Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
Porównanie budowy komórki roślinnej i zwierzęcej
Najmniejszym elementem \
ywego organizmu, którego organizacja umo\
liwia
dokonywanie się pełnej przemiany materii, jest komórka. Wprawdzie między komórkami
ró\
nych organizmów, a nawet ró\
nych tkanek jednego organizmu, występują znaczne ró\
nice,
jednak wszystkie komórki wykazują podstawowe wspólne cechy budowy i zawierają typowe
twory podkomórkowe, pełniące określone funkcje biochemiczne. Jak wynika z obrazu
widzianego w mikroskopie optycznym, komórka, bez względu na pochodzenie, stanowi otoczony
błoną twór wypełniony cytoplazmą, w której zawieszone są organelle.
Poni\
ej zamieszczono uproszczony! opis wa\
niejszych struktur komórkowych
charakterystycznych dla komórek roślinnych i zwierzęcych. Opis ten ma jedynie pomóc
Studentom w usystematyzowaniu wiedzy zdobytej na wykładach z biologii komórki, biochemii
oraz kultur tkankowych i komórkowych roślin i zwierząt.
1. Budowa komórki roślinnej i zwierzęcej.
a. Jądro komórkowe  jest organellą zawierającą informację genetyczną odpowiedzialną
za regulację metabolizmu, wzrostu i ró\
nicowania się komórki. Materiał genetyczny zawarty w
podstawowym, haploidalnym zespole chromosomów określa się jako genom jądrowy. Jądro
komórkowe poło\
one jest zwykle w centralnej części komórki i w zale\
ności od jej typu posiada
kształt kulisty, owalny lub soczewkowaty. Jądro występuje w zasadzie jako pojedyncza
organella, choć istnieją komórki, które w pewnym okresie swego \
ycia sÄ… pozbawione jÄ…dra (np.:
dojrzałe erytrocyty) lub takie które zawierają więcej ni\
jedno np.: dwujądrowe komórki wątroby
czy wielojądrzaste włókna mięśni szkieletowych.
Jądro komórkowe składa się z macierzy jądrowej zwanej nukleoplazmą, chromatyny
jądrowej oraz jąderka. W interfazie jądro komórkowe osłonięte jest dwiema błonami tworzącymi
specyficzną otoczkę. Zewnętrzna błona otoczki jądrowej połączona jest z błoną retikulum
endoplazmatycznego (ER), a na jej powierzchni od strony cytoplazmy mogą znajdować się
rybosomy. Błony  zewnętrzna i wewnętrzna  łączą się ze sobą w miejscu oktagonalnych
kompleksów porowych, zło\
onych z ponad stu ró\
nych białek. Pory jądrowe umo\
liwiajÄ… szybkÄ…
wymianę mRNA, podjednostek rybosomów, czynników transkrypcyjnych czy jonów pomiędzy
przedziałem jądrowym a światłem siateczki śródplazmatycznej lub cytozolem.
Macierz jądrowa jest roztworem białek, cukrów, jonów i nukleotydów, w którym
zawieszona jest chromatyna, jąderko oraz białkowy szkielet utrzymujący kształt jądra i
usztywniający osłonkę jądrową.
Chromatyna jÄ…drowa zbudowana jest z helikalnie splecionej nici DNA zwiÄ…zanej z
białkami histonowymi i niehistonowymi. Podstawową jednostką strukturalną chromatyny jest
nukleosom, zło\
ony z ośmiu białek histonowych, wokół których owinięta jest cząsteczka DNA o
długości 166-200 par zasad. Pomiędzy nukleosomami znajdują się łącznikowe odcinki DNA o
długości od 10 do 95 par zasad. Nić nukleosomowa splata się wokół siebie formując solenoid,
czyli tzw. właściwe włókno chromatynowe, które następnie wytwarza pętle wy\
szego rzędu, tzw.
domeny mogące ulegać dalszej kondensacji.
Z uwagi na organizację strukturalną i funkcje wyró\
nia siÄ™ dwa rodzaje chromatyny:
luz
ną euchromatynę, zło\
oną z całkowicie rozwiniętych odcinków chromosomów i czynną
transkrypcyjnie, oraz skondensowaną heterochromatynę, nie posiadającą odcinków kodujących.
W cyklu komórkowym jądro podlega zło\
onym przemianom, które odbywają się w dwóch
okresach: okresie podziału, kiedy chromatyna ulega kondensacji w chromosomy podziałowe, i w
okresie interfazy, kiedy jądro się nie dzieli. Podział chromatyny i jej rozdzielenie do jąder
potomnych następuje na drodze mitozy lub mejozy.
