WZROST I HODOWLA MIKROORGANIZMÓW
WARUNKI HODOWLI
Najważniejszymi czynnikami abiotycznymi wpływającymi na wzrost i rozwój drobnoustrojów, w tym
także na podłożach mikrobiologicznych w warunkach laboratoryjnych, są takie czynniki fizyczne (temperatura),
chemiczne (kwasowość, tlenowość) a także zawartość składników odżywczych.
Temperatura
Mikroorganizmy rozwijać siÄ™ mogÄ… w bardzo szerokim zakresie temperatur, od  23°C (silnie zasolone
wody Antarktydy w których stwierdzono obecność bakterii z rodzaju Corynebacterium i grzybów z rodzaju
Sporobolomyces) do 113°C (gorÄ…ce z
ródła, kominy termalne  Pyrodictium brockii). Większość
mikroorganizmów rozwija siÄ™ jednak w temperaturach od 10  37°C. W warunkach laboratoryjnych najczęściej
stosowanÄ… temperaturÄ… hodowli bakterii jest zakres 30  37°C natomiast dla grzybów temperatura 20  25°C.
Ze względu na różnice w minimalnych, optymalnych i maksymalnych temperaturach wzrostu,
mikroorganizmy dzieli się na ogół na trzy grupy:
·ð Psychrofilne (-23-0; 15; 20°C). Do tej grupy zalicza siÄ™ szereg drobnoustrojów zdolnych do rozwoju w
środowiskach naturalnych o niskich temperaturach, jak rejony podbiegunowe, szczyty wysokich gór, dna
oceanów, osady głębokich jezior. Bakterie tej grupy stanowią również poważny problem w
przechowalnictwie. Występując w chłodniach i magazynach, na i w schłodzonych produktach mleczarskich,
mięsnych i owocowo-warzywnych, wywierają niekorzystny wpływ na ich jakość i trwałość.
Najczęściej są to bakterie G- należące do rodzaju Pseudomonas oraz gatunki z rodzajów Vibrio, Aeromonas,
Acinetobacter, Alcaligenes, Chromobacterium i Flavobacterium. Wśród bakterii G+ dominują gatunki
należące do rodzajów: Micrococcus, Bacillus i Arthrobacter oraz niektóre Lactobacillus.
Spośród drożdży są to przedstawiciele rodzajów Candida, Debaryomyces, Pichia, Rhodotorula i Thurolopsis,
a spośród pleśni: Aureobasidium pullulans, Botrytis cinerea i Geotrichum candidum.
Szczególne niebezpieczeństwo zatruć pokarmowych stwarzają niektóre bakterie patogenne: Listeria
monocytogenes, Yersinia enterocolitica i Bacillus cereus.
·ð Mezofilne (10-30; 20-37; 35-50°C). Grupa drobnoustrojów zdolna do wzrostu w umiarkowanych
temperaturach. Do mezofili zalicza się większość drobnoustrojów występujących w środowisku (glebie,
wodzie, na powierzchni ciała roślin i zwierząt). Są to na ogół mikroorganizmy saprofityczne oraz
chorobotwórcze dla roślin, zwierząt i człowieka, wśród nich wywołujące zatrucia pokarmowe.
·ð Termofilne (25-45; 45-65/80; 60-90°C). Drobnoustroje o wysokich optymalnych temperaturach
wzrostu. Podzielono je na dwie grupy. Pierwsza zwana termofilami - obejmuje mikroorganizmy o
optymalnej temperaturze wzrostu powyżej 45°C. Druga grupa to hipertermofile o optymalnej temperaturze
wzrostu dopiero powyżej 80°C.
Mikroorganizmy tej grupy sÄ… szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Spotyka siÄ™ je w gorÄ…cych z
ródłach,
w fermentujących resztkach roślinnych (tytoniu, sianie, nawozie i kiszonkach) oraz w przewodzie
pokarmowym niektórych zwierząt. Niektóre bakterie, np. Desulfovibrio desulphuricans, rozwijają się w
rurach wymienników ciepła powodując ich korozję.
Większość termofili to bakterie G+, przetrwalnikujące należące do rodzaju Bacillus (Bacillus
stearothermophilus, Bacillus coagulans). Obok nich są to przedstawiciele rodzajów: Clostridium
(Clostridium thermosaccharolyticum), Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, Staphylococcus i inne. Liczba
termofili wśród bakterii G- jest ograniczona. Znane są również termofilne promieniowce
(Thermomonospora, Thermoactinomyces), bakterie zielone i sinice oraz liczne gatunki grzybów, np. Absidia
ramosa, Aspergillus fumigatus.
Tlenowość - potencjał oksydacyjno-redukcyjny
W warunkach naturalnych z natlenieniem środowiska łączy się zagadnienie potencjału oksydacyjno -
1
redukcyjnego (Eh) mierzonego w woltach lub miliwoltach. Przy lepszym natlenieniu wartości potencjału redox
są dodatnie i wyższe (do +0,4), a przy gorszym są niższe i przybierać mogą wartości ujemne (-0,4). Zapewnienie
mikroorganizmom odpowiedniego potencjału  tlenowości ma duże znaczenie w badaniach mikrobiologicznych,
przemyśle fermentacyjnym i przechowywaniu żywności. W praktyce mikrobiologicznej, w zależności od
wymagań mikroorganizmów, stosujemy metody hodowli w warunkach tlenowych lub beztlenowych.
Pod względem reakcji na natlenienie środowiska mikroorganizmy dzielimy na:
·ð BezwzglÄ™dne tlenowce (b. aeroby). RozwijajÄ… siÄ™ najlepiej przy wartoÅ›ciach Eh od +0,2 do +0,4 V.
Obecność tlenu jest dla wzrostu i rozwoju tych mikroorganizmów niezbędna. Do tej grupy zalicza się liczne
autotroficzne bakterie chemosyntetyzujÄ…ce (bakterie nitryfikacyjne, Thiobacillus), wiele bakterii
heterotroficznych (Pseudomonas, bakterie śluzowe), wiele gatunków grzybów pleśniowych i drożdży.
Liczne mikroorganizmy należące do tlenowców rozwijają się na w nieopakowanych prod uktach
żywnościowych lub których opakowania zostały uszkodzone, są także wykorzystywane w procesach
biotechnologicznych, np. produkcji kwasów organicznych, antybiotyków. Należą do nich bakterie z rodzaju
Bacillus, pleśnie z rodzaju Aspergillus, Penicillium, promieniowce Streptomyces, Micromonospora,
Nocardia.
·ð WzglÄ™dne beztlenowce . Do wzglÄ™dnych beztlenowców należy wiele różnorodnych gatunków bakterii,
grzybów i pierwotniaków. Obecność tlenu może być dla tych mikroorganizmów korzystna, brak tlenu nie
wyklucza jednak możliwości ich rozwoju (np. bakterie Escherichia coli, Shigella sp., Salmonella sp.,
Pseudomonas sp., drożdże Saccharomyces cerevisiae). Mikroorganizmy te zależnie od warunków wzrostu
uzyskują energię zarówno na drodze oddychania tlenowego, jak i beztlenowego. Względne beztlenowce
rozwijają się w produktach żywnościowych szczelnie opakowanych, ale nie odpowietrzonych, np.
porcjowane kawałki mięsa, ryby na tackach w woreczkach z tworzyw sztucznych.
·ð Mikroaerofile. RosnÄ… najlepiej gdy stężenie tlenu w Å›rodowisku ich bytowania jest mniejsze. WiÄ™ksze
stężenia tlenu powodują zahamowanie wzrostu i zatrucie komórki (bakterie fermentacji mlekowej).
·ð BezwzglÄ™dne beztlenowce (b.anaeroby). RozwijajÄ… siÄ™ jedynie w Å›rodowisku beztlenowym przy
ujemnych wartościach Eh (poniżej -0,2V). Energię uzyskują na drodze fermentacji lub oddychania
beztlenowego.
Do grupy tej zalicza się: przetrwalnikujące laseczki (Clostridium) przeprowadzające fermentację masłową
lub wytwarzające toksyny, które występują w odpowietrzanych konserwach oraz głębokich warstwach
żywności, np. mięsie, serach; zasiedlające żwacz ziarniaki (Ruminococcus) i pałeczki (Bacteroides); bakterie
metanogenne czynne w procesie beztlenowego oczyszczania ścieków).
Spośród grzybów jedynie nieliczne (Mucor) przeprowadzają w warunkach beztlenowych fermentację
alkoholowÄ….
Tlenowe metody hodowli mikroorganizmów to:
o Hodowle powierzchniowe  na powierzchni pożywek zestalonych;
o Hodowle statyczne  służą do badań morfologii, fizjologii, biochemii oraz otrzymywania czystych
kultur;
o Hodowle wgłębne  wzrost mikroorganizmów zachodzi w całej objętości pożywki płynnej na skutek
ciągłego ruchu pożywki wywołanego intensywnym mieszaniem lub wytrząsaniem;
o Hodowle ciągłe  wymagające stałego utrzymywania wzrostu drobnoustrojów przez sukcesywne
zaopatrywanie hodowli w świeżą pożywkę, jednocześnie z fermentatora odprowadzana jest taka sama
ilość podłoża zawierającego biomasę i szkodliwe metabolity.
