka wydajność, często bliska 100%
7.Wysoka czystość produktu reakcji /nie zawsze/
8.A
agodne warunki reakcji
Biotransformacja drobnoustrojów
Proces Drobnoustroje
Benzaldehyd. D(-)-1-hydroksy- S. cerevisiae /dro\
d\
e/
1-fenylopropanon
Etanol kw. octowy Acetobacter sp. /nie w lecznictwie
D-glukoza D-fruktoza B. coagulans /słodkie napoje/
D-glukoza kw. D-glukuronowy A.niger /Aspergillus/
G. suboxydans /glukonobakterie/
Kwas fumarowy kw. L-asparaginowy E. Coli
40
Kwas fumarowy kwas jabłkowy B. ammoniagenes
B. flavum
Penicylina kw. 6-AP E. Coli, P.rettgeri /Proteus
D.- Sorbitol L-sorboza Gluconobacter suboxydans
Steroidy 11alfa-0H R.nigricans /Rizopus/
Główne surowce do produkcji leków steroidowych:
Cholesterol, kwas deoksyholowy  zwierzęta
roślinne:
" Diosgenina z korzenia Dioscorea mexicana
" Stigmasterol  soja
" Sitosterol  soja, bawełna ,trzcina cukrowa
Hecogenin  agawa, juka
1 wybrany wzór związku steroidowego umieć!
Przemysłowa biotransformacja steroidów:
Hydroksylacja Substrat Drobnoustrój
11alfaOH progesteron Rhizopus nigricans
Aspergil ochrecesus
11 � OH karteksolon Curvularia lunata
Absidie orchidis
16 alfaOH 9alfa-fluorokortyzol S. roseochromogenes
Utl. 3 � OH
+ izomeracja pregnenolon Aspergillus Sp
Delta5 delta4 Streptomyces Sp
Odwodornienie kortyzol Arthrobacter Simplex
Delta1
Redukcja 17 = 0 progesteron Cylindroraspos radicula
Historia antybiotyków
Stosowane ju\
przed 3000 lat  Chińczycy  spleśniałe produkty sojowe  odka\
anie ran.
XVII w.  Indianie  wyciąg z kory drzewa chinowca - malaria
- wyciąg z kory wymiotnicy  czerwonka
I okres wstępny  zapoczątkowanie pracami Fleminga 1940
II złota era  badania nad antybiotykiem  antybiotyki naturalne lata 40-60
III era współczesna  antybiotyki półsyntetyczne  od 1960 do dziś era antybiotyków
półsyntetycznych
Antybiotyk substancja wytwarzana przez drobnoustroje działające bójczo na inne drobnoustroje
1942 Waksman:
* małocząsteczkowa substancja naturalna, najczęściej pochodzenia drobnoustrojowego lub ich
półsyntetyczne modyfikacje: lub
* syntetyczne analogi, które w małych stę\
eniach działają wybiórczo na strukturę komórek, procesy
metaboliczne, hamując wzrost drobnoustrojów lub rozmna\
anie komórek.
Antybiotykami nie są:
- bakteriocyny  białka produkujące bakterie  skierowane przeciw innym szczepom bakterii blisko
spokrewnionym z producentem
- chemioterapia  np. sulfonamid i chinolony produkowane całkowicie metodami chemicznymi, nie mają
wzorców naturalnych
- alkohole, kwasy organiczne  mogą działać bójczo, ale w odpowiednio wysokim stę\
eniu /np. C2 H5
OH-60/70%
41
- probiotyki  preparaty mikrobiologiczne stymulujące ę! organizmów wy\
szych /stosowane w jogurtach
rodz. Lactobacillus
Dlaczego potrzebne są nowe antybiotyki ?
- szybkie narastanie i rozpowszechnianie się oporności na stosowane antybiotyki
- zbyt du\
a toksyczność wielu stosowanych antybiotyków np. aminoglikozydów
- poprawa właściwości farmakologicznych, tj. aktywności, wchłaniania, czasu działania, stabilności
- infekcje pierwotniakowi i robaczyce
- grzybice układowe
- nowotwory
- infekcje wirusowe
- weterynaria ochrona roślin uprawnych /konserwacja \
ywności / antybiotyki jonoforowe  nie są
stosowane u ludzi.
Klasyfikacja
1.Pochodne aminokwasów
- modyfikowane aminokwasy /cykloseryna/
- �-laktamy/penicyliny, cefalosporyny/
- polipeptydy /polimyksyny/
- depsipeptydy /walinomycyna/
- glikopeptydy /biomycyna i warkomycyna/
- chromopeptydy /aktynomycyna/
- lipopeptydy np.daptomycyna
2.Antybiotyki cukrowe
- aminoglikozydowe /streptomycyna i gentamycyna
- C  glikozydy /wankomycyna/
-N  glikol / streptotrycyna i glikolipidy, moenomycyna
Antybiotyki makrocykliczne
- makrolity wł. /erytromycyna/
- M. polienowe /anfoterycyna B, nystatyna/
- Ansamycyny /ryfamycyna/
- Makrotetroidy /tetranektyna/
Chinoiny
- Antracykliny /daunorubicyna/
- Tetracykliny /chlorotetracyklina, tetrarubicyna, oksytetracyklina/
- Benzochinany  nitromycyna
- Naftohinony /aktynorodyna/
Inne
Nukleozydowe /polioksyna/, pochodne cykloalkanów, polietery, związki aromatyczne /chloram-fenikol/,
związki fosforoorganiczne /fosfomycyna/, związki steroidowe /kwas fusydowy/.
* Mechanizm działania  miejsce działania antybiotyków
1.Synteza kwasu nukleinowego
- replikacja DNA: * mitomycyna /matryca DNA/
* neomycyna /polimeraza DNA/
- transkryptaza: * aktynomycyna /matryca RNA/
* ryfamycyna /polimeraza RNA/
2.Synteza białek /translacja/
erytromycyna, streptomycyna, tetracyklina, chloramfenikol/detreomycyna/
3.Błona komórkowa
polimyksyna, nystatyna, anfoterycyna
4.Ściana komórkowa
cefalosporyna, cyklosporyna, penicylina
42
5.Procesy enzymatyczne
antymycyna, Oli gomycyna
Efekt /skuteczność/ działania:
- bakteriobójcze  w stę\
eniu określonym we krwi zabija
- statyczne  działanie odwracalne, zale\
y od sił organizmu
Skuteczne działanie zale\
y od:
- powinowactwa antybiotyku do miejsca jego uchwytu
- efektywności oddziaływania na procesy \
yciowe drobnoustrojów chorobotwórczych
Idealny lek przeciwbakteryjny wykazuje tzw. toksyczność wybiórczą  jest szkodliwy dla patogena, a
nieszkodliwy dla gospodarza /człowiek, zwierzę/. Toksyczność wybiórcza jest względna tzn. lek w
stę\
eniu tolerowany przez gospodarza mo\
e powodować uszkodzenie patogena.
Występujące oporności na antybiotyk zjawisko to ciągle narasta
- naturalna  występuje w genomie przy namna\
aniu
- nabyta  pochodzenia chromosomalnego  wynika z mutacji drobnoustrojów
- pochodzenia pozachromosomalnego - geny oporności występują na plazmidach, przekazywane nawet
między gatunkami
Mechanizmy obronne przed antybiotykami
- brak miejsca uchwytu
- miejsce uchwytu niemo\
liwe lub zablokowane
- wytworzenie zastępczych procesów metabolicznych
- bariera transportu antybiotyku do miejsca uchwytu
- unieczynnienie antybiotyku przez wiązanie go ze str4ukturami komórkowymi
- enzymatyczna inaktywacja antybiotyku
Zakres działania
- przeciwbakteryjne o szerokim spektrum działania /cefalosporyna/
- przeciwbakteryjne działające na bakterie G+ /penicyliny/
- przeciwbakteryjne działające na bakterie G- /kolistyna/
- przeciwgrzybowe /gryzeofulwina/
- przeciwnowotworowe /aktynomycyna/
Pozyskiwanie nowych antybiotyków
- skrining /przeszukiwanie, wyszukiwanie/ antybiotyków naturalnych
- biosynteza antybiotyków zmodyfikowanych
- biotransformacja enzymu produkującego biosyntezę  penicylina półsyntetyczna
- modyfikacja chemiczna produkująca biosyntetyki  cefalosporyny
- synteza chemiczna analogów antybiotyków naturalnych
Penicylina G
amylaza penicylinowa
/amidaza/
Penicylinowa
Biotransformacja enzymatyczna penicyliny G otrzymuje się kwas 6  aminopenicylanowy substrat
do produkcji penicylin półsyntetycznych.
Cefalosporyna C podstawienie innych łańcuchów powoduje zwiększenie aktywności.