Wewnątrz jądra komórkowego znajduje się jąderko będące nieobłonionym, gęstym,
kulistym ciałem zawierającym RNA oraz białka. W jąderku zachodzi synteza prekursorowego
rybosomowego RNA, a następnie formowanie podjednostek tworzących rybosomy. Wielkość
jÄ…derek zale\
y od stopnia zaanga\
owania komórek w syntezę białek  stąd te\
jądra komórek
intensywnie syntetyzujących białka cechują się obecnością du\
ych jąderek, których objętość
mo\
e dochodzić do 25% objętości jądra.
b. Plastydy  typowe organelle komórek roślinnych, częściowo niezale\
ne od informacji
genetycznej jądra komórkowego. Organelle te pojawiły się w komórce w wyniku endosymbiozy
sinic, przy czym w toku ewolucji oprócz cech typowych dla endosymbionta, uzyskały równie\

cechy swoiste dla plastydów. W dojrzałej roślinie wyró\
nia siÄ™ plastydy fotosyntetyzujÄ…ce -
chloroplasty oraz plastydy niefotosyntetyzujÄ…ce m.in. chromoplasty, leukoplasty i amyloplasty.
Wszystkie typy plastydów zawierają dwie błony tworzące otoczkę, która ogranicza
wnętrze plastydu, zwane stromą. W stromie ka\
dego plastydu zwykle znajdujÄ… siÄ™ m.in.
tylakoidy (spłaszczone cysterny zawierające np. u chloroplastów barwniki fotosyntetyczne),
rybosomy, obszary nukleoidopodobne z plastydowym DNA oraz ziarna skrobii.
Chloroplasty to dyskowate twory, w których wyró\
nia się dwa rodzaje tylakoidów 
tylakoidy gran z chlorofilem oraz tylakoidy stromy. Oprócz fotosyntezy, chloroplasty
odpowiadają za metabolizm skrobi, syntezę kwasów tłuszczowych, lipidów, asymilację
amoniaku czy pewne etapy szlaku syntezy glicerololipidów. Chromoplasty zawierają znaczne
ilości barwników karotenoidowych takich jak \
ółty ksantofil czy pomarańczowy karoten.
Plastydy te występują w komórkach roślin w postaci okrągłych ciałek lub nieregularnych płytek i
kryształów. Są one aktywne metabolicznie, zdolne do podziału, biosyntezy kwasów
tÅ‚uszczowych i karotenoidów, zwÅ‚aszcza ²-karotenu. Chromoplasty nadajÄ… barwÄ™ kwiatom,
owocom oraz korzeniom roślin. Leukoplasty, to niewielkie, bezbarwne plastydy, występujące w
pobli\
u jądra wyspecjalizowanych funkcjonalnie komórek, np. włosków epidermy. Ich
podstawową funkcją jest synteza monoterpenów czy te\
kwasów tłuszczowych, niezbędnych do
tworzenia wspomnianych włosków. Amyloplasty to sferyczne plastydy, zawierające w stromie
jedno, bÄ…dz
kilka du\
ych ziaren skrobi. Główną funkcją amyloplastów jest synteza i akumulacja
skrobi zapasowej.
c. Mitochondria  organelle zbudowane z dwóch systemów błon ograniczających jego
wnętrze, określane jako macierz mitochondrialna (matrix mitochondrialis). Błona zewnętrzna
mitochondrium nie le\
y bezpośrednio na błonie wewnętrznej, ale jest od niej oddzielona wąską
przestrzenią międzybłonową. Błona wewnętrzna wytwarza ró\
nej długości fałdy, grzebienie
mitochondrialne, które wystając do macierzy mitochondrialnej mogą się układać podłu\
nie,
prostopadle do osi organelli lub promieniście. Mitochondria stanowią centra energetyczne
komórki, przekształcając energię zmagazynowaną w materiałach zapasowych, takich jak
sacharydy, w adenozynotrifosforan (ATP). Stąd liczba mitochondriów w komórce eukariotycznej
jest zazwyczaj proporcjonalna do zapotrzebowania energetycznego oraz intensywności
metabolizmu tlenowego komórki.
Matriks mitochondrialna zawiera kompletne systemy enzymów cyklu kwasów
trikarboksylowych (cyklu Krebsa), enzymy przetwarzające pirogronian (końcowy produkt
glikolizy) w acetylokoenzym A. W matriks znajdują się równie\
enzymy przekształcające kwasy
tłuszczowe i aminokwasy do acetylokoenzymu A. W odró\
nieniu od innych organelli
komórkowych, mitochondria posiadają własny unikatowy DNA, który ró\
ni siÄ™ od DNA
jądrowego i zawiera geny specyficzne dla mitochondriów. Za translację mitochondrialnego
mRNA na białko odpowiadają rybosomy mitochondrialne, przy czym kod mitochondrialny
wyznaczajÄ…cy swoiste aminokwasy jest nieco zmieniony w stosunku do kodu jÄ…drowego 
zmianie ulega np. kodon stop. Typowe mitochondria dzielÄ… siÄ™ co najmniej raz w czasie cyklu
komórkowego, po wcześniejszej replikacji DNA zachodzącej w czasie interfazy, przy czym sam
podział rozpoczyna się od szczeliny podziałowej wytworzonej przez wewnętrzną błonę
mitochondrialnÄ….