Beztlenowe metody hodowli bakterii
Prowadzi się je eliminując ze środowiska hodowlanego tlen następującymi metodami:
o fizycznymi  np. wypompowanie tlenu ze środowiska lub przez hodowlę bakterii w pożywce płynnej
zawierającej tkankę zwierzęcą (kawałki wątroby, nerki lub mięśnia sercowego np. pożywka Wrzoska)
lub tkankę roślinną (marchew, ziemniak), które adsorbują tlen ze środowiska hodowlanego;
o chemicznymi  zastosowanie substancji wiążących tlen, np. podsiarczynu sodu, alkalicznego roztworu
trioksybenzenu, a także środków chemicznych redukujących tlen glukoza, kwas askorbinowy, cyste ina,
siarczyn sodowy);
o biologicznymi  wspólna hodowla drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych w dwóch oddzielonych
od siebie częściach płytki Petriego szczelnie oklejonej parafilmem lub plasteliną. Wyrastający
2
wcześniej organizm tlenowy wykorzystuje tlen ze środowiska umożliwiając rozwój organizmu
beztlenowego (metoda Fortnera). Niezbędnym warunkiem prowadzenia tej metody jest zastosowanie
składniku pożywki, która jest optymalna zarówno dla tlenowców jak i beztlenowców. Metodę tą można
zastosować do hodowli beztlenowych bakterii amylolitycznych (Clostridium acetobutylicum,
Clostridium pasterianum) w obecności Bacillus subtilis, Serratia marcescens lub Candida mycoderma.
Kwasowość - odczyn środowiska
pH lub stężenie jonów wodorowych jest jednym z czynników, który znacząco wpływa na ilościowy i
jakościowy skład mikroflory w danym środowisku. Chociaż pH soku komórkowego mikroorganizmów
utrzymuje się na poziomie bliskim obojętnemu, co zapobiega rozkładowi wrażliwych na działanie kwasów i
zasad składników komó rkowych, to mikroorganizmy charakteryzują się:
o różnymi wartościami punktów kardynalnych. Większości bakteriom odpowiada na ogół odczyn lekko
zasadowy lub obojętny (pH 6,5-7,7). Grzyby pleśniowe i drożdże rozwijają się lepiej przy niższych
wartościach pH (4-6).
o rozpiętością tolerowanych granic pH. Część drobnoustrojów rozwija się w dość wąskim zakresie pH
(Streptococcus pneumoniae), natomiast inne (np. Aspergillus niger) w szerokim zakresie - pH od 1,5 
11.
Biorąc pod uwagę reakcję drobnoustrojów na minimalne, optymalne i maksymalne stężenie jonów
wodorowych podzielono je na:
·ð Alkalofile. Mikroorganizmy rozwijajÄ…ce siÄ™ najlepiej w Å›rodowisku alkalicznym (optimum pH 8,0  11).
Zalicza się do nich bakterie nitryfikacyjne (Nitrosomonas i Nitrobacter), wolno żyjące asymilatory azotu
(Azotobacter), chorobotwórcze (Vibrio cholerae, Streptococcus pneumoniae), Enterococcus faecalis,
promieniowce, przedstawiciele rodzaju Bacillus (rozwijają się jeszcze przy pH 11), a także niektóre glony
rozwijajÄ…ce siÄ™ przy pH 13.
·ð Neutrofile. RozwijajÄ… siÄ™ najlepiej przy pH od 6,5  7,5.
·ð Acidofile. Drobnoustroje Å›rodowisk kwaÅ›nych (optimum pH 2,0  5,0). Zalicza siÄ™ do nich, grzyby
pleśniowe z rodzajów: Aspergillus, Oospora, Penicillium, drożdże Saccharomyces oraz bakterie fermentacji
octowej, fermentacji mlekowej, a zwłaszcza bakterie siarkowe (Thiobacillus thiooxidans, Ferrobacillus
thiooxidans), które utleniając związki siarki do kwasu siarkowego rozwijają się przy jego stężeniu
dochodzącym do 10% i przy pH poniżej 0,8 (kw.siarkowy w akumulatorach).
Odczyn środowiska wpływa nie tylko na wzrost drobnoustrojów, ale modyfikuje także biochemizm
komórki  zdolność do produkcji toksyn, kierunek procesów fermentacyjnych. Wobec silnej reakcji
mikroorganizmów na pH, znajomość punktów kardynalnych i regulowanie odczynu środowiska jest ważnym
zabiegiem w wielu procesach badawczych i technicznych. Ma kapitalne znaczenie przy:
·ð Przygotowywaniu podÅ‚oży agarowych dla hodowli mikroorganizmów. PamiÄ™tać należy, że kwasowość
podłoża zależy od jego temperatury. Obniżenie pH zwiększa wrażliwość mikroorganizmów na wysokie
temperatury, co jest wykorzystywane w procesie pasteryzacji produktów owocowo -warzywnych;
·ð Zabezpieczaniu produktów żywnoÅ›ciowych poprzez obniżenie pH do 3,5  4,2 (wiÄ™kszość ma odczyn sÅ‚abo
kwaśny), przed szkodliwym działaniem drobnoustrojów saprofitycznych, chorobotwórczych,
toksynotwórczych, w s zczególności wytwarzających formy przetrwalne.
WYMAGANIA POKARMOWE I WZROST DROBNOUSTROJÓW
ODŻYWIANIE DROBNOUSTROJÓW
Odżywianie, zasadniczy element metabolizmu, polegający na pobieraniu przez mikroorganizm z
otaczającego go środowiska substancji pokarmowych, a w określonych przypadkach także promieniowania
słonecznego. Pobrane składniki zapewniają budowę i odbudowę substancji komórkowych ora z energię
niezbędną do różnorodnych procesów życiowych takich jak wzrost, ruch, rozmnażanie.
3
Metabolizm komórki opiera się na dwóch przeciwstawnych procesach, które łączy proces wytwarzania,
gromadzenia i przekazywania energii. SÄ… to:
·ð Anabolizm (asymilacja)  pobieranie z otoczenia i synteza na drodze redukcji zwiÄ…zków o dużej zÅ‚ożonoÅ›ci
(małej entropii), przy wykorzystaniu energii zgromadzonej w ATP, która następnie jest magazynowana w
postaci wiązań chemicznych wytworzonych związków organicznych.
·ð Katabolizm (dysymilacja) - powstawanie na drodze biologicznego utleniania substratu zwiÄ…zków o maÅ‚ej
złożoności (dużej entropii), z jednoczesnym uwolnieniem energii i wydaleniem na zewnątrz powstałych,
niekiedy szkodliwych dla mikroorganizmów metabolitów.
Przebieg tych procesów, warunkujących prawidłowy wzrost i rozwój mikroorganizmów, zależy od:
stałego i bezawaryjnego dopływu z otaczającego środowiska mineralnych i organicznych związków,
stanowiących materiał budulcowy lub z
ródło energii; nakładów energii i ob ecności odpowiednich enzymów, od
których zależy przebieg reakcji metabolicznych; planu, który zapisany jest w układzie genetycznym każdego
organizmu.
Skład chemiczny mikroorganizmów
Skład chemiczny drobnoustrojów jest zbliżony do składu chemicznego inn ych organizmów. Około 80%
stanowi woda, która z jednej strony jest środowiskiem wewnętrznym komórki, w którym przebiega szereg
reakcji chemicznych, a z drugiej odgrywa czynnÄ… rolÄ™ w tych reakcjach.
Analizując skład chemiczny komórek mikroorganizmów stwierdza się w nich obecność co najmniej 28
pierwiastków. 6 podstawowych (C, O, H, N, S, P) buduje wszystkie związki organiczne w komórce:
aminokwasy, białka, cukry, kwasy tłuszczowe, lipidy, nukleotydy i kwasy nukleinowe.
Węgiel (C)  jego zawartość w suchej masie mikroorganizmów wynosi ok. 47-48%; jest głównym
pierwiastkiem wchodzącym w skład wszystkich związków organicznych, stąd potocznie mówi się o nich jako o
związkach węglowych.
Tlen (O)  stanowi 30-31% suchej masy mikroorganizmów; jest obecny we wszystkich związkach
organicznych, ponadto wchodzi w skład wody  podstawowego rozpuszczalnika substancji komórkowych.
Wodór (H)  jego udział w suchej masie dochodzi do 6,5%, podobnie jak tlen jest składnikiem wszystkich
substancji organicznych oraz wody.
Azot (N)  stanowi 8-10% suchej masy drobnoustrojów; jest niezbędny w komórce jako składnik
aminokwasów, pochodnych sacharydów oraz zasad purynowych i pirymidynowych (głównego budulca
nukleotydów i kwasów nukleinowych).