Cele modyfikacji antybiotyków naturalnych:
- zwiększenie aktywności /cefalosporyny/
- poszerzenie zakresu działania /piperacylina/
- mo\
liwość podania doustnie /cefaleksyna/
- poprawa wchłaniania i dystrybucji /ampicylina, azytromycyna poprawa wchłaniania i dystrybucji/
- przedłu\
enia czasu działania /dirytromycyna/
- zwiększenie stabilności chemicznej /penicylina V/
- zwiększenie stabilności metabolicznej /meropenemy/
43
 - zmniejszenie toksyczności /pepleomycyna/
- zmniejszenie reakcji alergicznych /penicyliny półsyntetyczne/
- poprawa smaku / estry, erytromycyny, sole streptomycyny/
- poprawa rozpuszczalności
- powinowactwo do białka krwi /amoksycylina/
90% antybiotyków, to pochodne metabolit. promieniowców:
aminoglikozydy
makrolidy
cefalosporyny
Antybiotyki � - laktamowe grzyby strzępkowe z rodziny Penicylin
Antybiotyki polipeptydowe  Bacillus
Glony, porosty, rośliny zielone, zwierzęta  równie\
produkują
Genofor drobnoustrojowy ma kilka tysięcy genów /promieniowce 7 tys. genów/,
a wykorzystane tylko 2 tys. w trakcie \
ycia mogą nie zawierać inf. lub mogą być uśpione, to tzw.
milczące geny modyfikacje. Antybiotyki są produkowane przez szczepy dzikie w bardzo małych
ilościach, trudno jest je badać.
Chromosomy i plazmidy zawierają te informację o regulacji biosyntezy antybiotyków u grzybów:
Geny biosyntezy penicyliny w pojedynczym miejscu
Geny biosyntezy cefalosporyny 2 miejsce przy udziale odmiennych promotorów
Drobnoustrój wytwarzający antybiotyk jest na niego niewra\
liwy, przypuszcza się, \
e to one są z
ródłem
nabywanej oporności.
Regulacja biosyntezy antybiotyków związana jest z ogólnometaboliczną regulacją przemian
metabolicznych, które dają produkt. U szczepów dzikich te mechanizmy regulacji zapewnia całkowitą
regulację , antybiotyki produkowane są wtedy, gdy te mechanizmy zostaną zaburzone.
Mechanizmy regulacji
- represja wywołana przez metabolit
- represja i hamowanie katabolizmu
- indukcja substratowa
- indukcja powodowana przez efektory metabol.
- regulacja związku N azotu
- regulacja fosforanowa i energetyczna
- hamowanie w sprzę\
eniu zwrotnym
- regulacja z udziałem pierwiastków śladowych, inne czynniki  temp., ph
Szczepy dzikie mogą wytwarzać mniejsze 1 mg
Po modyfikacji kilkanaście mg, przemysł potrzebuje ilości w g.
- mutagenizacja
- krzy\
owanie szczepów
- metoda in\
ynierii genetycznej  obce geny do kom.
I Etap  przygotowanie aparatury i po\
ywek  wyjałowienie
II Etap  namno\
enie materiału posiewowego  przygotowanie inokulonośnika
III Etap  proces biosyntezy antybiotyków
IV Etap  wydzielanie i oczyszczanie produktów
V Etap  otrzymanie formy hodowlanej, utylizacja lub zagospodarowanie odpadów, ścieków
Podło\
a:
- produkcyjne ze z
ródła C i energii C  prosty lub dwucykliczny
- zapewnienie optymalnego namno\
enia i otrzymanie jak największej ilości antybiotyków
- te\
skrobia
- z
ródło N  sole amonowe, woda amoniakalna, mąka sojowa, namok kukurydziany, kompleksowe
podło\
e
- sole mineralne
- Ca Co3  neutralne powstawanie kwasu
44
 - składniki specyficzne
* witaminy, aminokwasy
* prekursory, u\
ywane w biosyntezie antybiotyków
Proces odbywa się w bioreaktorach zbudowanych ze stali kwasoodpornej, monitorowanej temperaturze,
napowietrzenia, ph, bioreaktory zapewniają właściwe warunki procesu. Bioreaktor o pojemności
kilkudziesięciu m 3 /od 200/, nawet 300-400 m3 zawiera mieszadła elektryczne, napowietrzane za
pomocą rury perforowanej. Po zakończeniu procesu przystępujemy do izolacji i oczyszczenia.
Ekstrakcja, zastosowanie chromatografii kolumnowej, krystalizacja
Lek: przygotowanie w formie do sprzeda\
y /krystalizacja i dodatkowe oczyszczenie/
Struktury chemiczne związków � - laktamy
- penamy i penemy /w pierścieniu tiazolidynowym w pozycji 1-S między C2 i C3
w penach z podwójnym wiązaniem
- karbapenamy i karbapenemy /w pierścieniu tiazolidynowym w pozycji C1-CU2. W karbapenemach
pod. wiąz. C2 i C3
R
O
N S
N
- oksapenemy /klawamy/ i oksopenemy /klaweny/
W pierścieniu tłokowym w poz.1-0, w oksopenemach pod. wiąz. między C2 i C3.
- cefemy, oksacefemy, karbocefemy w pierścieniu clihydrotiazynowym w poz. 1 kolejno S, O, CH2 i
podw. wiąz. między C3 i C4
- azetydynowy: monocylina beta-laktamy
Kwas klawulonowy związki skierowane przeciw laktamazom, to np. kwas klawulonowy np. w
Augmentinie
Początkowy szlak biosyntezy penicyliny i cefalosporyny  jest wspólny
L-cysteina, L-walina, L-wal
Powstają dwupeptydy, a następnie przyłączenie L-Val
Etapy procesu biotechnologicznego
1.dobór i hodowla kultur
2.Przygotowanie po\
ywki z uwzględnieniem ró\
nych składników mineralnych
3.Biosynteza
4.Izolacja antybiotyku z brzeczki pohodowlanej
5.Oczyszczenie
6.Otrzymanie gotowego produktu
Podło\
e w biosyntezie penicyliny
- do namno\
enia zarodników  podło\
e ubogie  niskie stę\
enie z
ródła C i N  szybkie i obfite
zarodnikowanie
- inokulowanie wegetatywne  podło\
e wzbogacone  większe stę\
enie cukru, ok. 40g, namok
kukurydziany jako dodatek (obok NH4 NO3 z
ródło N/
- podło\
e produkcyjne  sprzyja maksymalnej produkcji penicyliny, dozowanie glukozy, namok
kukurydziany, jako kompleksowe z
ródło związków azotowych, prekursory /fenylooctan sodowy 
prekursor reszty benzylowej/
Początkowa temperatura 27�C
20-40 h namno\
enie grzybni, obni\
enie temp. do 24�C, następnie produkcja antybiotyku, pamiętamy o
zasianiu w glukozie
0,5 1m3 powietrza /1 l po\
ywki/ 1min napowietrzenie
45
Ph  6,5, gdy dojdzie do ph=8, proces musimy przerwać, gdy\
rozkłada się penicylina.
180-240 h  proces biosyntezy /całkowity/
Morfologia grzybni  rozdrobnione strzępki lub kuleczki o niezbyt du\
ej średnicy.
Regulacja biosyntezy penicyliny
- reakcja kataboliczna z
ródła C  represja kataboliczna, efekt glukozy.
Czynnikiem regulującym jest nie rodzaj z
ródła C, ale szybkość jego metabolizmu
- regulacja fosforanowa  nadmiar jonu fosforanowego pogłębia efekt glukozy /jon fosfor. stymuluje
proces transportu glukozy do komórek/
- reakcja związku azotu  du\
e stę\
enie jonu amonowego /NH4+/ ograniczona synteza L-glutaminy 
donor grupy amidowej włączonej do cząsteczki
- sprzę\
enie zwrotne przez nadmiar L-Lizyn /nadmiar lizyny powstaje w szlaku dostarczającym L-
lizyna
- hamowanie produktem końcowym
IZOLACJA
brzeczka pohodowlana
�! chłodzenie +10C
zakwasz.H2SO4, do ph2
filtracja
zakwaszenie H2SO4 do ph2
�!
ekstrakcja octanem amylu
�!
ekstrakcja do buforu fosforanowego ph7
�! zakwaszenie H2 SO4 po ph2
ekstrakcja octanu amonowego
�!
odwodnienie Na SO4
odbarwienie /węgiel aktywny/
ochłodzenie
�!
Krystalizacja  nasycamy roztwór octanu sodu lub potasu
�!
wirowanie, osuszenie, dodatkowe oczyszczenie, zamknięcie w formę gotową
do sprzeda\
y.
Mieszadła:
kultury roślin  du\
e mieszadło, miesza wolno / mieszadło kotwicowe, spiralne  wynosi zawiesinę do
góry/
kultury zwierząt  mieszadło \
aglowe, o du\
ej powierzchni, miesza powoli, bo komórki zwierzęce są
delikatniejsze, bo nie mają ściany komórkowej
Powierzchnie mieszające wykonuje się z hydrofobowej membrany gazy dyfundują przez membranę w
postaci cząsteczkowej zawiesina staje się nasycona O2.
Brak pęcherzyków powietrza komórki zwierzęce nie są nara\
one na pęknięcie.
- Mieszadło air - lift - cell  lift  tzw. winda powietrzna zasysanie.
Systemy napowietrzania
- kolumna z bełkotką  mieszanie burzliwe, * na dole bioreaktora znajduje się bełkotka, hodowle
dro\
d\
y
- jedno miejsce napowietrzania, dno skośne  przepływ laminarny
- rura w środku bioreaktora  napowietrzanie w jej środku biomasa mo\
e osadzać się na górze
bioreaktora niekorzystne dla niektórych typów kultur. Lepiej jest dać dyszę obok ściany, a nie w
centrum.