d. Siateczka śródplazmatyczna (retikulum plazmatyczne, ER)  jest zbiorem
kanalików i cystern zamkniętych błoną, które rozciągają się na du\
ym obszarze cytoplazmy
wszystkich komórek eukariotycznych. W siateczce śródplazmatycznej zachodzą liczne procesy
biosyntezy, a błona ER uczestniczy w tworzeniu komórkowych błon plazmatycznych, aparatów
Golgiego, błon lizosomalnych, pęcherzyków wydzielniczych czy endosomów. Siateczka
śródplazmatyczna występuje w dwóch formach odznaczających się odmiennym działaniem, tzw.
gładkiej siateczki śródplazmatycznej (smooth endoplasmic reticulum, SER) oraz szorstkiej
siateczki śródplazmatycznej (rough endoplasmic reticulum, RER). SER jest miejscem biosyntezy
wielu rodzajów lipidów: triglicerydów, glikolipidów, fosfolipidów, cholesterolu oraz jest
głównym przedziałem wewnątrzkomórkowego gromadzenia się wapnia. W SER powstaje tak\
e
rodzina enzymów detoksykacyjnych cytochromu P450, przy czym w zale\
ności od sygnałów
środowiska, enzymy w SER są szybko syntetyzowane i degradowane. Szorstka siateczka
śródplazmatyczna występuje w formie długich cystern, pokrytych od zewnątrz licznymi
rybosomami. Błona budująca cysterny RER oddziela ich treść od cytoplazmy i łączy się z
zewnętrzną błoną osłonki jądrowej. Światło kanałów RER jest miejscem, w którym zachodzi
synteza i modyfikacja białek eksportowych, czemu sprzyjają przebiegające tam procesy
potranslacyjnej obróbki białek, jak: glikozylacja, formowanie połączeń dwusiarczkowych,
fałdowanie łańcucha polipeptydowego i oligomeryzacja w podjednostki białkowe. Jeśli powy\
sze
etapy nie zachodzą dokładnie, białko nie wychodzi ze światła ER.
e. Aparat Golgiego  składa się z wielu płaskich błoniastych cystern uło\
onych w stos,
jedna nad drugą, i rozdętych pęcherzykowato przy końcach. Cysterny połączone są z szeregiem
ró\
nej wielkości pęcherzyków gładkich lub pokrytych białkiem. Aparat Golgiego jest
strukturalnie i funkcjonalnie spolaryzowany  cysterny le\
Ä…ce w bliskim sÄ…siedztwie szorstkiego
retikulum endoplazmatycznego określane są jako powierzchnia cis, tu\
za niÄ… znajdujÄ… siÄ™
cysterny powierzchni środkowej, a miejsce z którego pęcherzyki transportowe pączkują
nazywane jest powierzchnią trans. Aparat Golgiego pełni w komórce wiele podstawowych
funkcji związanych z procesem potranslacyjnej modyfikacji białek i lipidów przeznaczonych do
eksportu, a szczególnie procesem modyfikacji domen cukrowych uprzednio przyłączonych w
retikulum endoplazmatycznym. Aparat Golgiego, ponadto, bierze udział w syntezie składników
ścian komórek roślinnych, w sortowaniu i pakowaniu produktów eksportowych, formowaniu
błony komórkowej oraz procesie jej odzysku. Nowo syntetyzowana błona i białka wydzielnicze,
podobnie jak lipidy błonowe, które są glikolozowane, opuszczając retikulum endoplazmatyczne
wchodzÄ… do aparatu Golgiego przez powierzchniÄ™ cis, przesuwajÄ… siÄ™ przez stos Golgiego i
opuszczają aparat przez kanaliki i pęcherzyki tworzące sieć trans. W tym czasie przechodzą
szereg modyfikacji, których przerwanie lub zmiana mo\
e mieć swoje implikacje kliniczne.