Fosfor (P)  wchodzi w skład nukleotydów budujących kwasy nukleinowe, ale także związki typu ATP i
ADP, w których wysokoenergetyczne wiązania fosforanowe magazynują lub uwalniają energię w zależności od
potrzeb komórki; buduje też fosfolipidy oraz układy buforowe utrzymujące pH komórki na st ałym poziomie.
Siarka (S)  jest składnikiem niektórych aminokwasów, warunkując ich zdolność do tworzenia mostków
dwusiarczkowych, grupa  SH jest też częścią aktywną wielu ważnych enzymów (np. oddychania
komórkowego).
Skład chemiczny komórki prokariotycznej
% Ilość cząsteczek na Ilość rodzajów
Cząsteczki suchej masy komórkę cząsteczek
Makroczasteczki 96 24 610 000 ~2 500
Białka 55 2 350 000 ~1 850
Polisacharydy 5 4 300 2
Lipidy 9.1 22 000 000 4
DNA 3.1 2.1 1
RNA 20.5 255 500 ~660
Monomery 3.5 ~350
Aminok wasy i ich prekursory 0.5 ~100
Cukry i ich prekursory 2 ~50
Nukleotydy i ich prekursory 0.5 18
Jony nieorganiczne 1
Suma 100%
Sucha masa aktywnie rosnacej komórki E. coli wynosi: ~ 2.8 x 10-13 g
4
Do pozostałych ważnych pierwiastków życia, występujących w stanie wolnym lub w postaci związków
mineralnych albo organicznych, zalicza siÄ™:
·ð makroelementy (od 10-4 do 10-3 mola) - skÅ‚adniki strukturalne komórki, odpowiedzialne z utrzymanie
właściwego ciśnienia osmotycznego w komórce (P, K, Ca, S, Fe, Mg);
·ð mikroelementy (od 10-8 do 10-6 mola) - bÄ™dÄ…ce w pierwszym rzÄ™dzie skÅ‚adnikami enzymów (Mn, Cu, Co,
Bo, Zn, Ni, Mo);
·ð witaminy (kilka ppm) - bÄ™dÄ…ce skÅ‚adnikami lub prekursorami enzymów;
Witaminy, które są najczęściej wymagane do wzrostu mikroorganizmów:
1. Tiamina (witamina B1)
2. Biotyna
3. Pirydoksyna (witamina B6)
4. Kobalamina (B12)
·ð substancje wzrostowe, które stymulujÄ… wzrost i rozwój, lecz nie wchodzÄ… w skÅ‚ad enzymów (np.
aminokwasy, aminy, sterole, zw. pirymidynowe, puryny, itp.).
Zapotrzebowanie i rodzaj wykorzystywanych związków (mineralne, organiczne) przez poszczególne
rodzaje mikroorganizmów jest odmienne i waha się niekiedy w szerokich granicach. Wśród mikroorganizmów
występować mogą bowiem zarówno prototrofy (np. Escherichia coli, Psudomonas sp.), które dysponując
kompletnym zestawem enzymatycznym z prostych związków wytworzyć mogą wszystkie niezbędne do życia
związki organiczne, jak również auksotrofy (np. drożdże, bakterie fermentacji mlekowej) wymagające obecności
w środowisku określonych związków organicznych (aminokwasów, substancji wzrostowych, itp.). Z tego też
powodu wszystkie niezbędne dla prawidłowego wzrostu i rozwoju składniki winny być zawarte w podłożach
mikrobiologicznych.
Makroelementy w przyrodzie i w mediac h hodowlanych
Element Przyswajalna forma występująca w naturze Składnik medium
CO2, zw. organiczne
Węgiel (C) Glukoza, maltoza, octan, szczawian, itp. oraz
(50% suchej masy) Złożone mieszaniny (ekstrakt drożdży,
pepton, itp.)
H2O, zw. organiczne H2O, zw. organiczne
Wodór (H)
H2O, zw. organiczne H2O, zw. organiczne
Tlen (O)
Nieorganiczne: NH4Cl, (NH4)2SO4, KNO3
Azot (N)
NH3, NO3-, azotowe zw. organiczne
(12% suchej masy)
Organiczne: aminokwasy, zasady azotowe
nukleotydów i inne zw. organiczne
zawierajÄ…ce N
KH2PO4, Na2HPO4
Fosfor (P)
PO43-
Na2SO4, Na2S2)3, Na2S, cysteina i inne zw.
Siarka (S)
H2S, SO42-, zw. organiczne zawierajÄ…ce
organiczne zawierajÄ…ce siarkÄ™
siarkÄ™, siarczki metali (FeS, ZnS, NiS i inne)
KCl, KH2PO4
Potas (K)
K+ w r-r i różne sole potasowe
MgCl2, MgSO4
Magnez (Mg)
Mg2+ w r-r i różne sole Mg
Sód (Na) NaCl
Na+ w roztworze i różne sole
CaCl2
Wapń (Ca)
Ca2+ w roztworze, CaSO4 i różne sole
wapniowe
FeCl2, FeSO4, chelatowane jony żelaza w
żelazo (Fe)
Fe2+ lub Fe3+ w roztworze lub jako FeS,
Fe(OH)3 i inne sole
roztworze (Fe3+/EDTA lub Fe3+/cytrynian)
5
MIKROELEMENTY:
Element Funkcja komórkowa
Chrom (Cr) Metabolizm glukozy, u mikroorganizmów
Kobalt (Co) Witamina B12, transkarboksylaza
Miedz (Cu) Oksydaza cytochromu C i SOD
Mangan (Mn) Aktywator enzymów, SOD, enzym fotosystemu II
Molibden (Mo) Enzymy zawierajace flawiny, reduktaza azotanów
Nikiel (Ni) Większość hydrogenaz, ureaza
Selen (Se) Niektóre hydrogenazy
Wolfram (W) Dehydrogenaza mrówczanowa
Wanad (V) Nitrogenaza wanadowa, bromoperoksydaza
Cynk (Zn) Anhydraza węglanowa, dehydrogenaza alkoholowa, polimerazy RNA i DNA, białka
wiążące DNA, metalopeptydazy
żelazo (Fe) Cytochromy, katalazy, peroksydazy, białka żelazowo-siarkowe (np. ferodoksyna),
oksygenazy, wszystkie nitrogenazy
KLASYFIKACJA SPOSOBÓW ODŻYWIANIA
1. kryterium  z
ródło węgla
" AUTOTROFY  organizmy, które czerpią węgiel do budowy substancji organicznych z dwutlenku węgla,
przy czym nie sÄ… zdolne do czerpania go z innych z
ródeł
" HETEROTROFY  z
ródłem węgla są dla nich związki organiczne
2. kryterium  z
ródło energii
" FOTOTROFY  energię uzyskują z promieniowania słonecznego
" CHEMOTROFY  czerpią energię z utleniania organicznych lub nieorganicznych związków
chemicznych
3. kryterium  z
ródło (donator) elektronów w procesie biosyntezy
" LITOTROFY  z
ródłem elektronów są dla nich substancje nieorganiczne (H2, NH3, H2S, CO, związki
Fe i in.)
" ORGANOTROFY  korzystajÄ… z organicznych z
ródeł elektronów
PODSTAWOWE TYPY POKARMOWE MIKROORGANIZMÓW
Fotolitoautotrofy (fotolitotrofy)  z
ródłem energii jest dla nich promieniowanie słoneczne,
dostarczycielem elektronów i węgla są związki nieorganiczne; zaliczamy tu m.in. glony i sinice
przeprowadzajÄ…ce proces fotosyntezy.
Fotoorganoheterotrofy (fotoorganotrofy)  dostarczycielem energii jest promieniowanie słoneczne, ale
z
ródłem elektronów  związki organiczne.
Chemolitoautotrofy  energię, elektrony i węgiel czerpią z substancji nieorganicznych; zaliczamy tu m.in.
bakterie nitryfikacyjne, siarkowe, wodorowe i żelazowe uzyskujące energię w wyniku utleniania odpowiednio:
NH3 lub NO2, H2S, lub S, H2 i Fe3+.
Chemoorganoheterotrofy  z
ródłem energii, elektronów i węgla są związki organiczne; należą tu pleśnie,
drożdże, liczne bakterie.
Podział heterotrofów wg innych kryteriów:
prototrofy  wymagają do wzrostu oprócz substancji mineralnych tylko jednego organicznego z
ródła
węgla,
auksotrofy  wymagają do wzrostu oprócz podstawowego organicznego substratu węglowego co
najmniej jednego dodatkowego związku organicznego pełniącego rolę czynnika wzrostowego (np. witaminy,
aminokwasu, zasady purynowej lub pirymidynowej).
Heterotrofy dzieli się także na:
saprofity  wykorzystujÄ… martwÄ… materiÄ™ organicznÄ…,
pasożyty  rozwijają się  na organizmie żywym, ze szkodą dla tego organizmu,
komensale  rozwijają się  na organizmie żywym, nie przynosząc mu ani korzyści ani szkody,
symbionty  rozwijają się w zespole z innym organizmem żywym, przy czym dla obu organizmów jest to
układ korzystny.
6
Podział drobnoustrojów wg rodzaju:
1. z
ródła węgla: autotrofia; heterotrofia
2. z
ródła energii metabolicznej: fototrofia (światło); chemotrofia (pierwiastki lub zw.
chem.)