- mieszadło mechaniczne, a pod nim miejsce doprowadzające powietrze
46
 - rura przepływowa połączona z systemem mieszającym, włączenie powoduje zarysowanie biomasy do
rury. Powstaje piana na górze, która te\
jest zarysowana. Wał napędu wydrą\
ony  tędy dostarczane jest
powietrze.
* Idea przechodzenia O2 z pęcherzyków powietrza do komórek.
Z pęcherzyków O2 musi dostać się do komórek kształt kuleczki np. grzybnia, pojedyncze komórki
bakterii.
Opory istniejące na drodze O2 granica fazy gazowej i ciekłej. W tym układzie od strony powietrza
istnieje warstewka nieruchoma, molekularna zawierająca cząsteczki gazów np. O2, N2. Od strony cieczy
te\
istnieje laminarna warstewka nieruchoma / od strony cieczy tu występują opory. Największy opór
na drodze O2 do komórki na granicy faz.
W cieczy jest w miarę łatwa dyfuzja / nie ma tu du\
ego oporu/. Dotarcie do komórek, kuleczek znów
powstaje opór. W przypadku grzybni większy opór, gdy komórki są bardzo ściśle wpakowane. Na
powierzchni kuleczki grzybni jest tzw. faza miękka od strony fazy ciekłej.
Musi być du\
a powierzchnia, czyli du\
o pęcherzyków powietrza. Nale\
y zwiększyć rozpuszczalność O2
w po\
ywce. CO2 rozpuszcza się 30 razy lepiej w H2O  ok. 8 mg/l O2 rozpuszczalność tlenu w wodzie, w
po\
ywce jeszcze mniej.
Czynniki wpływające na k2 a:
- natę\
enie przepływu powietrza a
- sposób doprowadzenia powietrza a, tp
- sposób intensywności mieszania a, tp
- wysokość warstwy cieczy tp
- temp.  C2
- skład chemiczny środowiska  C2
- gęstość komórek i morfologia
kuleczki grzybni
O2
O2
faza miękka
granica faz
granica faz
Komórki mniej upakowane
(mniejszy opór)
pęcherzyk woda kuleczki grzybni
Szybkość absorpcji tlenu z podło\
a jest wprost proporcjonalna do gradientu stę\
enia tlenu w fazie
gazowej i ciekłej oraz do odwrotnie proporcjonalna do oporów wnikania.
47
dc
*
= k2a(C* - C2) = k2aH �" ( pO2 - pO2 )
Wnikanie O2:
dt
C* - stę\
enie O2 w fazie ciekłej
a  powierzchnia kontaktu gazu z cieczą
H  stała Henry ego
pO2  prę\
ność cząsteczkowa tlenu w fazie gazowej
pO2* - prę\
ność równowagowa tlenu
Na ścianach korby mo\
na zrobić wgniecenie, by zwiększyć mieszanie. Ciecz wówczas nie miesza się
laminarnie jest dostęp O2 i większe k2 a.
100 ml kolba 20-30 ml biomasy
300 ml kolba 50-80 ml podło\
a
PIANA  układ heterogeniczny, rozpraszana faza gazowa, w małej ilości cieczy
- powstaje z powodu obecności saponin przy hodowli roślin
- gromadzenie białek, prod. ich hydrolizy hydrolizaty, to peptony.
Produkcje takie mogą powstawać pod koniec procesu technologicznego autoliza komórek do
roztworu dostają się produkty rozpadu komórek.
Prolektory z pianą:
- wynoszenie komórek z pianą
- utrudniona kontrola stę\
enia biomasy
- utrudniona kontrola objętości hodowli
- redukcja pojemności u\
ytkowej bioreaktora
- zagro\
enie wypienienia hodowli i zaka\
enia obcą mikroflorą
- konieczność stosowania środków p/pianowych i ich niekorzystne działanie na proces /stosuje się
urządzenia mechaniczne lub środki chemiczne/
Stare technologie p/pianowe oleje roślinne, tłuszcze zwierzęce /smalec/, tłuszcz z kaszalotów.
Zmiana metabolizmu z cukrowego na tłuszczowy korzystne przy syntezie alkaloidów sporyszu.
Chemiczne środki przeciwpianowe:
- oleje roślinne
- tłuszcze zwierzęce  du\
e ilości
- wy\
sze alkohole /oktadekanol/ - małe ilości
- połączenie krzemoorganiczne
- mieszanina polioksoetylenu i polioksopropylenu /9:1/ - tworzy emulsję, która bardzo skutecznie gasi
pianę, bardzo małe ilości, nie wpływa na metabolizm komórki
Środki przeciwpianowe mogą być doprowadzane za pomocą dysz lub na powierzchni tarcz.
Piana mo\
e być usuwana mechanicznie wirówka szybkoobrotowa z talerzami sto\
kowymi.
Nadmiar piany wchodzi do cyklonu, tam ciecz ulega skropleniu i powraca do bioreaktora.
48
k2a k2a
kuleczki kuleczki
nitki
nitki
stę\
enie grzybni obroty
k2a k2a
kuleczki
kuleczki
nitki nitki
przepływ powietrza stopień wypełnienia cieczą kolby
Im więcej cieczy w kolbie, tym mniej wolnej przestrzeni przy wstrząsaniu (100-150 obrotów/min).
*Warunki aseptyczne  dławice, z impregnowanym sznurem azbestowym lub układ uszczelek
mechanicznych.
- filtry membranowe, które oczyszczają powietrze z bakterii
- doszczelnianie układu  tam, gdzie są części ruszające się /wirnik, mieszadła/, znajduje się kulka do
której doprowadzany jest smar silikonowy /doprowadzany rurką/, tam uszczelnia wokół wała przestrzeń 
smar zostaje rozsmarowany wokół wała
- inny układ, to silnik, wał, układ magnesów lub elektromagnesów. To drugi element mieszający
wewnątrz bioreaktora. Występują dipole sprzęgające /w mieszadle/.
Nie wymagany jest otwór w bioreaktorze  dzięki temu jest mniejsze zagro\
enie zaka\
eniem. Dla małych
i średnich bioreaktorów /najwięcej do 1m3/ pod warunkiem, \
e nie ma składników mechanicznych
/zanieczyszczenia/ np. piasku, bo jest tam podkładka silikonowa, która mo\
e ulegać ścieraniu.
Pobieranie jałowych prób.
Słu\
y do tego specjalny zawór  podwójny. Najpierw otwiera się jeden zawór przepuszczenie pary
wodnej  wyjałowienie zaworu. Zamyka się go i otwiera drugi, \
eby pobrać próbę. Próbę pobiera się
dzięki powstaniu nadciśnienia /dostarczenie jałowego powietrza do bioreaktora/. Zamyka się zawór i
znów otwiera się zawór wyjaławiający. Zamyka się go po sterylizacji i powraca do stanu wyjściowego.
Wyjaławianie podło\
a- ciepłem
Sterylizacja okresowa  metoda klasyczna  autoklaw. Para wodna musi wypchnąć całe powietrze, bo
inaczej nie ma takiej wysokiej temperatury. Wystarczy 0,8-1 bar nadciśnienia /układ odpowietrzony/.
Sterylizacja ponad 0,5 h, póz
niej schłodzenie, trwa to kilka, kilkanaście godzin. Niekorzystny okres, gdy\

pobieramy najwięcej energii.
49
�C
100
50
0
1 2 3 4 h
Etapy:
1. podgrzanie
2. odpowietrzenie
3. właściwa sterylizacja
4. ochłodzenie
Stąd stosowane są sterylizacje ciągłe:
- przeponowa istnieją wymienniki ciepła z przegrodą w jednej komorze niejałowe podło\
e, po drugiej
stronie jest para wodna. Czynnik sterylizujący nie styka się z podło\
em /przeponowe  najczęściej
płytowe/.
�C
150
100
50
0
1 2 3 4 5 h
Są 3 moduły:
- środkowy wstępnie /ok. 90�C/ podgrzanie podło\
a  ciepło oddawane przez podło\
e
wysterylizowane
- podgrzanie podło\
a do 3 modułu temp. ok. 140�C  układ rurowy dobrze izolowany /para/
Proces ten trwa krótko np. 2 minuty /wy\
sza temperatura, ale nie jest to działanie niekorzystne, bo krótki
czas działania daje lepsze podło\
e ni\
w autoklawie/. Póz
niej schładzane w II i I module
wymiennikach ciepła w I woda chłodząca.
Metoda otrzymywania mleka UHT. Czynnikiem jest para wodna o temperaturze ponad 100�C.
temperatura ok. 150�C trwa kilka sekund, rura zaizolowana /z tą parą/. Podło\
e następnie wkłada się do
pojemnika z chłodzeniem.