f. lizosomy  to główne organelle trawienne komórki, otoczone pojedynczą błoną
komórkową, które zawierają specyficzne hydrolazy degradujące białka, lipidy, węglowodany i
kwasy nukleinowe. Jedną z charakterystycznych cech lizosomów jest niski odczyn ich wnętrza
(pH <" 5,0), utrzymywany przez zale\
nÄ… od ATP pompÄ™ protonowÄ…, generujÄ…cÄ… du\
e stÄ™\
enie
protonów we wnętrzu lizosomu. Stę\
enie protonów we wnętrzu lizosomów jest ok. 100 razy
większe ni\
w otaczającej je cytoplazmie, co zapewnia niezbędne środowisko dla poprawnego
funkcjonowania lizosomalnych hydrolaz. Co istotne, gdy dochodzi do mechanicznego
uszkodzenia lizosomów, ich zawartość miesza się z cytozolem (pH 7,2  7,3), co powoduje i\

aktywność lityczna hydrolaz natychmiast zanika, nie zagra\
ając składnikom cytoplazmy. Wśród
enzymów lizosomalnych znajdują się m.in.: rybonukleaza (trawi RNA), deoksyrybonukleaza
(trawi DNA), glikozydaza (rozkłada węglowodany, glikozydy, polisacharydy), fosfataza kwaśna
(estry fosforanowe), katepsyny (białka), lipazy (tłuszcze). Import materiałów do lizosomów,
które tam ulegają trawieniu, odbywa się na drodze: endocytozy - formowaniu pęcherzyków
endocytarnych wokół małych cząstek i płynów; autofagii  pochłonięciu i strawieniu całych
dysfunkcjonalnych organelli; fagocytozy  pochłanianiu większych cząstek, jak bakterie.
g. wakuole  system wakuolarny, zró\
nicowany co do wielkości, występuje w komórkach
roślinnych i zwierzęcych. W wyspecjalizowanej komórce roślinnej znajduje się najczęściej jedna
du\
a wakuola; w komórce zwierzęcej - cały system drobnych wakuol o niewielkich rozmiarach.
Wnętrze wakuoli, otoczone pojedynczą błoną, wypełnia woda wraz z substancjami
nieorganicznymi, organicznymi (metabolity pośrednie i wtórne) oraz substancjami zapasowymi
(białka, polisacharydy i tłuszcze). Skład soku komórkowego zale\
y od pochodzenia komórek
oraz stanu ich metabolizmu. Wa\
ną grupę związków soku wakuolarnego stanowią wspomniane
metabolity wtórne, których praktyczne znaczenie wynika z ich właściwości leczniczych oraz z
szerokiego wykorzystania przemysłowego. Do najwa\
niejszych grup związków nale\
Ä…:
glikozydy antocyjanowe, glikozydy flawonowe, alkaloidy (nikotyna, kokaina, strychnina) oraz
garbniki (pochodne wielofenoli).
h. cytoplazma  uznawana jest za swego rodzaju dwuskładnikowy koloid białkowo-
wodny, du\
ych i małych cząsteczek, w którym zawieszone są organelle komórkowe i który
zajmuje największą objętościowo część komórki. Cytoplazma podstawowa jest fazą wodną
komórki z rozpuszczonymi w niej składnikami takimi jak: kwasy tłuszczowe, białka,
aminokwasy, węglowodany, nukleotydy, związki mineralne. Cytoplazma w pobli\
u błony
komórkowej jest bardziej sztywna, natomiast jej część wewnętrzna jest zwykle płynna. W
macierzy cytoplazmatycznej wyró\
nia się 3 rodzaje białek włóknistych o zró\
nicowanej
budowie, składzie chemicznym oraz funkcjach, które tworzą cytoszkielet komórki; są to:
mikrotubule, filamenty i mikrofilamenty.
i. ściana komórkowa  oprócz plastydów, stanowi najbardziej charakterystyczny
wyró\
nik komórek roślinnych. Jest to wysoce zorganizowany materiał kompozytowy, zło\
ony z
wielu typów makrocząsteczek. Ściana komórkowa jest syntetyzowana przez protoplast i
odkładana w postaci zró\
nicowanych pod względem chemicznym warstw po zewnętrznej stronie
błony komórkowej. Ściana komórkowa wraz z błoną komórkową i cytoszkieletem, stanowi część
strukturalnego i funkcjonalnego kontinuum przenikajÄ…cego ka\
dą komórkę rośliny. Ściana
komórkowa kontroluje kształt i powiększanie się komórek, wpływa na transport
międzykomórkowy, jest szlakiem transportu i z
ródłem cząsteczek sygnałowych jak hormony
peptydowe, tlenek azotu czy reaktywne formy tlenu, bierze udział w reakcjach roślin na warunki
środowiska oraz pojawiające się inne organizmy. W skład ściany komórkowej wchodzą: matriks
(substancje podło\
a  pektyny, hemicelulozy, glikoproteiny), zrÄ…b (substancje szkieletowe 
celuloza, ksylany, chityna), substancje inkrustujące (ligniny, krzemionka, węglan wapnia),
substancje adkrustujące (lipidy  kutyna, suberyna, woski; polisacharydy  śluzy, gumy).