3. z
ródła elektronów: organotrof (zw. org.) litotrof (zw. nieorg. lub pierwiastki)
Typ pokarmowy y
ródło y
ródło y
ródło węgla przykłady
energii elektronów
Fotolito(auto)trofy światło zw. nieorg. CO2 Sinice
fotoorganoheterotrofy światło zw. org. zw. org. Bakterie
niesiarkowe
chemolitoautotrofy zw. nieorg. zw. nieorg. CO2 Bakterie
nitryfikacyjne
chemoorganoheterotrofy zw. nieorg. zw. org. zw. org. Patogeny,
grzyby,
pierwotniaki,
zwierzęta, wiele
bakterii
Chemilitoheterotrofy zw. nieorg. zw. nieorg. zw. org. Beggiatoa spp.
Te, które wykorzystują CO2 nie są wykorzystywane w biotechnologii.
Dlaczego drobnoustroje sÄ… przydatne w biotechnologii
1. wysoka wydajność procesu
2. produkt charakteryzuje się dużą czystością
3. rosną b. szybko (można tak zaplanować cykl, aby w najkrótszym czasie je otrzymać)
4. produkcja pozwala na tworzenie tylko minimalnych ilości toksycznych substancji
zanieczyszczających środowisko
5. dosyć stabilne genetycznie i fenotypowo
6. wymagania odżywcze nieduże, stosuje się tanie podłoża, substancje odnawialne, takie
które nie podlegają niszczeniu
7. reakcje odbywają się w znacznie niższej temperaturze w porównaniu do syntezy
chemicznej, co obniża koszty
8. stosunkowo łatwe wydzielenie produktu po skończonej syntezie
Drobnoustrojów wytwarzających produkty użyteczne człowiekowi, jest ok. kilkuset tysięcy.
Zainteresowanie budzą głównie: drożdże, grzyby nitkowate, promieniowce, bakterie
właściwe.
7
PODA
OŻA HODOWLANE
Pożywk a jest mieszaniną roztworów o odpowiednio dobranych składnikach.
Pożywka powinna spełniać następujące warunki:
- zapewnić odpowiednią ilość przyswajalnych składników pokarmowych, zarówno organicznych, jak i
nieorganicznych (energetycznych i budulcowych),
- zawierać określone czynniki wzrostowe,
- mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne,
- zapewniać optymalny dla rozwoju dostęp do tlenu,
- wykazywać właściwą temperaturę i pH.
Nie ma uniwersalnej pożywki dla wszystkich drobnoustrojów.
Podłoża dla autotrofów są nieskomplikowane, zawierają tylko związki mineralne. Heterotrofy mają już większe
wymagania, które można zaspokoić dodając kompleksowe substancje np. ekstrakt mięsny, pepton, ekstrakt
drożdżowy, brzeczkę.
Obecnie na rynku dostępne są gotowe podłoża i składniki do pożywek, w formie odwodnionej lub proszku o
wystandaryzowanym składzie  zapewnia to powtarzalność warunków hodowli, a co za tym idzie pozwala na
porównywanie wyników doś wiadczeń prowadzonych w różnym czasie lub różnych laboratoriach. Ponadto
znacznie skraca czas przygotowania do doświadczeń. Własnoręczne komponowanie pożywek wymaga
stosowania składników i związków chemicznych o najwyżs zym stopniu
Skład pożywek hodowlanych
Pożywki hodowlane zwane inaczej podłożami mikrobiologicznymi służą do hodowli mikroorganizmów
w warunkach laboratoryjnych. Stosując różne podłoża możemy prowadzić izolację mikroorganizmów,
różnicować je, namnażać oraz identyfikować.
Skład podłoża:
1. woda
2. z
ródło węgla
3. z
ródło azotu
4. inne składniki: fosfor, witaminy, prekursory (w zależności od mikroorganizmu)
y
RÓDA
O W
GLA
Pochodzenie poszczególnych składników podłoży jest różne np.:
·ð z
ródłem węgla i energii są najczęściej węglowodany (np. glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, celuloza), a
także glicerol, mannitol oraz niektóre kwasy organiczne. Dodaje się je w ilości 0,5-2%.
z
ródło węgla  główny składnik podłoża, potrzebny do biosyntezy, z
ródło energii dla mikroorganizmów, aby
obniżyć koszty szuka się tanich i efektywnych z
ródeł, głównie używa się węglowodanów, zaczyna się
wykorzystywać węglowodory np. pozostałość po destylacji
ropy naftowej
węglowodany:
1. Monosacharydy
- glukoza  składnik podłóż mikrobiologicznych, najczęściej w laboratoriach jako monosacharyd, dość rzadko
występuje w naturze (np. w winogronach), najszybciej przyswajana, w przemyśle używa się glukozy
pochodzÄ…cej z hydrolizy skrobi (procesy chemiczno-enzymatyczne), powstaje syrop glukozowy
Podczas sterylizacji glukoza może wchodzić w reakcje z aminokwasami z podłoża, dlatego podłoże i glukozę
sterylizuje siÄ™ osobno
2. Oligosacharydy
8
- laktoza  powszechna w przyrodzie  w mleku od 3 do 8 %, przemysłowo otrzymywana przez odparowanie
serwatki, nie wszystkie mikroorganizmy rozkładają laktozę
- sacharoza  w owocach, burakach cukrowych, trzcinie cukrowej Melasa  zawiera niewykrystalizowane cukry
po produkcji cukru, produkt uboczny, zawiera również inne składniki, doskonałe z
ródło węgla do podłóż
mikrobiologicznych, ponieważ jest produktem naturalnym, więc jej skład może się wahać, może również
zawierać mikroorganizmy (zakażona!), wymaga wstępnej analizy
3. Polisacharydy
- skrobia  składnik energetyczny składowany u roślin w bulwach, jest nierozpuszczalna, trzeba ja chemicznie
modyfikować, żeby można ja było rozpuścić, większość organizmów przyswaja skrobię
- celuloza  bardzo rozpows zechniona, składnk ściany komórkowej roślin, jednak niewiele organizmów ją
przyswaja, dlatego wymaga wstępnej obróbki
y
RÓDA
O AZOTU
Większość drobnoustrojów wykorzystuje azot z połączeń nieorganicznych (sole amonowe, wodorotlenek
amonu, azotany). Jon amonowy stanowi podstawowy związek w przemianach azotowych. Niektóre
drobnoustroje (BAKTERIE) mogą pobierać wolny azot atmosferyczny. Poza tym, drobnoustroje czerpią azot
również ze związków organicznych, niekiedy bardzo skomplikowanych. Należy tu wymienić przede wszystkim
ekstrakty (wyciągi) z tkanek roślinnych i zwierzęcych oraz różnego typu hydrolizaty b iałek zwierzęcych i
roślinnych. Wszystkie te składniki są dostępne już jako preparaty handlowe, w postaci proszków lub past.
Dodatek związków białkowych do pożywek wynosi 0,5-2%.
Do z
ródeł azotu zaliczamy:
Ekstrakty mięsne  wodne wyciągi z tkanki mięsnej, ale także ekstrakty z serc i wątroby; zawierają one
substancje azotowe oraz węglowodany i witaminy rozpuszczalne w wodzie;
Ekstrakty drożdżowe  obok związków azotu i węgla organicznego są bogatym z
ródłem witamin z grupy B;
Peptony  to specyficzne produkty częściowej, enzymatycznej hydrolizy białka, są głównym z
ródeł azotu
organicznego w pożywce; zawierają liczne wolne aminokwasy i krótkie łańcuchy peptydowe, pewne witaminy,
czasami węglowodany;
Hydrolizaty enzymatyczne lub k wasowe białek mięsa, kazeiny, jaj, nasion soi  bogate z
ródło aminokwasów,
jedno z najczęściej wykorzystywanych z
ródeł azotu organicznego w pożywce;
Czyste białka (żelatyna, kazeina) oraz białka rodzime (np. białka jaja, surowicy krwi)  opcjonalne z
ródło
azotu wykorzystywane przez bakterie proteolityczne;
Wolne aminok wasy  czasami dodawane do podłoża.
y
ródło azotu  może być w dwóch postaciach: nieorganiczne sole lub z
ródło organiczne
- Sole azotu  np. nawozy mineralne, mocznik, sole amonowe
- Organiczny  łatwiej przyswajalny, wykorzystuje się produkty uboczne przemysłu spożywczego np. syrop
kukurydziany, syrop ziemniaczany  w postaci aminokwasów
Oprócz tych składników w podłożach powinny znajdować się:
·ð skÅ‚adniki mineralne  należą do nich zarówno sole mineralne, jak i pierwiastki Å›ladowe. Sole dodawane do
pożywek w niewielkich ilościach, są z
ródłem składników nieorganicznych: fosforu, siarki, potasu, sodu,
magnezu, manganu, żelaza, i in. Drobnoustroje pobierają je w postaci odpowiednich soli, najczęściej KH-
2PO4, K2HPO4, Na2HPO, NaH2PO, NaCl, siarczany i chlorki żelaza, magnezu. Niektóre z tych soli regulują
ciśnienie osmotyczne, np. NaCl, dodawane w ilościach 3-5 g/l pożywki. Inne, np. fosforany potasu, działają
buforująco i utrzymują właściwy odczyn pożywki.