Sterylizacja ciągła  zalety:
- skrócenie czasu sterylizacji
- mniejsze zmiany chemiczne podło\
a
- automatyczna sterylizacja
- mniejsze zu\
ycie energii
- eliminacje szczytów zu\
ycia energii /pary/ i wody
50
 - najbardziej ekonomicznie /poboru/
Wydzielanie /izolacja/ bioproduktów
Po procesie biosyntezy wydzielenie i oczyszczenie produktu. Koszt tych dwóch ostatnich procesów
czasem stanowi nawet 50% kosztów całego procesu.
Efektywność procesu zale\
y od tego, ile produktów znajduje się w biomasie, w cieczach
pohodowlanych.
Przykłady stę\
enia (g/l) produktów w cieczach pohodowlanych
- etanol 70-120
- kwas organ. 40-100 (kwasu cytrynowego)
- aminokwasy 30-100 (lizyna, kwas glutaminowy)
- antybiotyki 20-30 (50 dla penicyliny)
- lipidy 20-30
- B2 10-15
- większe enzymy 1-5
- produkty roślinne 0,1-5 (z hodowli komórek roślinnych in vitro)
- B12 0,02-0,15 np paklitaksel
Kryteria wyboru met. wyodrębnienia bioproduktu:
1.Lokalizacja produktu
- w komórkach /dotyczy głównie komórek roślinnych/
- w cieczy pohodowlanej /łatwiej wydzielić produkt/
Występują produkty, które i w komórkach i w cieczy. Dotyczy to głównie antybiotyków polienowych,
przeciwgrzybowych /np. nystatyna/.
2.Właściwości
- masa cząsteczki /separacja w \
elu/ za pomocą membran ultrafiltracja
- struktura chemiczna
- ładunek elektrostatyczny /u\
ycie jonitów/
- polarność
- hydrofilowość / hydrofobowość (zastosowanie metod ekstrakcyjnych
3.Stę\
enie produktu
4.stabilność w ró\
nych warunkach
5.Wydajność i selektywność metody  wybiera się metody najbardziej zachowawcze i wydajne:
tetracykliny /wytrącanie, ekstrakcja, niektóre firmy łączą metody
6.Przeznaczenie produktu ideał to, gdy doczyścimy do 1 substancji chemicznej np. penicylina kiedyś z
\
ółtym zabarwieniem, produkowana przez penicylinę chryzogenum, dziś mutanty.
7.Rachunek ekonomiczny  wybiera się metody najtańsze.
Ad.2.
Substancja chemiczna- rozdzielenie penicyliny i cefalosporyny ekstrakcja rozpuszczalnikami
organicznymi /octan butylu, amylu/ .
Penicylina ze względu na swą budowę rozpuszcza się w rozpuszczalnikach organicznych, a cefalosporyna
nie. Do cefalosporyny stosuje się techniki jonowymienne na anionitach.
A
adunki elektrostatyczne wykorzystanie jonitów i elektroogniskowania do kolumny
chromatograficznej przykłada się prąd stały. Występuje ruch cząsteczek naładowanych  ró\
ny czas
retencji.
Polarność  penicylina ma gr. COOH, w zale\
ności od ph, występuje jako anion lub cząsteczka.
Penicylina mo\
e występować w postaci kwasu lub soli w zale\
ności od warunków ph.
*środowisko kwaśne  ph2 cząst. form.
* środowisko obojętne  ph7 anion, sól jest rozpuszczalna w H2O.
51
Ad.4.
Związek stabilny przed wydzieleniem antybiotyku mo\
na podnieść temperaturę /np. do 60-70�C/,
\
eby wytrącić białko /produkcja antybiotyku/.
Grzyby wydzielające białka  enzymatyczne, trzeba je usunąć lub zmienić ph /lekkie zakwaszenie do
punktu izoelektrycznego białek ph 5,5, to powoduje wytrącenie białek i innych substancji.
Metod tych nie mo\
na stosować do produktów wra\
liwych np. witamin, niektórych antybiotyków /temp./,
lub na zakwaszenie środowiska np. te\
niektóre antybiotyki i \
eby uniemo\
liwić hydrolizę penicyliny w
trakcie zakwaszania środowiska nale\
y te\
zmniejszyć temperaturę do bliskiej 0�C.
Ad.6.
- mieszanina gentamycyn zawiera kilkanaście, a nawet kilkadziesiąt. Trzeba usunąć mało aktywne i
bardziej toksyczne. Resztę często jest trudno rozdzielić, dlatego się tak zostawia.
- tetracykliny produkowane przez Polfarm w Pabianicach stosowane jako dodatek do pasz reguluje
skład mikroflory układu pokarmowego. Ma działanie probiotyczne zwiększa masę ciała zwierzęcia
przy tej samej ilości pokarmu.
Ostatni wykorzystywany kompleks bacytracyny z Zn.
Bacytracyna otrzymywana do tego celu wytrącana z biomasy za pomocą Zn kompleks. Zn 
bacytracyna.
Produkt handlowy zawiera nieczyszczone antybiotyki z kom. bakteryjnym itd. Obecnie antybiotyki nie są
stosowane jako dodatek do pasz.
Podstawowe procesy wydzielenia bioproduktów:
1.Separacja zawiesin /biomasy/
-sedymentacje, flokulacje kłaczkowanie
- flotacja piana
- wirowanie i filtracja  stosowane najczęściej
Sedymentacja  tam, gdzie kłaczkowanie, stosowana w produkcji wina, piwa /na końcu filtracja/;
niewystarczająca w procesach farmaceutycznych
Flotacja  wydzielanie produktu przy tworzeniu piany bioprodukt do piany /nie jest metodą wydajną i
korzystną/
Filtracja  jedna z najstarszych metod
Warunki filtracji
Opory filtracyjne z
le się filtrują promieniowce /grzyby, zawiesiny białek, koloidy/ - drobnoustrój
u\
yty w procesie i charakter jego wzrostu /morfologia/.
- skład podło\
a  lepiej, gdy nie jest du\
e stę\
enie produktu /nie nale\
y osiągać stę\
enia
maksymalnego, bo jest zła wydajność filtracji/
- czas hodowli
Zabiegi wstępne:
1.Koagulacja cieplna białek 60-100 �C
2.Zakwaszenie do punktu izoelektrycznego
3.Dodatek ziemi okrzemkowej
4.Dodatek detergentów lub rozpuszczalników organicznych
Słu\
y do tego bęben, w którym znajduje się tkanina filtracyjna, na niej osadza się produkt /średnica bębna
ok.2 metrów/, pomoc filtracyjna, tzw. filtry bębnowe, podciśnienie wyciąga nadmiar wody.
Stosuje się tak\
e procesy filtracyjne zestaw płyt obciągniętych tkaniną filtracyjną, a pomiędzy nimi
komory.
52
Filtracja statyczna  metoda stara
przepływ cieczy
Filtracja dynamiczna  nowsza metoda, występuje samooczyszczanie na membranie. Produkt, to
zagęszczona zawiesina np. do otrzymania Zn  bacytracyny.
Przykład filtracji dynamicznej  zagęszczona ciecz jest odbierana, nie ma odkładania się osadu.
Filtracja nieskuteczna, gdy w zawiesinie pozostały
Koloidy białek. Wówczas stosuje się wirowanie.
Etapy technologiczne  techniki filtracyjne
sterylizacja bioreaktor
mikrofiltracja �!
odpady �! wirowanie, filtracja, mikrofiltracja /0,1-10�m/
�!
zanieczyszczenia �! ekstrakcja, ultrafiltracja /1nm- 0,1�m/
�!
sole mineralne �! chromatografia, elektrodializa <1(5)nm
H2O �! krystalizacja odwrócona
produkt �! osmoza odwrócona
Wirowanie - rodzaje wirówek
a/. wirówka z separatorami  talerzami na ich powierzchni następuje rozdzielenie części stałych i
płynnych. Osad zostaje na ścianach bębna, a ciecz na zewnątrz. Osad mo\
e być co jakiś czas odbierany
lub  ostrzeliwany /urządzenie, które ostrzeliwuje osad/.
b/. inna wirówka komora z wirującym bębnem. Doprowadzana zawiesina. Osad na ścianach bębna, a
ciecz klarowna.
c/. wirówka z 2 obracającymi się elementami /bęben i walec/. Bęben wiruje, na tkaninie filtracyjnej
osadza się produkt. Walec porusza się ruchem posuwistym. Słu\
y on do przemieszania osadu.
d/. wirówka sedymentacyjna  stosowana, gdy mamy do czynienia z koloidami. Osad trzeba co jakiś czas
usunąć.
53
Poprawa warunków wirowania na drodze flokulacji
- zakwaszenie do ph 3-4
- podgrzanie do temperatury 50-60�C
- dodatek:
- NaCl, CaCl2, AlCl3, Al2, (SO4)3 ułatwiają rozdzielenie
- detergenty kationowe ] się fazy stałej
- rozpuszczalniki organiczne i ciekłej
Metale te, a zwłaszcza wirowanie mogą być stosowane na końcu procesu.
2.Dezintegracja komórek /gdy prod. w kom./
- homogenizacja, mielenie
- procesy ciśnieniowe
- liza
*Są młyny kulowe, gdzie w obracającym bębnie występują kuleczki z trudno ścieralne substancji, np.
bardzo twarde szkło, spieki ceramiczne, stopy metali o najwy\
szej twardości. Tu doprowadza się
zawiesinę, w czasie procesu kuleczki rozbijają ścianę komórek.