Wzajemne kontaktowanie siÄ™ \
ywych protoplastów sąsiadujących ze sobą komórek umo\
liwiajÄ…
pory w ścianach komórkowych, przez które przenikają pasma cytoplazmy tzw. plazmodesmy.
2. Obserwacja komórek roślinnych i zwierzęcych przy u\
yciu mikroskopu świetlnego.
2.1. Budowa mikroskopu świetlnego  zasady mikroskopowania.
W ka\
dym mikroskopie świetlnym mo\
na wyró\
nić układ mechaniczny oraz optyczny.
Częściami mechanicznymi mikroskopu są: statyw, tubus z urządzeniem rewolwerowym do
wkręcania obiektywów o ró\
nym powiększeniu oraz stolik przedmiotowy. W statywie
mikroskopu mieści się śruba makro- i mikrometryczna, które słu\
Ä… do przesuwania tubusa bÄ…dz

stolika przedmiotowego przy nastawianiu ostrości obrazu w mikroskopie. Układ optyczny
mikroskopu składa się z układu powiększającego (obiektyw, okular) i układu oświetlającego
(\
arówka bądz
lusterko oraz kondensor).
Obiektyw najistotniejsza część mikroskopu, jest zbiorem soczewek sklejonych ze sobą.
Obiektyw tworzy obraz rzeczywisty, odwrócony i powiększony. Obiektywy o powiększeniu 100-
krotnym i większym określane są jako obiektywy immersyjne. Oglądając preparaty z u\
yciem
takich obiektywów przestrzeń między soczewką czołową obiektywu a szkiełkiem nakrywkowym
nale\
y wypełnić cieczą immersyjną o du\
ym współczynniku załamania światła (większym od 1).
Zastosowanie immersji usuwa zjawisko załamywania się promieni świetlnych przy
przechodzeniu ze środowiska optycznie gęstszego (szkło) do środowiska rzadszego (powietrze),
co powoduje zaciemnienie pola widzenia.
Okular mikroskopu, zło\
ony jest z dwóch płasko-wypukłych soczewek, z których górna
powiększa obraz utworzony przez obiektyw, dolna natomiast zwiększa pole widzenia. Okular
tworzy obraz powiększony, urojony i prosty. A
ącznie, układ okular  obiektyw daje obraz
odwrócony, jaki powstał w wyniku działania obiektywu. W uproszczeniu, powiększenie
mikroskopu jest iloczynem powiększenia okularu i obiektywu. O przydatności mikroskopu do
badań w du\
ej mierze decyduje jego rozdzielczość. Zdolność rozdzielcza mikroskopu to
najmniejsza odległość między dwoma punktami preparatu, które dostrzegane są jeszcze
oddzielnie. Odległość ta musi mieć wymiar równy co najmniej długości fali światła u\
ytego do
oÅ›wietlenia preparatu. W przypadku Å›wiatÅ‚a widzialnego granica ta wynosi 0,5 µm.
2.2. Preparaty mikroskopowe.
Preparaty mikroskopowe mo\
na podzielić na bezpośrednie (przy\
yciowe), sporzÄ…dzone w
celu obserwacji kształtu, ruchu jak i ilości \
ywych komórek oraz na preparaty utrwalone,
wykorzystywane do dalszego barwienia w celu uwidocznienia poszczególnych organelli
komórkowych. Najlepsze wyniki obserwacji komórek daje analiza materiału \
ywego. Takie
obserwacje są podstawą większości ćwiczeń opisanych w niniejszym rozdziale skryptu. W
przypadku hodowli kultur jednokomórkowych przenoszone są one na szkiełko podstawowe za
pomocÄ… pipety pasterowskiej, ezy bÄ…dz
igły preparacyjnej. Roślinne hodowle tkankowe nale\
y
przygotować do obserwacji przez pocięcie tkanki na cienkie skrawki przy u\
yciu \
yletki lub
skalpela. Skrawki przenosi się za pomocą pęset bądz
igieł preparacyjnych na szkiełko
podstawowe i dodaje kroplę wody. W celu uzyskania jednej warstwy komórek wykonuje się
preparaty gniecione. Preparaty takie najczęściej wykonuje się z wierzchołków korzeni i pędów,
których mały fragment (około 1 mm) umieszcza się na szkiełku podstawowym w kropli wody lub
50% glicerolu (preparat wówczas wolniej wysycha) i nakrywa szkiełkiem nakrywkowym.
Następnie, u\
ywając tępego końca igły preparacyjnej, uderza się delikatnie w szkiełko
nakrywkowe, a\
do otrzymania mo\
liwie największego obszaru z jedną warstwą komórek.