·ð pierwiastki  dodawane do podÅ‚oża należą do nastÄ™pujÄ…cych grup: pierwiastki biogenne: O,H, P,S
(składniki budulcowe komórki), pierwiastki biorące udział w procesach życiowych komórki: Na, K, Mg, Ca,
Fe, mikroelementy biorące udział w reakcjach komórkowych: Zn, Mn, Cu, Co.
·ð substancje wzrostowe  Wprowadza siÄ™ je do podÅ‚oża w postaci roztworów syntetycznych witamin
(kosztowne) lub w formie wspomnianych wyżej wyciągów mięsnego, wątrobowego i drożdżowego, a także
wyciągów roślinnych (sok pomidorowy, brzeczka słodowa, ekstrakt glebowy lub ziemniaczany).
9
·ð substancje różnicujÄ…ce i wybiórcze  skÅ‚adniki różnicujÄ…ce to te, które po dodaniu do pożywki ulegajÄ… pod
wpływem wzrostu drobnoustrojów rozkładowi (np. cukry  następuje zmiana barwy pożywki) lub też
wskazują na obecność produktów metabolizmu bakterii (np. wytwarzanie siarkowodoru, tworzenie indolu).
Składniki wybiórcze natomiast dodaje się po to, żeby hamując wzrost pewnych grup mikroorganizmów
umożliwić jednocześnie rozwój flory pożądanej (mogą to być: sole k wasów żółciowych, niektóre
barwniki, np. fiolet krystaliczny, błękit brylantowy, związki chemiczne, np. azydek sodu lub
antybiotyki).
·ð czynniki zestalajÄ…ce  w przypadku pożywek o konsystencji staÅ‚ej dodaje siÄ™ do podÅ‚oża agar (jest to
polisacharyd, który ma właściwości żelujące, dodaje się go w ilości 1,5-3%) lub żelatynę (substancja
białkowa, bogata w kolagen, dodaje się w ilościach 12-15%).
Agar-agar
Jest to w dostępny handlowo w formie proszku lub włókiem, wielocukier otrzymywany z glonów morskich.
Odznacza się właściwościami żelującymi, silnie chłonie wodę i w zależności od stopnia oczyszczenia upłynnia
siÄ™ w temperaturze 90-100ºC, a zestala w 45-48ºC. Chemicznie agar jest polisacharydem  galaktonem (zawiera
m.in. galaktozę), który nie jest wykorzystywany przez drobnoustroje jako składnik odżywczy, a tylko przez
niektóre drobnoustroje może być rozkładany. W celu zestalenia podłoża wystarczy 1,5 -3% agaru.
Żelatyna
Jest to substancja białkowa, która powstaje w wyniku hydrolizy kolagenu, może być zużywana przez
drobnoustroje zawierające enzymy proteolityczne, następuje wówczas upłynnienie pożywki (nie należy
przechowywać pÅ‚ytek z takimi hodowlami do góry dnem. Å»elatyna upÅ‚ynnia siÄ™ w temperaturze 25 -27ºC, a
zestala w 18-20ºC, przy czym ogrzewana kilkukrotnie do 100ºC traci wÅ‚asnoÅ›ci żelujÄ…ce. Jako czynnik
zestalający pożywkę dodaje się w ilości 12-15%.
Inne czynniki zestalające są stosowane rzadko, należą tu m.in. żel krzemionkowy (do pożywek mineralnych dla
autotrofów), jaja i surowica krwi (w badaniach specjalnych).
Podział pożywek hodowlanych
Podłoża hodowlane podzielić możemy biorąc pod uwagę:
·ð skÅ‚ad chemiczny:
o naturalne  bulion, mleko, brzeczka słodowa, melasa buraczana
o syntetyczne  złożone z odczynników chemicznych o ściśle znanym składzie ilościowym i
jakościowym
o półsyntetyczne  przygotowane z odczynników chemicznych z dodatkiem pojedynczego składnika
naturalnego (wyciąg mięsny, mleko, serwatka, wyciągi roślinne: ziemniaczany, pomidorowy, melasa
buraczana, namok kukurydziany, brzeczka słodowa).
·ð cel hodowli:
o namnażające  służące do otrzymania biomasy drobnoustroju (np. zbuforowana woda peptonowa dla
pałeczek Salmonella i pożywka Kesslera-Swenartona dla pałeczek z grupy coli, podłoże Czapka lub
Sabuoroda do hodowli grzybów)
o selektywne  zawierają zarówno składniki odżywcze jak i wybiórcze (np. fiolet krystaliczny jest
składnikiem wybiórczym w podłożu do hodowli bakterii z grupy coli, pH kwaśne podłoża pozwala na
wzrost grzybów, hamując wzrost bakterii).
o różnicujące  zawierają substancje diagnostyczne, pozwalające stwierdzić w środowisku obecność
drobnoustrojów określonych rodzajów (np. podłoże Endo do hodowli bakterii coli, agar z krwią do
hodowli paciorkowców hemolizujących, agar SS do hodowli bakterii Salmonella, Schigella, podłoże
Blickfeldta do wykrywania bakterii kwaszących, podłoże Wrzoska do oznaczania bakterii beztlenowych).
·ð wymagania pokarmowe drobnoustrojów:
o ogólne (zwykłe)  do hodowli drobnoustrojów heterotroficznych o niewielkich wymaganiach
pokarmowych, prototroficznych (bulion odżywczy, agar odżywczy)
10
o wzbogacone  do hodowli drobnoustrojów o zwiększonych wymaganiach hodowlanych,
auksotroficznych (np. bulion odżywczy z dodatkiem substancji wzrostowych; agar wzbogacony z
dodatkiem glukozy)
o wybiórcze  do izolacji ściśle określonych grup drobnoustrojów. Do podłoża dodaje się składnik, który
w przypadku hodowli mieszanej pozwala na wzrost tylko tych mikroorganizmów, które tolerują ten
składnik (pożywka Kesslera  Swenartona z fioletem krystalicznym dla hodowli bakterii z grupy coli).
o różnicujące  do identyfikacji drobnoustrojów w hodowli mieszanej. Określone grupy
mikroorganizmów różnicuje się na podstawie rozkładu przez nie substratów wprowadzonych do
podłoża (podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową do identyfikacji bakterii z grupy coli; podłoże z
mannitolem do identyfikacji gronkowców)
·ð konsystencjÄ™:
o płynne  służą głównie do namnażana drobnoustroju (np. bulion)
o półpłynne - zawierają agar w ilości 0,15 0,5% i służą do hodowli organizmów o mniejszym
zapotrzebowaniu na t len oraz do badania ruchu bakterii
o stałe  jako czynnik zestalający stosuje się agar, bądz
żelatynę, służą do różnicowania i izolowania
bakterii i grzybów, a także hodowli i liczenia bakterii.
Rodzaje pożywek stosowanych w mikrobiologii (przykłady):
·ð Pożywki ogólnego zastosowania
o bulion zwykły, odżywczy, brzeczka słodowa
o agar zwykły, odżywczy, bulion z agarem
o żelatyna
·ð Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli bakterii:
o podłoża dla beztlenowców (podłoże Wrzoska, Wilsona-Blaira)
o podłoża dla pałeczek z grupy coli (z żółcią i zielenią brylantową, Kesslera-Swenartona, Endo)
o podłoże do wykrywania enterokoków (z azydkiem sodu)
o podłoże do wykrywania gronkowców (Chapmanna z mannitolem)
·ð Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli grzybów pleÅ›niowych i drożdży:
o podłoże Sabourauda
o brzeczka agarowa
o pożywka Czapka  Doxa
o podłoże Wikena i Richardsa do izolacji drożdży.
Przygotowywanie pożywek
Znając skład jakościowy i ilościowy pożywki, dodaje się do wody destylowanej poszczególne składniki
zgodnie z podaną recepturą, następnie ogrzewa na gazie do momentu uzyskania klarowności płynu i koryguje
pH (jeżeli jest różne od oczekiwanego).
W zależności od rodzaju pożywki i wymaganych temperatur sterylizacji wyjaławia się rozpuszczoną
pożywkę w aparacie Kocha lub w autoklawie w określonym czasie. Po sterylizacji należy również sprawdzić i
ewentualnie skorygować pH. Ustalając pH pożywki zaraz po wyjęciu z autoklawu należy uwzględnić, że po
ostygnięciu do temperatury 370C kwasowość przesunie się w kierunku zasadowym. Korektę pH prowadzi się za
pomocą roztworów NaOH lub HCl.