*Zastosowanie urządzeń z tłokiem i szczeliną przez którą, dzięki ciśnieniu podawanemu na tłok,
przeciska się biomasa. W szczelinie następuje rozprę\
enie /bo w środku nie ma ciśnienia/. W czasie
przepychania następuje rozerwanie ściany komórki. Komórki są zamro\
one i w czasie przechodzenia
ściana się rozrywa. Zabieg stosuje się 2-3-krotnie, \
eby uzyskać du\
ą wydajność.
*Metoda chemiczna  detergenty w rozpuszczalnikach organicznych, spulchnienie i rozerwanie ściany i
błon komórek.
*Stosowanie enzymów litycznych rozmywających ściany komórek /laboratorium/
*Komórka zmatowiona wewnątrz i pałeczka zmatowiona. W szczelinie między nimi są komórki, które są
ucierane lub stosuje ruch posuwisto-zwrotny /laboratorium/.
*W laboratorium te\
stosuje się homogenizatory mechaniczne
3.Wzbogacanie / zatę\
anie
- ekstrakcja
- odparowanie, destylacja
- procesy membranowe
- absorpcja / desorpcja
EKSTRAKCJA / wytrącanie
1.fizycz.  niespecyficzna /słaba/
2.kreatywna  specyficzna /silna
3.w układzie wodnym dwufazowym gdy do fazy wodnej doda się glikol polietylenowy i dekstran
wyraz
na granica faz: hydrofobowe do glikolu, hydrofilowe do dekstranu
4.w cieczach superkrytycznych
5.w odwróconych micelach
6.przez inkluzję
Ciecze superkrytyczne np. CO2, odpowiednie warunki gaz w ciecz CO2 jest obojętnym środkiem
dla wszystkich materiałów, z których chcemy ekstraktować np. ekstrakcja substancji gorzkich z chmielu
/produkcja piwa/.
Odwrócone micele - wydzielenie białek /rzadko stosowane/
Ekstrakcja fizyczna: niespecyficzna - słaba
- w rozpuszczalnikach organicznych mieszających się z H2O /wtedy, gdy substancja dobrze rozpuszcza
się w mieszaninie H2O  alkohol np. antybiotyki polienowi, leki p/nowotworowe/
*metanol
*etanol
- nie mieszających się z H2O /ekstrakcja z biomasy, jak i z wody/ - procesy fermentacyjne
*butanol
*octan butylu /tanio/
* octan amylu /drogo/
-w roztworach wodnych:
54
*połączeń organicznych
* soli nieorganicznych
* w buforach /częściej stosowany, np. ekstrakcja penicyliny  bufor o ph=7 ekstrakcja do fazy
wodnej/
faza wodna | faza organiczna } ekstrakcja
ph=7 | ph=2 (3) } fizyczna
P  COO- Na+ | �! P  COOH } penicyliny
Ekstrakcja jonowymienna  mamy 2 fazy, w nich znajdują się wymieniacze jonowe.
Anonit  wią\
e się z penicyliną (P-) anion z wolną grupą  COOH membrany, faza organiczna
/reaktywna/
faza wodna membrana fazy org. membrana faza wodna
ph=7 | ph=5 | ph=7
| diizotridecyloamina |
P-+H+ + A- | PAH | A +P- +H+
| �! �! |
A- anonity  triizooktyloamina
Trelauryloamina
Rozpuszczalniki: benzen, heksan, chloroform.
Stosowane, \
eby uniknąć niskiego ph.
Ekstrakcja prowadzona w rozdzielaczach z mieszadłami
- ciągła  jednostopniowa materiał ciągle doprowadzany (ekstrakcja z cieczy)
*Bateria ekstrakcyjna  ciąg 3 rozdzielaczy 1  spotyka się rozpuszczalnik z najbardziej stę\
one, a w 3 
jest rozpuszczalnik z du\
ą ilością produktu z materiałem wyjściowym /du\
o prod./, stąd uzyskuje się du\
e
stę\
enie produktu.
4.Rozdzielanie / oczyszczanie
- krystalizacja
- chromatografia
- elektroforeza (rzadko stosowana w skali przemysłowej)
- procesy membranowe
Metody chromatograficzne
- filtracja \
elowa zwykła i perfuzyjna /modyfikacja \
elowej/
- ładunek elektryczny chromatografia jonowymienna
- punkt izoelektryczny chromatoogniskowanie
- oddziaływanie powierzchni, ładunek, polarność, wiązania wodorowe
*chromatografia adsorpcyjna
*chromatografia fazy odwróconej
Chromatografia jonowymienna
1.Wiązanie streptomycyny /STR/ -du\
o  OH, stąd du\
e powinowactwo do kationitów
kationit  COONa + STR - OH
�!
kationit  COO- STR++ NaOH
2.Elucja  proces usuwania z nośnika związków zatrzymanych na nim
kationit  COO -STR ++ HCl
�!
kationit  COOH + STR+ Cl
Cefalosporyna C  czynna grupa  COOH powinowactwo do anionitów
Wytrącanie
1.Na drodze chemicznej  przeprowadzonej w trudnorozpuszczalną pochodną  penicylina prokainowa
sól K lub Na
2.Na drodze fizycznej
55
 - wprowadzenie rozpuszczalnika
np. wytrącanie dekstranu alkoholem /np. C2H5OH
wytrącanie białek etanolem
Dodanie odpowiednio du\
ej ilości rozpuszczalnika  mo\
na frakcjonować cząsteczki o du\
ej wielkości
np. 30-38% etanolu  wytrącanie cząsteczek du\
ych dekstranu dodanie kolejnych 10% - średnie
cząsteczki dekstranu, kolejne 20% dekstran kliniczny /mniejszy/. W roztworze pozostają cząsteczki
najmniejsze.
- dodanie soli nieorganicznej
np. wysalanie białka /NH4/ 2 SO4 póz
niej trzeba roztwory odsolić na drodze dializy
- dodanie polielektrolitu
np. polietylenoiminy do wytrącania białek
- wprowadzenie niejonowego hydrofil. polimeru organicznego
np. wytrącanie białek przy u\
yciu PEG
- przez zakwaszenie  wytrącenie w punkcie izoelektrycznym
np. synteza kwasu asparaginowego /otrzymywanie z kwasu fumarowego i NH3/
Zakwaszając roztwór uzyskuje się przy ph 4-5 wytrącenie reszt kwasu fumarowego /substrat/
Dalsze zakwaszenie  poni\
ej 3 wytrąca się czysty produkt  kwas asparaginowy.
Metody te tak\
e stosowane są w początkowych fazach oczyszczania produktu.
TECHNOLOGIA BIOPRODUKTÓW
Aminokwasy Pozyskiwanie aminokwasów:
H 1.synteza chemiczna  w jej wyniku powstaje
R  C  COOH mieszanina racemiczna, a my potrzebujemy
NH2 formę L, czasem D (niektóre antybiotyki
półsyntetyczne penicyliny, jest problem przy ich
rozdzieleniu.
Rozdzielenie form D i L
D i L  aminokwas przeprowadza się w formę acylową lub amidową.
Forma acylowa ceramiczna u\
ycie enzymu, który degraduje formę acylową L np. aminoacylaza
/grzyb Aspergilluss oryzae/ powst. L aminokwas + acylo  D  aminokwas /ten do racemizacji
acylo  DL  aminokwas/
amid  DL  aminokwas amid  D  aminokwasu / D  aminokwas/.
Kolumny chromatograficzne na L I D
1.Synteza chirollna od razu powstaje forma L lub D, bardzo droga metoda, dlatego nie stosowana
/jedynie prace badawcze/. Wykorzystanie odpowiednich substratów.
2.Hydroliza białek
np. peptonów /tryptony, hadrony/, mannany / kukurydza/, wołowina, kazeina /białko mleka.
3.Fermentacja  metoda starsza, technologia mikrobiologiczna /u\
ycie bakterii/; substraty to cukry.
4.Synteza enzymatyczna otrzymywanie czystych aminokwasów np.
otrzymywanie kwasu asparaginowego z kwasu fumarowego.
Ad.2.
Hydroliza kwasowa  prostsza, ale niektóre aminokwasy tracą swoje właściwości np. tyrozyna,
fenyloalanina mieszanina niepełnowartościowa.
Lepiej stosować hydrolizę enzymatyczną  np. pepsyna, cudo-egzopeptydazy otrzymamy mieszaninę
pełnowartościową.
Produkcja:
najwięcej  kwas glutaminowy (500 tys. ton rocznie)
lizyna (100 tys. ton rocznie)
Procesy fermentacji:
kwas glutaminowy  wykorzystuje się C. glutamicum  glukoza
B. Flaum  kwas octowy
56
lizyna  B.lactofermentum glukoza
kwas asparaginowy  E. Coli otrzymuje się z kwasu fumarowego
ok.156g/l (komórki immobilizowane)
�!
Kwas glutaminowy:
Biotyna  decyduje o morfologii i syntezie kwasu glutaminowego przez bakterię Corynebacterium
glutamicum.