Uwaga:
Materiały takie jak: marchew, ziemniak, cebula, banan, gruszka, pomidor przynoszą na
zajęcia Studenci. Mo\
na dodatkowo przynieść inne ni\
wymienione obiekty do badań, z
których uda się przygotować ciekawe preparaty mikroskopowe. Pomysły mile widziane.
Ćwiczenie 1
Obserwacja komórek przy ró\
nym powiększeniach
Materiał
Komórki ludzkiej białaczki mieloblastycznej HL60, mysiej białaczki L1210, komórki
ludzkiego raka jelita grubego HT29.
Sprzęt
Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, pipety automatyczne.
Wykonanie
Zawiesinę komórek ludzkiej białaczki mieloblastycznej HL60, mysiej białaczki L1210
lub komórek ludzkiego raka jelita grubego HT29 nanieść przy u\
yciu pipety automatycznej na
oczyszczone alkoholem etylowym szkiełko podstawowe i nakryć szkiełkiem nakrywkowym (aby
uniknąć pęcherzyków powietrza utrudniających obserwację, nale\
y przykładać szkiełko
nakrywkowe pod kÄ…tem 45° i powoli opuszczać je na kroplÄ™ zawiesiny komórek). Obserwować
komórki przy powiększeniu obiektywu 40x, a następnie przy powiększeniu 100x (nale\
y
pamiętać o wypełnieniu przestrzeni między obiektywem a szkiełkiem mikroskopowym olejkiem
immersyjnym). Porównać komórki z wybranych linii komórek nowotworowych pod względem
kształtu oraz wielkości. Wykonać rysunek.
Ćwiczenie 2
Barwienie przy\
yciowe komórek nowotworowych
Celem takiego barwienia jest odró\
nienie komórek \
ywych od martwych. Proces
barwienia tkanek czy komórek ma charakter fizykochemiczny i polega na adsorpcji barwnika na
ścianie komórkowej lub jego dyfuzji do wnętrza komórki. W barwieniu stosuje się najczęściej
barwniki zasadowe (sole, w których jonem barwnym jest kation np.: błękit metylenowy, fiolet
krystaliczny), wykorzystując ich powinowactwo do składników komórek (mających odczyn
kwaśny). Cechą charakterystyczną barwników przy\
yciowych jest ich niska toksyczność w
stosunku do barwionych komórek .
Materiał
Komórki ludzkiej białaczki mieloblastycznej HL60.
Sprzęt
Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, probówki Eppendorfa, pipety
automatyczne, worteks.
Odczynniki
0,04% wodny roztwór błękitu metylenowego.
Wykonanie
Pobrać do probówki Eppendorfa 0,5 ml zawiesiny komórek ludzkiej białaczki
mieloblastycznej HL60. Dodać 20 µl roztworu bÅ‚Ä™kitu metylenowego. CaÅ‚ość wymieszać na
worteksie i po 10 minutach nanieść kroplę zawiesiny komórek na szkiełko podstawowe. Przy
powiększeniu 40x zaobserwować stosunek komórek \
ywych do martwych. Wykonać rysunek.
Wyjaśnić, dlaczego komórki martwe barwią się, natomiast komórki \
ywe pozostajÄ… bezbarwne.
Ćwiczenie 3
Barwienie preparatów utrwalonych komórek nowotworowych
Konieczność stosowania materiału utrwalonego w cytologii jest podyktowana du\
Ä…
toksycznością specyficznych barwników i odczynników oraz niebezpieczeństwem zniekształceń,
powstałych w trakcie niekontrolowanego zamierania komórek. Utrwalenie materiału ma na celu
bardzo szybkie zabicie komórek z zachowaniem struktur komórkowych w stanie jak najmniej
zmienionym w porównaniu z komórką \
ywą. Dobry utrwalacz składa się ze środka utrwalającego
i nośnika zapewniającego stałe pH w trakcie utrwalania oraz odpowiedni skład jonowy aby nie
dopuścić do wytrącania i ekstrakcji materiału. Do prostych utrwalaczy zaliczane są: alkohol
etylowy, aceton, kwas octowy czy aldehyd glutarowy. Utrwalacze zło\
one to np. płyn Carnoy a
cechujący się szybką penetracją komórki, korzystnym wpływem na ich morfologię oraz
barwliwość chromosomów.
Materiał
Komórki ludzkiego raka jelita grubego HT29 rosnące na szkiełkach nakrywkowych.
Sprzęt
Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, komory do barwienia, szalki
Petriego, pęseta, pipety automatyczne.