Po ostudzeniu, jeżeli pożywka nie wymaga dodatku witamin, bądz
przesączenia rozlewa się ją do płytek
Petriego lub probówek. Sposób rozlewania zależy od potrzeb, do jakich ma służyć przygotowane podłoże. Jeżeli
potrzebujemy podłoża stałe to możemy je rozlać na płytki Petriego lub do probówek gdzie zestala się je w
formie skosu lub słupka (rozlewane podłoże nie może mieć temperatury niższej od 450C, gdyż nie będzie się
równo zestalało). Pożywki płynne rozlewa się do probówek lub kolbek.
TECHNIKA WYKONYWANIA POSIEWÓW
Jedna z definicji mówi, że  drobnoustroje to organizmy wszędobylskie , występujące na całej kuli
ziemskiej - w całej biosferze, tj.:
11
·ð w powietrzu  sÄ… staÅ‚ym skÅ‚adnikiem aeroplanktonu - zdolne do kieÅ‚kowania formy przetrwalne spotyka siÄ™
nawet na wysokości ponad 5 tys.m npm.
·ð w wodach  zasiedlajÄ… rowy oceaniczne (poniżej 6 tys. m); formy przetrwalne wytrzymujÄ… ciÅ›nienie
dochodzÄ…ce do 20 tys. atmosfer przez 45 min., a formy wegetatywne Escherichia i Salmonella nie ginÄ… przy
ciśnieniu 5 tys. atm. Toksyny bakteryjne (tężcowa i błonnicza) ulegają inaktywacji dopiero przy ciśnieniu
powyżej 12 tys. atm. Niektóre bakterie żyją w gorących z
ródłach, których temperatura waha się w granicach
98ºC, a inne w wodach o zawartoÅ›ci NaCl dochodzÄ…cej do 28-30% (Halobacterium, Halococcus)
·ð w glebie  najwiÄ™cej bakterii znajduje siÄ™ w uprawnej warstwie gleby  do 30 cm, a zwÅ‚aszcza w ryzosferze.
W warstwie tej na pow. 1 ha znajdować się może od kilku q do kilku t bakterii.
Również gleby pustynne, pozornie jałowe, zawierają mikroorganizmy, które przez wiele miesięcy, a nawet
lat pozostają w stanie anabiozy. Po nawilgotnieniu gleby przez opady powracają one do na ogół
krótkotrwałej aktywności życiowej.
Ogólna biomasa mikroorganizmów glebowych występujących na kuli ziemskiej szacowana jest na 1012 t i
jest zbliżona do masy zwierząt i roślin lądowych. W 1 g mieści się 200x więcej komórek bakteryjnych niż
cała populacja Homo sapiens.
Środowiska te mogą być z
ródłem skażenia surowców oraz produktów rolno spożywczych i pasz,
zarówno mikroflorą saprofityczną, jak również chorobotwórczą. y
ródłami skażenia w zakładach przetwórstwa
rolno-spożywczego mogą być także: pracownicy, pomieszczenia oraz urządzenia produkcyjne. Ponieważ
obecność mikroorganizmów prowadzić może do zakłócenia procesów technologicznych i spadku wartości
konsumpcyjnej wytwarzanych produktów, stąd wykrywanie ich obecności jest jednym z podstawowych
elementów analiz mikrobiologicznych. Podstawowa kontrola mikrobiologiczna obejmuje pobranie materiału
mikrobiologicznego, jego przygotowanie do posiewu, wykonanie posiewów oraz izolacje bakterii w celu
ilościowej i jakościowej analizy.
Pobór materiału i przygotowanie do posiewu
Odpowiednie pobranie materiału do badań jest bardzo ważnym elementem pracy w mikrobiologii, gdyż
decyduje o dalszym przebiegu badania oraz wyniku posiewu.
·ð Pobieranie materiaÅ‚u do badaÅ„ z powierzchni
Metoda tamponowa
Stosowana do oceny skażenia mikrobiologicznego dużych powierzchni (kadzie fermentacyjne, be czki,
kontenery) oraz powierzchni wewnętrznych (przewodów, zaworów, uszczelek). Materiał pobiera się przecierając
jałowym tamponem z waty lub gazy powierzchnię przeznaczoną do badania, następnie tampony umieszcza się w
probówce z jałowym płynem i przez dokładne wytrząsanie spłukuje pobrany materiał. Zawiesina z materiałem
jest wysiewana na odpowiednie podłoże.
W przypadku pobierania materiału z powierzchni płaskich (przy ocenie ilościowej skażenia) stosuje się jałowy
szablon wykonany z drutu lub blachy w postaci kwadratu o znanej powierzchni (25 lub 100 cm2).
Metoda wypłukiwania
Stosowana do oceny czystości opakowań szklanych lub metalowych. Wewnętrzne powierzchnie
naczynia opłukuje się przez wytrząsanie określoną ilością jałowego płynu fizjologicznego lub wody
destylowanej. Uzyskaną w ten sposób zawiesinę przeznacza się do dalszych badań.
Metoda Richtera
Stosowana do badania czystości opakowań szklanych poprzez wlewanie do naczynia podłoża
agarowego, które przez obracanie naczynia rozprowadza się równomiernie na jego wewnętrznych ściankach.
Naczynie dokładnie zamknięte inkubuje się w odpowiedniej temperaturze i po określonym czasie ocenia
obecność kolonii drobnoustrojów.
Metoda odciskowa
Stosowana przy ocenie czystości materiałów opakowaniowych, korków, wieczek lub innych małych
powierzchni. Badany materiał przyciska się do powierzchni zestalonego podłoża agarowego. Po określonym
okresie inkubacji w odpowiedniej temperaturze określa się obecność kolonii mikroorganizmów.
Kontrola powierzchni może być wykonywana specjalnymi przyrządami, które są w ofercie firm
zajmujących się diagnostyką mikrobiologiczną. Należą do nich:
12
·ð pÅ‚ytki Å‚opatkowe skÅ‚adajÄ…ce siÄ™ z umieszczonej w plastikowym zakrÄ™canym
·ð opakowaniu plastikowej Å‚opatki pokrytej z obu stron podÅ‚ożem agarowym. Posiew można wykonywać
trzema sposobami:
o dociśnięcie podłoża na łopatce do badanej powierzchni stałej;
o potarcie podłóż na łopatce materiałem badanym pobranym za pomocą tamponu z waty;
o zanurzenie łopatki jeżeli badany materiał jest w postaci płynnej.
Po okresie inkubacji w określonej temperaturze wzrost drobnoustrojów na łopatce ocenia się zgodnie z
dołączonym do opakowania wzorcem.
Ocenę czystości powierzchni można wykonać metodą bioluminescencji poprzez pomiar stężenia ATP
(adenozynotrifosforanu), który jest składnikiem organizmów roślinnych i zwierzęcych. Ocenę zawartości ATP
prowadzi się zgodnie z dołączonymi normami dla poszczególnych produktów.
·ð Pobieranie pÅ‚ynów do badaÅ„
Soki, mleko, wodÄ™ itp. pobiera siÄ™ jaÅ‚owÄ… pipetÄ… do jaÅ‚owej butelki, kolbki lu b probówki w iloÅ›ci ¾
objętości naczynia i szczelnie korkuje. Próby pobiera się przy palniku zgodnie z opisaną procedurą. Przed
posiewem należy dokładnie wytrząsnąć próbkę przygotowaną do badania.
·ð Pobieranie past
Galaretki, przeciery, pasty itp. pobiera s ię jałową łopatką w ilości 20  50 g do wyjałowionej i
wytarowanej kolbki o pojemności 200 cm3 i rozcieńcza przed posiewem określoną ilością rozcieńczalnika
(rozcieńczenie 1 : 10 lub 1 : 100).
·ð Pobieranie produktów o konsystencji staÅ‚ej
Z mięsa, wędlin, narządów wewnętrznych, serów itp. pobiera się wyjałowioną skalpelem i pincetą ok.
200 g próbki (osobno z warstw powierzchniowych i z głębszych). Wycinki wkłada się do płytek Petriego lub
szerokich probówek z gumowym korkiem. Pobrane próby tnie się na kawałki o boku 0,5 cm. Tak przygotowaną
próbę (na ogół o masie 20 g) rozciera się w moz
dzierzu lub rozdrabnia w homogenizatorze i dodaje do 180 g
jałowego rozcieńczalnika (rozcieńczenie 1 : 10), a następnie przygotowuje się materiał do posiewu.
Technika posiewów
Posiew mikrobiologiczny jest to przeniesienie badanego materiału na jałową pożywkę, którą umieszcza
się w zależności od oczekiwanego wyniku w inkubatorze. Wszystkie posiewy wykonuje się przestrzegając zasad
jałowości, czyli posiew wykonuje się przy zapalonym palniku, opalając wyloty naczyń i pipet w płomieniu
palnika, a także wyżarzając używane podczas posiewu ezy i igły.
Posiewy możemy również wykonać używając jałowych tamponów z waty lub gazy, a także tzw. głas zczek
(wygięta pod kątem szklana bagietka).