Stę\
enie ni\
sze poni\
ej 5 �g/l (optimum 2,5) biotyny powodują powstanie membrany komórkowej, która
jest przepuszczalna dla kwasu glutaminowego. Skład chemiczny membrany jest niekorzystny dla
komórki.
Następuje wyciekanie kwasu glutaminowego występuje jego nadprodukcja.
Du\
e stę\
enie biotyny (ponad 5 �g/l) błona pełnowartościowa, kwas glutaminowy pozostaje w
komórce, hamuje swoją syntezę i nie ma nadprodukcji.
Odwrotnie jest z kwasem mlekowym /produkt uboczny/ du\
o biotyny nadprodukcja kwasu
mlekowego, bo wychodzi na zewnątrz.
Melasa  zawiera du\
o biotyny, dlatego nie jest stosowana do produkcji kwasu glutaminowego.
Sposoby do zmuszania komórek do nadprodukcji kwasu glutaminowego
- dodanie antybiotyku /penicyliny, cykloseryny/ wpływa na budowę ściany komórki występuje
niewielka nadprodukcja
- mutageneza nienasyconych kwasów tłuszczowych tak, jak przy deficycie biotyny /zaburzenie
budowy bł./
- dodanie nienasyconych kwasów tłuszczowych te\
występują zmiany w budowie ściany komórki
- mutanty niesyntezujące glicerolu, trzeba dodać do podło\
a. Ograniczony dodatek glicerolu błona
komórkowa niekompletna wydzielanie kwasu glutaminowego
Błona komórkowa powstaje z glicerolu i nienasyconych kwasów tłuszczowych
izocytrynian NADP L-glutaminian
CO2 + alfaketoglutaran NAD PH2 alfaketoglutaran +NH4+
(2  oksoglutaran)
Proces ten zachodzi obok cyklu Krebsa /cykl anaplerotyczny/. U C. glutaminom  brak typowego cyklu
Krebsa. Zachodzi w/w cykl anaplerotyczny  jest krotny.
Wzrost syntezy kwasu glutaminowego następuje w sposób równomierny, ze zmniejszonym stę\
eniem
glukozy.
Powstaje produkt uboczny  kwas mlekowy i 2-ketoglutaran. Proces trwa 3 dni. Trzeba dostarczać tlenu,
bo inaczej powstawałoby du\
o kwasu mlekowego.
Wykorzystanie kwasu octowego w syntezie kwasu glutaminowego następuje pod koniec fazy wzrostu. W
fazie stacjonarnej kwas octowy jest dozowany /ciągle lub okresowo/, następuje ciągłe powstawanie
kwasu glutaminowego. Proces prowadzi się dłu\
ej 4-5dni. Otrzymuje się wy\
sze stę\
enie produktu.
Gdyby odbierało się produkt to jeszcze mo\
na byłoby wydłu\
yć proces.
Lizyna.
C.glutamicum z glukozy produkuje się lizynę, są auksotrofami homoserynowo- i leucynozale\
ne,
niektóre są mutantami AEC  opornymi /opornymi na aminoetylocysteinę/. Wykorzystywany jest te\

kwas octowy.
Szczepy są połączonymi mutantami auksotroficznymi, opornymi najlepsze szczepy produkcyjne.
Stę\
enie kwasu octowego na niskim poziomie /ciągle dostarczany/
W fazie wzrostu produkcja lizyny niewielka
Faza wzrostu wolniejsza zasadniczy przyrost stę\
enia lizyny
Kwas asparaginowy
57
COOH COOH
+
CH NH4 CHNH2
+
CH CH2
COOH COOH
kw.asparaginowy
kw. fumarowy
Często u\
ywa się jego soli amonowej
COHN4
pH 8, 5 - 9 (aspartaza)
CH kw. asparaginowy
CH pH 7 (hydroliza) (E.Coli)
COHN4
Substrat wygodniejszy, bo nie u\
ywa się amoniaku. Oba procesy mają podobną wydajność.
Mutanty E.Coli K12, B15  najstarsze, bezpieczne.
K12 wiele mutantów do tej technologii i do in\
ynierii genetycznej. Kolejny etap, to u\
ycie
transformantów /poddana zabiegowi in\
ynierii genetycznej/ tych mutantów.
Zawierają one du\
o aspartazy wydajność prawie 100%, to jednak wprowadzenie dodatkowej kopii
genu aspartazy wpłynęło na szybkość, a nie na wydajność procesu.
Mutanty E.Coli B715 wykorzystanie reakcji PCR do otrzymania du\
ej kopii genu aspartazy.
Promotor faga T7 odpowiedzialny za ekspresję genu aspartazy, otrzymany w ten sposób transformant
ma największą szybkość przyrostu ju\
w pierwszych 15 minutach. Szczep B715  2 godziny /przed
transformacją/.
Komórki E.Coli są immobilizowane w \
elu alginianowym, zarówno fumar jak i asparaginian mają du\
e
powinowactwo do jonów Ca2+ powoduje to rozpuszczenie alginianów (zabierają jony Ca2+). U\
yto \
ele
chitynozowe.
Technologia kultur in vitro kultur i organów zwierzęcych.
Zarys rozwoju hodowli.
1885  przechowywanie komórek zarodków kurzych w roztworze NaCl
1916  opracowanie trypsynizacji  trypsyna  enzym proteolityczny, rozpuszczanie białek /kolagen/ w
lepszych komórkach, rozpuszczanie tkanek, wytworzenie zawiesiny pojedynczych komórek
1940  wykorzystanie antybiotyków  osłaniające działanie na komórki zwierzęce
1948  wyprowadzenie klonów mysich fibroblast.
1897  utrzymywanie przy \
yciu komórek krwi w osoczu /zawiera wszystkie niezbędne składniki do
wzrostu komórek, w kulturach in vitro osocze stanowi podło\
e
1965  po\
ywka bez dodatku surowicy; kupuje się je gotowe, związane jest to ze standaryzacją składu
po\
ywki, musi być pozbawione czynników zakaz
nych /bakterie, wirusy, mikoplazma/
Osocze pozyskiwane było z ró\
nych z
ródeł, w kolejnych doświadczeniach mo\
na było się spodziewać
ró\
nych wyników /inny skład chemiczny/; zawiera szereg białka wytwarzanego przez układ
immunologiczny.
y
ródłem C jest glukoza, związki peptydowe, białkowe niezbędne do rozwoju komórki i hormony,
regulatory wzrostu. Aby zestawić taki skład, jest to proces kosztowny.
Kierunek, który w praktyce przyniósł szeroki rozwój np. przeciwciała monoklinalne
1952  ciągła linia komórkowa Hela /rak szyjki macicy/
1955  opracowanie po\
ywki Eagle a
1961  hodowla ludzkich fibroblastów
1965  fuzja komórek ludzkich i mysich
1975  produkcja przeciwciał
1987  wprowadzenie na rynek A
PA z hodowli in vitro
Przykłady produktów biotechnologii komórek zwierzęcych
1) Komórki:
58
 - sztuczna skóra  ekwiwalent skóry, twór identyczny lub bardzo zbli\
ony, wytworzony w sztucznych
warunkach, realizowany w licznych ośrodkach
- limfocyty
- szpik kostny
2) Szczepionki wirusowe:
wytworzone przez namno\
enie cząstek wirusowych w komórkach zwierzęcych, najwcześniej rozwinięty
- ok.10 dla ludzi
- ok. 30 dla zwierząt
3)Przeciwciała monoklonalne.
4) Limfokiny
- interferony alfa, beta, gamma
- interleukiny 1, 2, 3
- czynnik aktywujący makrofagi
- czynnik nekrozy nowotworów
- czynniki stymulujące kolonie
5) Hormony polipeptydowe
- insulina
- hormon wzrostu
- erytroporet
6)Enzymy: Tkankowy aktywator plazminogenu +PA
biomasa
4
3
2 5
1
1 6 12 czas w miesiącach
10 30 60 liczba generacji
1.Hodowla pierwotna normalnych komórek diploidalnych jednorazowa hodowla komórek, które zostały
pobrane z tkanki, poddane tryptynie /rozpuszcz./, zawieszone w podło\
u niezbędne by uzyskać
równomierne rozproszenie.
Zasiedlają powierzchnię naczynia i tworzą pojedynczą warstwę, nie ma
tkanki, jest tzw. monowarstwa; nieliczne, np. limfocyty mogą rozwijać się w
całej objętości
Pierwowzór zwykłej butelki do mleka. Cała wewnętrzna powierzchnia
butelki jest porośnięta, dzięki obrotom butelki na wałkach.
Mo\
e być prowadzona przez krótki okres 3-4 dni, mamy kilka pokoleń komórek, kultura obumiera.
Chcąc uruchomić produkt jakiegoś białka lub szczepów, ka\
dorazowo wyprowadzano tkankę, teraz
postępuje się inaczej.
2.Hodowla wtórna  szczep komórki diploidalnej
Dzięki wykorzystaniu po\
ywek mo\
l?,10 6 - namno\
enie komórek ludzkich.
Namno\
enie wymaga tryptynizacji
59
2 pasa\
+ tryptynizacja
Ale nie mo\
na tak w nieskończoność.