Odczynniki
Utrwalacz Carnoy a: alkohol metylowy i lodowaty kwas octowy zmieszane w stosunku
objętościowym 3:1
1% kwas octowy
Woda destylowana
Barwnik Giemsa (rozcieńczony wodą destylowaną 1:20)
50%, 70%, 80%, 90% alkohol etylowy
Wykonanie
Komórki ludzkiego raka jelita grubego HT29 rosnące na szkiełku nakrywkowym, utrwalić
w płynie Carnoy a  poło\
yć preparat na szalce Petriego, zalać utrwalaczem i pozostawić na 15
minut. Następnie, w celu uwodnienia, trzymając pęsetą szkiełko nakrywkowe, przeprowadzić
preparat w ciÄ…gu 30 sekund przez szereg alkoholowy: 80%, 70%, 50% alkohol etylowy, wodÄ™
destylowaną do 1% kwasu octowego. Preparat barwić w wodnym roztworze barwnika Giemsa
przez 5 minut, płukać wodą destylowaną przez 1-2 minuty, zanurzyć w 90% alkoholu etylowym.
Po wysuszeniu, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować w mikroskopie świetlnym.
Wykonać rysunek i opisać uzyskane wyniki, wskazując miejsce występowania w komórce DNA.
Ćwiczenie 4
Obserwacja kształtów komórek
Materiał
Liść aloesu, owoc gruszki
Sprzęt
Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pęseta, pipety
automatyczne
Wykonanie
1. Przy pomocy skalpela przygotować skrawek z przekroju poprzecznego liścia aloesu,
umieścić go w kropli wody i obserwować pod mikroskopem typowe komórki miękiszowe. Im
cieńszy skrawek, tym więcej promieni świetlnych przepuszcza, wskutek czego obraz badanego
przedmiotu jest wyraz
niejszy i dokładniejszy. Przez odpowiednie ruchy szkiełkiem
nakrywkowym nale\
y usunąć z powierzchni skrawka banieczki powietrza, powodujące
zaciemnienie obrazu. Wykonać rysunek komórek miękiszowych.
2. Ze środka owocu gruszy pobrać skalpelem niewielką ilość mią\
szu i dokładnie
zmia\
d\
yć go na szkiełku podstawowym. Nanieść kroplę wody destylowanej i nakryć szkiełkiem
nakrywkowym. Odszukać w preparacie skupiska komórek kamiennych, wykonać rysunek i
opisać ich funkcję.
Ćwiczenie 5
Obserwacje wybranych organelli komórkowych
Materiał
Cebula, liść aloesu, liść trzykrotki, marchew, pomidor
Sprzęt
Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe, skalpel, pęseta, pipety
automatyczne
Wykonanie
1. Obserwacje jądra komórkowego.
Cebulę pokroić skalpelem na ćwiartki, wyjąć jedną łuskę spichrzową i naciąć jej wklęsłą
powierzchnię formując kwadrat o boku ok. 2 mm. Za pomocą pesety zdjąć wycięty kwadrat
skórki, przenieść go na szkiełko podstawowe do kropli wody i nakryć szkiełkiem nakrywkowym.
Obserwować wakuole, jądro i jąderko. Wykonać rysunek.
2. Obserwacje plastydów.
2.a. Przygotować skrawek przekroju poprzecznego liścia aloesu, umieścić go w kropli
wody i obserwować komórki miękiszowe z chloroplastami. Wykonać rysunek.
2.b. Z dolnej strony liścia trzykrotki zerwać pęsetą skórkę lub przygotować skrawek z
nasady jej liścia. Wykonać preparat wodny. Obserwować komórki z bezbarwnymi leukoplastami
zlokalizowanymi w pobli\
u jądra komórkowego. Wykonać rysunek.
2.c. Zeskrobane skalpelem, cienkie skrawki marchwi umieścić w kropli wody na szkiełku
podstawowym. Wykonać równie\
rozmaz z komórek miękiszowych pomidora (preparat wodny).
W obydwu przypadkach obserwować komórki z pomarańczowymi chromoplastami. Wykonać
rysunek, porównać kształt rozmiar i uło\
enie poszczególnych plastydów.
Ćwiczenie 6
Obserwacje skrobi zapasowej
Materiał
Bulwa ziemniaka, banan, ziarna fasoli i ry\
u
Sprzęt
Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pipety automatyczne
Wykonanie
1. Bulwę ziemniaka przeciąć skalpelem, a następnie przy jego pomocy nanieść niewielką
ilość powstałego soku na kroplę wody umieszczoną na szkiełku podstawowym. Obserwować
pojedyncze ziarna skrobi z charakterystycznym uwarstwieniem. Wykonać rysunek.
2. Bulwę ziemniaka przeciąć skalpelem, a następnie przy jego pomocy nanieść niewielką
ilość powstałego soku na kroplę wody umieszczoną na szkiełku podstawowym. Obserwować
pojedyncze ziarna skrobi z charakterystycznym uwarstwieniem. Wykonać rysunek.