Rys.14 Pobieranie hodowli do ba-
dań ze skosu agarowego (2)
A  jałowienie ezy w płomieniu,
B  otworzenie probówki,
C  opalanie brzegu probówki,
D  pobieranie materiału,
E  opalanie brzegu probówki,
F  zamykanie probówki przy
palniku,
G  przenoszenie materiału (w
tym wypadku na szkiełko),
H  jałowienie ezy w płomieniu palnika
13
W zależności od sposobu nanoszenia materiału hodowlanego wyróżniamy metody:
·ð posiewów powierzchniowych  badany materiaÅ‚ wysiewamy na powierzchniÄ™ wczeÅ›niej zestalonej
pożywki
·ð posiewów wgÅ‚Ä™bnych  materiaÅ‚ wysiewamy bezpoÅ›rednio do naczyÅ„ przeznaczonych do hodowli,
zalewamy odpowiednią ilością schłodzonej pożywki, po czym całość mieszamy i pozostawiamy do
zestalenia.
Wykonywanie posiewów ezą
Ezę używamy do posiewów na podłożach płynnych lub na podłożach stałych w skosach agarowych w
probówkach albo też w płytkach Petriego.
Rys.15 Posiew za pomocą ezy na płytce Petriego - 1,
2, 3, 4 kolejność przenoszenia materiału
(17)
WykonujÄ…c posiew:
o na podłożu płynnym należy pobrać ezą badany materiał, a następnie zanurzyć w probówce z pożywką i
lekko potrząsając ezą wypłukać materiał z jej oczka
o na skosie agarowym pobieramy ezą badany materiał, a następnie dotykamy ezą powierzchni skosu i
ruchem falistym lub zygzakowatym przeciągamy ezę po powierzchni podłoża w kierunku wylotu
probówki
o na płytce Petriego odrobinę badanego materiału rozprowadza się zygzakiem lub promieniście na całej
powierzchni zestalonego podłoża agarowego lub też dzieli się je na sektory i w nich rozprowadza
materiał.
Wykonywanie posiewów igłą preparacyjną
Opaloną igłą pobieramy badany materiał, następnie wkłuwamy igłę w zestalone w probówce podłoże
agarowe lub żelatynowe w postaci słupka.
Wykonywanie posiewów pipetą
Pipeta służy do wykonania posiewu materiału płynnego. Wyjałowioną pipetą pobieramy określoną ilość
badanego materiału i przenosimy do pożywki płynnej (1 cm3), bądz
na zestalone podłoże agarowe w płytce
Petriego (0,1 lub 0,5 cm3). Wylany na płytkę materiał rozprowadzamy po całej powierzchni szklaną głaszczką
(metoda powierzchniowa).
Używając pipety można wykonać posiew metodą zalewową. Określoną ilość materiału (1 cm3) przenosimy do
płytki Petriego, następnie zalewamy upłynnionym i odpowiednio ochłodzonym
podłożem agarowym (9 cm3). Całość lekko mies zamy poruszając płytkę ruchem
kolistym po powierzchni stołu. Ten rodzaj posiewu jest wykorzystywany w
posiewach ilościowych i do izolacji czystych kultur.
Rys.16. Posiew metodÄ… powierzchniowÄ… (1) i zalewowÄ… (2) - (10)
14
Ryc.17. Sposoby wykonywania posiewów (2):
1 2
1  przesiew hodowli z probówki do probówki, 2  wylewanie hodowli płynnej na podłoże w płytce Petriego
Wykonywanie posiewów jałowym tamponem z gazy lub z waty
Przy pobieraniu materiałów z dużych powierzchni np.: stołów, naczyń, opakowań możemy używać
jałowego tamponu, którym pocieramy wybrany fragment badanej powierzchni, następnie wypłukujemy go w
odpowiednim rozcieńczalniku i wykonujemy posiew bezpośrednio z rozcieńczalnika.
Posiew ilościowy
Posiew ilościowy stosuje się w przypadku
konieczności oznaczenia liczby drobnoustrojów w
badanym materiale. Przygotowując próbę badanego
materiału do posiewu ilościowego należy zastosować
metodę kolejnych rozcieńczeń. W tym celu należy
odważyć lub odmierzyć określoną ilość produktu (1 lub 10
cm3 / g), po ewentualnym rozdrobnieniu umieścić w
naczyniu i zalać 9 lub 90 cm3 roztworu rozcieńczalnika.
Po dokładnym wymieszaniu uzyskuje się rozcieńczenie
wyjściowe 10-1 (1:10). Kolejne rozcieńczenie 10-2 (1:100)
sporzÄ…dza siÄ™ przenoszÄ…c 1 cm3 zawiesiny do kolejnej
probówki z 9 cm3 rozcieńczalnika. Sposób wykonania
kolejnych rozcieńczeń jest identyczny, a ich liczba zależy
od rodzaju badanego materiału.
Rys. 18. Metoda kolejnych rozcieńczeń (10)
Po sporządzeniu odpowiedniego rozcieńczenia wykonujemy posiew ilościowy metodą płytkową Kocha
(zalewową lub powierzchniową). Po okresie inkubacji do pomiarów bierze się te płytki na których liczba kolonii
mieści się w granicach od 30 do 200.
IZOLACJA SZCZEPÓW UŻYTECZNYCH PRZEMYSA
OWO
Technologie, w których stosowane są mikroorganizmy wymagają używania szczepów o określonych
właściwościach metabolicznych. y
ródłem poznanych i opisanych szczepów drobnoust rojów mogących znalez
ć
zastosowanie w procesach biotechnologicznych mogą być organizmy przechowywane w kolekcjach placówek
naukowych, firm biotechnologicznych a także (a może nawet przede wszystkim) w dużych kolekcjach
centralnych, takich jak najbardziej znana amerykańska kolekcja American Type Culture Collection (ATCC), czy
też jej polski odpowiednik: Polska Kolekcja Mikroorganizmów (PCM). Niewyczerpanym wręcz rezerwuarem
szczepów jest środowisko naturalne ze szczególnym uwzględnieniem gleby. Wśród mikroo rganizmów
glebowych możemy wyróżnić: wirusy (reprodukujące się w komórkach roślin, zwierząt i człowieka oraz
bakteriofagi), grzyby oraz bakterie (w tym promieniowce), które stanowią podstawową masę mikroorganizmów
glebowych.
W jednym gramie gleby uprawnej występuje:
vð 106-108 komórek bakterii,
vð 104-106 konidiów promieniowców,
vð 102-104 zarodników grzybów.
15
Występujące w glebie bakterie właściwe, promieniowce oraz grzyby zdolne są do biosyntezy:
Fð antybiotyków,
Fð witamin,
Fð kwasów organicznych,
Fð przeprowadzania reakcji rozkÅ‚adu ksenobiotyków, biaÅ‚ek, wielocukrów, lipidów
Fð biotransformacji zwiÄ…zków steroidowych lub antybiotyków.
W celu pozyskania nowych drobnoustrojów ze środowiska opracowano specjalne programy i metody
skriningowe. Skrining czyli przesiewanie drobnoustrojów lub produktów ich metabolizmu definiowany jest jako
kompleksowe postępowanie, obejmujące zespół selektywnych zabiegów mających na celu wykrycie i
izolowanie spośród dużej liczby możliwych, tylko tych drobnoustrojów (lub ich metabolitów), które są celem
badań, oraz wstępną ocenę ich przydatności. W celu dokonania oceny przydatności organizmów do procesów
biotechnologicznych, w tym do produkcji antybiotyków bądz
innych substancji aktywnych biologicznie, należy
je namnożyć i testować w postaci czystych kultur. Podstawową metodą izolacji czystych kultur jest
rozcieńczenie populacji organizmów w roztworze fizjologicznym chlorku sodu bądz
odpowiednim podłożu.
Następnie wykonuje się posiew rozcieńczonych zawiesin na płytki Petriego z podłożem stałym od powiednio
dobranym, stymulującym wzrost poszukiwanych przez nas organizmów. Jeżeli na pojedyncze płytce wyrasta
kilka lub kilkanaście kolonii, istnieje bardzo duże prawdopodobieństwo, że wyrosły one z pojedynczych
komórek i możemy w ten sposób uzyskać czys tą kulturę danego organizmu. Stymulację wzrostu pożądanych
mikroorganizmów uzyskać można poprzez wspomniany już wcześniej dobór składu chemicznego pożywki:
zastosowanie selektywnych inhibitorów (np. antybiotyków), ale również poprzez dobór odpowiedniego pH,
temperatury oraz natlenienie.
Tabela 2. Wybrane czynniki selekcyjne, stymulujące wzrost określonych organizmów.
organizmy których wzrost
poszukiwany organizm czynniki selekcyjne
zostaje zahamowany
dodatek do pożywki nowobiocyny,
promieniowce bakterie i grzyby
penicyliny G i cykloheksymidu
zahamowanie wzrostu
dodatek do pożywki propionianu
większości mikroorganizmów
sodowego
poza promieniowcami
dodatek do pożywki nystatyny lub
bakterie (w tym promieniowce) grzyby
cykloheksimidu
alkalizacja środowiska, np. przez
zmieszanie próbki gleby z kredą i grzyby
inkubację przez około 7-9 dób
dodatek do pożywki streptomycyny
grzyby bakterie
lub tetracykliny
dodatek penicyliny lub D-cykloseryny
bakterie, promieniowce, grzyby eliminacja bakterii Gram +
dodatek polimyksyn eliminacja bakterii Gram -
1-2 minutowe ogrzanie próbki do
bakterie przetrwalnikujÄ…ce wszystkie inne
temp. 1000C
Gdy pobieramy szczep ze środowiska, musimy go wyizolować. Jakie kryteria musi spełniać ten szczep?