Komórki obumierają /podło\
e genetyczne zakodowana śmierć generacji/ do 40 generacji.
3.Transformacja komórek.
Podobnie do wytwarzanych; zmiany w komórkach czynią je nieśmiertelnymi, mogą rozmna\
ać się bez
przerwy. Mówi się o linii ciągłej komórek, są najlepszym materiałem dla procesów ciągłych. Konieczne
jest pasa\
owanie.
4. Ustalona ciągła linia komórek  transformowa
5. Obumieranie hodowli wtórnej
Transformowane linie komórek zwierzęcych
- heteroploidalność /ró\
ne proporcje/
- tendencja do nowotworzenia
- utrata specyficznych markerów tkankowych, mogą być hodowane w zawiesinie, nie potrzebują
pasa\
owania i tryptynizacji
- mniejsze wymiary i bardziej owalny kształt
- zmniejszone adherencje
- tendencja do wzrostu w zawiesinie
- wzrost szybkości rozmna\
ania
- mniejsze zapotrzebowanie na składniki osocza
- zmiana zapotrzebowania na czynniki wzrostu
- zmiana reakcji na czynniki regulator. rozprę\
enie energetyczne i wzrost przyswajania z
ródła C i energii
- zmiana efektywności syntezy produktu selekcja bardziej wydajnych linii
Linie ustalone /transformowane/ komórek heteroploidalnych
nazwa z
ródło morfologia produkt
BHK-21 nerka chomika fibr szczepy weter.?
Bores nowot. człowieka epit t  PA
C 12 pierś myszy fibr/epit 4GH
Systemy produkcji interferonu
typ hodowlany typ komórkowy produkt wydajność U/mg białka
Pierw. Leukocyty IFN-alfa (Le) 5x10 4
Bakteryjne ró\
ne 10 7
Hodowla komórek adherentnych
- nieruchoma butelka
- butelka na rolkach
- butelka z rowkami
- zbiornik ze szczelinami /włóknami/
- bioreaktor z podło\
em z kuleczkami szklanymi /wymag. fenidyzacji, bo są cię\
kie, strumień od dołu
utrzymuje w całej objętości/, inne materiały nie wymagają fenidyzacji/
Naczynia szklane, mieszadło lub ustawienie na mieszadełku magnetycznym; napęd od góry /musi być
napęd/.
Gaz mo\
e być dostarczany wytłoczonym wałem od góry, błony hydrofobowe przepuszczają dla
pęcherzyków gazu.
Doprowadzenie gazu nad powierzchnię po\
ywki powierzchnia wymiera, układ bardziej
heterogeniczny.
Nale\
y zoptymalizować skład mieszaniny kultur, jednak zapotrzebowanie na O 2 jest najni\
szy w
porównaniu z roślinami lub bakteriami, wolniejszy jest metabolizm, nie ma problemu z niedotlenieniem.
Bioreaktor z kuleczkami szklanymi
Mikronośnik do hodowli komórek zwierzęcych.
U\
ycie zmodyfikowanego dekstranu, gr. amidowa etylowego ma ładunek, dzięki którym następuje
immobilizacja komórek zwierzęcych na powierzchni kuleczek.
60
Są kuleczki o średnicy 0,2 mm
- \
elatyna
- celuloza mikrogranulowana
- polistyren /opłaszczony kolagenem/
- paliamyloamid gr.dimetyloaminopropylowe
- plastik opłaszczony szkłem
Namno\
enie komórek zwierzęcych: gęstość kom./mil
Hodowla komórek adherencyjna
- butelki 1x106
- wpakowane zło\
a kuleczek 2-3x106
- mikronośnik 3-10x106
- wydrą\
one włókna 107 -108
Klasyczna hodowla zawiera 1-3x106
Układ perfuzyjny
- z filtrem obrotowym 7x106 /mo\
liwe jest oddzielenie produktu od
- bioreaktor membranowy 5x107 podło\
a przez układ membranowy/
- kapsułki / mikrosfery 5-10 x107
- wydrą\
one włókna 1x108
Optymalny proces biosyntezy produktów białkowych w hodowli komórek zwierzęcych in vitro.
kultura wyjściowa zasilenie podło\
a o zoptymalizowanym
200 L/doba składzie
5x106 kom/ml
�! ( proces ciągły ) �!
bioreaktor perfuzyjny
objętość hodowli 50l
gęstość komór 2x107 kom/ml
ilość komórek w bioreaktorze 1212
produktywność 100g/dobę
�!
ultrafiltracja
�!
supernatant
�!
chromatografia
�!
produkt
C2H5
+
dekstran O CH2 CH2 HN
C2H5
dermacel
C2H5 C2H5
+ +
dekstran O CH2 CH2 N O CH2 CH2 HN
C2H5 C2H5
Etapy technologii szczepionek wirusowych
1.Przygotowanie po\
ywek
2.Powiększenie skali hodowli
- hodowla mini komórek
- namno\
enie wirusa
3.Hodowla produkcyjna
- bioreaktor
61
 - nośnik
- po\
ywka, O2, CO2
- warunki mieszania
4.Namno\
enie komórek ,Namno\
enie wirusa
5. Izolacja i oczyszczenie wirusa - atenuacja /pozbawienie podstawowych cech chorobotwórczych/
6.Inaktywacja wirusa /zabicie/
7.Dodatek adiuwantów i konfekcjonowanie
Sposoby inaktywacji
- formaldehyd
- aldehyd glutarowy
- UV
- temp.60�C
- �  propionolakton
- acetyloetylenoimina
Szczepionka polio
Zamro\
enie komórek
-najlepiej nerki
VERO
diploidalne ludzkie
�!
Namno\
enie wstępne komórek
- w kolbach Roux
np. 1szt. 4szt. 16szt.
/trypsynizacja/
- w bioreaktorze /Cytodex 1/
3-40 L /tryptyn/
�!
Bank komórek produkcyjnych
/5-108 kom/25ml po\
ywki/
+ 5% DMSO, zamro\
one
�!
hodowla produktu komórkowego w bioreaktorze
100 1000 L
Odwirowanie i przechowywanie komórek
Namno\
enie wirusa w komórkach
Wydzielenie wirusa z hodowli /1000 l/
- filtracja wstępna
- filtracja membranowa /0,2�m/
Zawę\
anie /do 1 l/
- ultrafiltracja /105 MW/
Oczyszczenie  filtracja \
elowa
- Sepharose
- DEAE Sephadex A -50
Standaryzacja stę\
enia antygenu D /ok.15 L/
- rozcieranie w podło\
u 199
Inaktywacja
- formaldehyd 1:4000, ph 6,9 36-38�C
filtracja /0,2 �m po 6 dobach
dalsza inaktywacja, do 12-13 dób
Szczepienia monowalen?
62
Szczepienia trójwal?
antygen D typu 1,2 i 3 /40:8:32/
filtracja /0,2�m/
rozlewanie
Produkt
Biotechnologia regeneracyjna XXI wieku
skóra
chrząstki
kość
mięśnie
nerwy
Sztuczna  biowątroba /ex vivo/
wszczepienie komórki Langerhansa
Ekwiwalent skóry /naskórka/
Pobranie i namno\
enie in vitro monowarstwy fibroblastów
nie zawiera monowarstwy kolagenu.
Gąbczasty ekwiwalent kolagenowy
Wytworzenie gąbczastej matrycy \
elowej przy u\
yciu odczynników \
elujących
np. 72% kolagenu
8% 6-siarczan chondroityny
20% chitozanu
Kolonizacja przez fibroblasty
Przebudowa struktury matrycy w wyniku syntezy pozakomórkowego kolagenu
Wszczepienie keratynocytów
Wytworzenie warstwy naskórka
Biotransformacja steroidów
32 etapy reakcji chemicznych, by otrzymać kortyzon z kwasu dezoksycholowego
Koszt 200 dolarów / 1 gram
63
 64
Rhizopus /grzyb/-bierze udział w przemianie:
Progesteron 11 - hydroksyprogesteron
(11 alfa  hydroksylacja)
Zmniejszenie liczby procesów do 11 / 10 w zale\
ność od tego jaką chcemy otrzymać gr: -OH czy C=O
Koszt 1 dolar / 1 gram
Wykorzystujemy do otrzymania steroidów tak\
e diosgeninę /surowiec roślinny/.
Mikrobiologiczna degradacja łańcuchów bocznych
*zmienia gr.  OH na  OC
*utlenia lub redukuje wiązania podwójne
/ w pozycji 12 gr. COCH3, CO, COOH, zmiana pierścienia 5-członowego
na 6-członowy/
Triemcinolon
CH2OH
O
OH
HO
F OH
O
9ą-fluoro-11-�-16ą,17ą, 21-androsten-3,17-dion
Otrzymywany z 9alfa- hydroksyandrostan -3 ,17 dionu
Rhizopus alfa-hydroksylacja
beta-hydroksylacja
Absidia orchidis alfa lub beta-hydroksylacja w zale\
ności od substratu
*brak gr.  OH w pozycji 17 11alfa-hydrokortyzon
*obecność gr.  OH w pozycji 17 11beta-hydrokortyzon
Biotechnologia roślin /biotechnologia kultur in vitro/
Biotechnologia roślin zajmuje się praktycznym wykorzystaniem roślinnych kultur w ogrodnictwie,
rolnictwie, leśnictwie /mikropropagacja, selekcja cennych odmian/ i w przemyśle farmaceutycznym
/produkcja związków naturalnych pochodzenia roślinnego tj. metabolitów wtórnych/.