3. Na szkiełku podstawowym umieścić kroplę wody, a następnie przy pomocy skalpela
nanieść niewielką ilość mią\
szu banana. Obserwować du\
e komórki miękiszowe ze skupiskami
ziaren skrobi zapasowej. Wykonać rysunek. Niewielką ilość bielma z przeciętego ziarna fasoli i
ry\
u zeskrobać przy u\
yciu skalpela bezpośrednio na kroplę wody na szkiełku podstawowym.
Obserwować charakterystyczne kształty ziaren skrobi. Wykonać rysunki, porównać rodzaje
skrobi oraz wyjaśnić w jakich organellach komórkowych znajdują się ziarna skrobi zapasowej.
Ćwiczenie 7
Własności cytoplazmy  plazmoliza
Materiały
Cebula
Sprzęt
Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pipety automatyczne
Odczynniki
10% roztwór NaCl
Wykonanie
Przygotować skórkę z wklęsłej strony łuski cebuli jak w ćwiczeniu 5. Preparat umieścić w
kropli hipertonicznego, 10% roztworu NaCl. Obserwować, narysować i wyjaśnić zjawisko
plazmolizy.
Ćwiczenie 8
Obserwacje kryształów szczawianu wapnia
Materiały
Okrywowa sucha Å‚uska cebuli, Å‚odyga rabarbaru
Sprzęt
Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pipety automatyczne
Wykonanie
1. Cienki skrawek suchej łuski cebuli umieścić w kropli wody, przykryć szkiełkiem
nakrywkowym. W wydłu\
onych komórkach znalez
ć pojedyncze kryształy szczawianu wapnia
tzw. jedyńce, występujące w postaci graniastosłupów o ró\
nej długości. Wykonać rysunek oraz
wyjaśnić w jakich organellach i dlaczego powstają jedyńce.
2. Skrawek poprzeczny łodygi rabarbaru umieścić w kropli wody, przykryć szkiełkiem
nakrywkowym. Obserwować w komórkach miękiszu pojedyncze kryształy szczawianu wapnia w
postaci ośmiościanów lub kuliste agregaty tzw. druzy. Wykonać rysunek.
Ćwiczenie 9
Barwniki komórkowe
Barwniki roślinne są glukozydami występującymi w wakuolach. Barwniki flawonowe są
\
ółte i nadają barwę płatkom rośliny. Barwniki antocyjanowe, w zale\
ności od pH nadają ró\
ne
zabarwienie wakuolom od czerwonego, poprzez fioletowe do niebieskiego
Materiały
Liście czerwonej kapusty
Sprzęt
Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pipety automatyczne
Odczynniki
80% kwas octowy
10% amoniak
Woda destylowana
Wykonanie
Przy u\
yciu skalpela wyciąć trzy kilkumilimetrowe skrawki skórki liścia czerwonej
kapusty czerwonej i umieścić je na szkiełkach podstawowych. Następnie do jednego dodać
kroplÄ™ 80% kwasu octowego, do drugiego kroplÄ™ 10% amoniaku, do trzeciego kroplÄ™ wody
destylowanej. Przeprowadzić obserwację jak zawarte w kapuście antocyjany, w zale\
ności od
odczynu środowiska, przybierają ró\
ne zabarwienie. Wykonać rysunek i zanotować obserwacje.
Sprawozdanie:
1. Wska\
na podstawowe ró\
nice w budowie komórki roślinnej i zwierzęcej.
2. Opisz wykonanie poszczególnych preparatów mikroskopowych, wykonaj starannie! ich
rysunki opisujÄ…c wyniki swoich obserwacji mikroskopowych oraz podaj odpowiedzi na
zadane w ćwiczeniach pytania.
Literatura
1. Strukturalne podstawy biologii komórki. Kilarski W., Wydawnictwo Naukowe PWN,
Warszawa 2003.
2. Podstawy molekularne biologii komórki. Aspekty lekarskie. Fulder G. M., Shields D.,
Wydawnictwo Lekarskie PZWL, A
ódz
2000.
3. Biologia komórki roślinnej. Wojtaszek P., Woz
ny A., Ratajczak L. Wydawnictwo
Naukowe PWN, Warszawa 2006.
4. Podstawy biologii komórki. Alberts B., Bray D., Wydawnictwo Naukowe PWN,
Warszawa 1999.
5. Biologia i in\
ynieria komórki. Laboratorium. Szopa J. St., Wydawnictwo Politechniki
A
ódzkiej, A
ódz
1994.
6. Mikroskopia świetlna w badaniach komórki roślinnej. Kurczyńska E. U., Borowska-
Wykręt D. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007.