Kultury in vitro /kultury tkankowe/ - oznacza sposób prowadzenia /uprawiania/ roślin lub ich
fragmentów poza środowiskiem naturalnym. Są to hodowle protoplastów, komórek lub tkanek lub
organów roślinnych na sztucznych podło\
ach w sterylnych, ściśle określonych warunkach /temperatura,
wilgotność, oświetlenie/.
Totipotencja komórkowa  zdolność do odtwarzania całej rośliny z pojedynczych komórek
somatycznych lub protoplastów, a więc wykorzystanie pełnej informacji genetycznej komórek.
HISTORIA
Wiek XIX  Schleiden, Schwann, Vir -kom. bud. Totipotencji
1962 r.  mineralne podło\
e do kultur roślinnych  Murashige i Skoog
1963 r.  Hildebrandt, Riker  generacja roślinek march.? Kato, Katenchi regeneracja tytoniu
1965 r.  Murashige  klonalne mikrorozmna\
anie storczyków
1973 r.  Agrobacterium tumefa  odkrycie plazmidów /wykorzystywany do otrzymywania tych
plazmidów/
Agrobacterium rhizogenez  plazmid Ri indukuje tworzenie korzeni włośnikowych
Podstawowe typy kultur:
*kultury kalusowe  zawsze od nich zaczynamy
Kalus  komórka tkanki niezorganizowanej, bezkształtna masa, mo\
na z niej otrzymać
inne komórki
Eksplantat  fragment rośliny /liście, korzenie, wierzchołek pędu, merystem wierzch
65
najlepszy, bo bez wirusów. Trzeba go odkazić /najlepiej rozcieńczonym
Domestosem, opłukać wodą jałową/. Umieścić na podło\
u /cukier, związki
azotu: NH4+ lub NO3-,PO43-, mikro-, makroelementów, hormony rośl-auksyny,
cytokiny.
Kultury korzeni transformowanych = transgenicznych, włóknikowych  nie muszą zawierać regulatorów
wzrostu. Ich dodatek mo\
e być korzystny, dlatego czasem się dodaje.
*kultury zawiesinowe  otrzymuje się poprzez wprowadzenie tkanki kalusowej do podło\
a ciekłego w
kolbie. Ten typ hodowli najbardziej interesuje biotechnologa, poniewa\
łatwo się prowadzi kultury i
mo\
na w bioreaktorach.
*kultury organów:
- pędów
- pędów transformowanych /transgenicznych/
- korzeni
- korzeni transformowanych zainfekowane korzenie lub kallus bakterią Agrobacterium rhizogenez
plazmid R i trafia do chromosomów roślinnych i mo\
e wywołać dość zró\
nicowany efekt:
wytwarzanie związków, których roślina nie wytwarzała /są one potrzebne bakterii/ są to spiny
zwiększona synteza określonego metabolitu.
Korzenie transformowane tracą geotropizm /rosną we wszystkich kierunkach/. Niektóre kultury np.
szałwia /tylko do dołu/, inne tylko do góry
*kultury roślinne
Biotechnologia uprawa roślin
- szybkie doskonalenie geotypów
- konstruowanie nowych fenotypów
- mikrorozmna\
anie identycznych genotypów
- uniezale\
nienie się od:
warunków agro-,klimatycznych,
wartości politycznych, geopolitycznych,
sezonowości zbiorów,
ró\
nic w plonach
- skrócenie cyklu produkcji /nie lata, a tygodnie/
- lepsza kontrola warunków biosyntezy
- mo\
liwość wy\
szej koncentracji produkcji
- mo\
liwość biosyntezy nowych związków
- mo\
liwość jednoetapowych biotransformacji
Etapy opracowywania przemysłu biotechnologii komórek roślinnych
rośliny dzikie lub uprawne
�! selekcja
rośliny wyró\
niające się wysoką zawartością poszczególnego produktu
�!
izolacja fragmentu rośliny /kallus/
�!
hodowla pierwotna kallusa
�!
hodowla wtórna kallusa /wyselekcjonowanie materiału najbardziej
odpowiedniego/
�!
hodowla zawiesinowa
�! selekcja klonów
modyfikacja genetyczna
testowanie stabilności
wyselekcjonowany szczep /linia komórkowa/
�! optymalizacja po\
ywki i warunków hodowli
66
powiększanie skali
hodowla w bioreaktorze
�! izolacja produktu
produkt /bardzo mało, bo gromadzi w komórkach i nie wydziela
na zewnątrz/
Skala opracowanych technologii
Bioreaktor /l/ Kultura Produkt
85 Cataranus rosens alkaloidy indolowe
200 Coleus Blunei kwas rozmarynowy
300 Digitalis lanata �  metylodigoksyna
1000 Lithospermum erythrorhizon szikonina /barwnik
p/bakteryjny w kosmetykach/
2000 Panax ginseng biomasa / saponiny
20000 Nicotiana tabacum biomasa / nikotyna
75000 Rauwolfia serpentina alkaloidy indolowi
75000 Echinacea purpurea polisacharydy immunogenne
Kryteria opłacalności produktu w kulturach roślinnych in vitro
Parametr Wartości osiągane Wartości po\
ądane
Biomasa /g s.m./L/ 5-15 /30/ > 40
Stę\
enie produktu /g/L/ do 7 > 1
Wielkość produkcji /kg/rok/ > 1000 np. szikonina
Koszt produkcji /US dolar/ 1500-3000 < 500 kwas rozmarynowy
Cena produkcji /US dolar/ 30-5000 > 1000 - du\
a wydajność
produkcji
Opłacalne są biotechnologie bardzo drogich produktów, np. alkaloidy barwinka /do tej pory nie udało się
opracować biotechnologii/. Udało się opracować biotechnologię paklitakselu z komórek cisa.
Przykłady nadprodukcji metabolitów roślinnych in vitro.
Produkt / roślina w rośl. % s.m. Prod. in vitro % s.m. g/l Ajmalina /
Catharantus roseus 0,3 1 0,3
Antocyjany /vitis sp 0 16 0,8
Antrachinony /Morinda vitrifolia 2,2 18 2,5
Berberyna /Captis japonika 4 13 1,4
Kwas rozmarynowy /Colens blumei 3 25 5,6
Kwas szikonowy / Gallium mollugo 0 10 1,2
Saponiny / Panax ginseng 4 27 ponad 1
Serpentyna / catbarantus rosens 0,5 0,8 0,2
Szikonina / Lithospermum erythorhizon 1,5 23 6,4
Postęp w produkcji kwasu rozmarynowego z Coleus blumei
Etap p Produkt
% g / l /dobę  produktywność
rośl. 1,1
linie komórkowe 2,9 0,02
optymalizacja podło\
a 15 0,25
proces 1- etapowy 13,6 0,45
proces 2  etapowy 21 0,91
/oddzielenie etapu wzrostu
i syntezy/
67
 Produkcja szikoniny:
- czerwony barwnik o właściwościach p/ zapalnych, p/bakteryjnych
- występowanie w korzeniach roślin  szikon Lithospermum erythrorhizon w ilości 1-2% s.m.
- zastosowanie w kosmetykach
- cena 4500 USD / kg
- zapotrzebowanie /Japonia/ 150 kg / rok
- biotechnologia  zwiększona wydajność:
1.selekcja linii komórkowej x25
2.opracowanie podło\
a x 2,8
3.optymalizacja procesu x 5,33
---------------
x372
spadek ceny do 4000 USD / kg, technologia nadal droga, ale opłacalna
Biotechnologia roślin stosowanych w skali przemysłowej
obecnie stosowane:
- ginsenozydy
- paklitaksel
- szikonina
Zabiegi zwiększenia produkcji metabolitów wtórnych
- dodatek elicytorów
- dodatek prekursorów
- immobilizacja komórek
- agregacja komórek
- zwiększenie liczby kopii genów biorących udział w syntezie związków
- przeprowadzenie reakcji biokonwersji
Elicytory  substancje wywołujące stres = czynniki wywołujące aktywność odpowiedzi
roślin na zewnętrzny czynnik stresowy.
Typy elicytorów:
- biotyczne (składniki ścian komórek grzybów, glonów oraz wytwarzane przez nie
enzymy, lipidy)
- abiotyczne (mechaniczne zranienie rośliny, metale cię\
kie, UV
Działalność zale\
y od:
- jego rodzaju
- dawki
- czasu działania
- rodzaju metabolitu
- fazy wzrostu kultury
- innokulum
Najczęściej stosowane:
- całe kultury grzybów strzępków.
- supernatanty ich płynów pohodowlanych
- autoklawowi biomasa grzybów, hydrolizatory ścian komórek
- glony i ich hydrolizatory
- ekstrakty dro\
d\
owe
- polisacharydy: chitozan, alginian
- enzymy grzybowe (celulaza, pektynaza)
- metale cię\
kie, promieniowanie UV
68