1. Czy szczep produkuje interesujÄ…cy nas metabolit?
- Musimy zastanowić się, gdzie, w jakim środowisku, będzie największa szansa na znalezienie organizmu o
interesujących nas właściwościach
16
- Często poszukuje się organizmów ekstremofilnych, produkują one enzymy, które są przy stosowane do
katalizowania reakcji w warunkach ekstremalnych, np. odporne na bardzo wysokie temperatury, różne zakresy
pH, zasolenie, dzięki użyciu takich enzymów nie musimy zapewniać komórkom cieplarnianych warunków
Aby wyizolować interesujący nas szczep z dużej ilości mikroorganizmów, używamy testów przesiewowych
(screeningowych). Test przesiewowy musi być prosty i tani, aby pozwolić na szybkie przesiewanie dużej ilości
komórek.
Przykład:
- Poszukujemy enzymów proteolitycznych
- Posiewamy mikroorganizmy na podłoże zawierające białko, zazwyczaj kazeina, białko mleka
- Na podłożu rosną sobie różne szczepy
- Po 48h wlewamy na płytkę kwas trójchlorooctowy, powoduje on wytrącanie (koagulacje) białka
- W miejscach, gdzie kolonia nie rozkłada białka, otrzymujemy mętny  placek wokół kolonii, wokół tych, które
rozkładają białko, pojawia się rozjaśnienie
- Teraz ju ż mo żna łatwo wyizolować kolonie produkujące enzymy proteolityczne.
Gdy nie mamy testu przesiewowego, można brać pod uwagę grupę taksonomiczną. Izolujemy dana grupę, np.
Streptomyces, gdy szukamy jakiegoÅ› antybiotyku, i dopiero w tej grupie szukamy konkretnego szczepu.
Po przesiewach nadal mamy bardzo dużo organizmów producenckich. Do selekcji używamy kolejnych
kryteriów.
2. Wymagania żywieniowe  szukamy szczepu, który pożywia się na tanim z
ródle węgla, posiewamy komórki
na określone podłoża z różnymi z
ródłami węgla, sprawdzamy, czy szybko się mnożą i czy produkują nasz
związek, odrzucamy organizmy, które wymagają drogich z
ródeł węgla, wybieramy te, które wymagają tanich.
3. Optymalna temperatura wzrostu  zazwyczaj wybieramy te, dla których optimum temperatury jest powyżej
40°C, w produkcji przemysÅ‚owej Å‚atwiej jest podgrzać niż ochÅ‚odzić, izolacja jest bardzo prosta, prowadzimy
hodowle w danej temperaturze, sprawdzamy, które się szybciej mnożą, produkują więcej metabolitu
4. Czy organizm będzie można hodować w urządzeniach, które już posiadamy?
Np. jeśli mamy aparaturę tlenową, nie szukamy beztlenowców, można przetestować efektywność organizmów
stosując różne rodzaje mieszania, natleniania, itp
PRZECHOWYWANIE SZCZEPÓW
Musimy je przechowywać tak, aby nie uległy zmianom genetycznym, aby nie doszło do zakażenia, muszą
zachować żywotność i praktyczność.
1. Obniżanie temperatury  spowolnienie procesów metabolicznych lub ich całkowite zahamowanie.:
·ð ðNa skosach agarowych, w lodówce w temperaturze 5-10°C, można je przechowywać
maksymalnie pół roku.
·ð ðW ciekÅ‚ym azocie (<150°C)  można przechowywać do kilkudziesiÄ™ciu lat, komórki mus za być
odpowiednio przygotowane, zawiesza się je w glicerolu, zamyka w ampułkach, poddaje
powolnemu zamrażaniu, wysokie koszty przechowywania.
Do bieżącego użytku przechowujemy bakterie na skosach w lodówce, ale zaws ze przechowujemy
żelazną rezerwę komórek trzymanych w inny sposób np. w ciekłym azocie
2. Odwadnianie komórek  powoduje to spowolnienie procesów metabolicznych:
ð ð ð ð ð ð ð ð·ð ðPosiew na podÅ‚oże staÅ‚e np. gleba, produkty spożywcze, doprowadza siÄ™ do wzrostu i powoli
suszy (w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni), pozwala przechowywać szczepy przez
długi czas (kilkadziesiąt lat), głównie przechowuje się w ten sposób grzyby i promieniowce
·ð ðLiofilizacja  odwadnia siÄ™ komórki w obniżonej temperaturze, zamraża siÄ™ komórki w pÅ‚ynnym
podłożu, następnie odpompowuje się powietrze, obniża się ciśnienie, co powoduje, że lód
przechodzi ze stanu stałego w parę, podłoże zawiera czynniki chroniące np. mleko, surowica,
glutaminian sodu, ampułki z takimi zliofilizowanymi komórkami mo żna przechowywać
minimum 10 lat, nie trzeba utrzymywać niskiej temperatury, przy zamrażaniu komórki mogą
ulec zniszczeniu i nie ws zystkie komórki mogą być zliofilizowane.
17
SPOSOBY PROWADZENIA PROCESÓW MIKROBIOLOGICZNYCH
HODOWLA OKRESOWA
Najczęściej wykorzystywany rodzaj hodowli laboratoryjnej, ma również zastosowanie w wielu gałęziach
przemysłu
(browarnictwo, winiarstwo, mleczarstwo, drożdżownictwo).
W hodowli okresowej:
- substraty odżywcze dostarczane są jednorazowo w początkowej fazie procesu
- ze środowiska hodowli nie usuwa się biomasy ani metabolitów (wyjątek mogą stanowić produkty
gazowe)
6 faz wzrostu mikroorganizmów w hodowli okresowej
1) faza spoczynkowa (lag faza, faza przygotowawcza)  rozpoczyna siÄ™ w momencie wprowadzenia
drobnoustrojów do środowiska, a kończy z pierwszym podziałem lub pączkowaniem komórek. Liczba
komórek nie wzrasta. Następuje aktywacja przemiany materii. Czas trwania zale ży od wieku komórek i
rodzaju podłoża, z jakiego je przeszczepiono,
2) faza przys pieszenia (faza akceleracji)  wzrasta tempo namnażania komórek, komórki są młode,
mają intensywny metabolizm, są wrażliwe na działanie czynników zewnętrznych,
3) faza wykładnicza (logarytmiczna)  wzrost populacji ma charakter nieograniczonego wzrostu
wykładniczego, czas generacji (podwojenia biomasy) jest minimalny, właściwa szybkość wzrostu jest
maksymalna,
4) faza opóz
nienia  na skutek spadku stężenia substratów i nagromadzania się szkodliwych
metabolitów zwalnia się tempo przyrostu biomasy, liczba komórek w populacji oraz biomasa osiągają
pod koniec tej fazy wartość maksymalną,
5) faza stacjonarna (zastoju)  tempo przyrostu komórek jest równoważone szybkością ich zamierania
(równowaga dynamiczna), wzrost populacji ulega zahamowaniu, stężenie biomasy zachowuje wartość
maksymalną, w czasie tej fazy wyznacza się maksymalny plon biomasy "Xmax (różnica między
maksymalnym stężeniem biomasy Xmax oznaczonym w tej fazie, a stężeniem początkowym X0)
"Xmax = Xmax  X0
6) faza zamierania (letalna)  więcej komórek zamiera niż powstaje w wyniku podzia łów, mo że
zachodzić autoliza komórek.
WZROS T W HODOWLI CI
GA
EJ
Po osiągnięciu przez mikroorganizmy wybranej fazy wzrostu następuje stałe zasilanie hodowli strumieniem
świeżej pożywki. Jednocześnie z fermentora odprowadzana jest taka sama ilość podłoża za wierającego biomasę
i szkodliwe metabolity. Objętość hodowli w trakcie trwania procesu pozostaje niezmienna. Niezbędne jest zatem
utrzymanie równowagi dynamicznej między biomasą wypłukiwaną a namnażaną.
Zalety:
Øð wyeliminowanie wpÅ‚ywu czasu na warunki hodowli i fizjologiÄ™ drobnoustrojów,
Øð możliwość prowadzenia hodowli w dowolnie dÅ‚ugim czasie w warunkach ustalonych,
Øð możliwość regulacji stanu fizjologicznego drobnoustrojów przez dobór szybkoÅ›ci zasilania substratem i
dobór składu pożywki zasilającej hodowlę,
Øð jednorodność stanu fizycznego i chemicznego hodowli,
18
Øð możliwość automatyzacji procesu,
Øð wiÄ™ksza szybkość i wydajność procesów,
Øð efektywniejsze wykorzystanie aparatury.
Wady i trudności:
üð niebezpieczeÅ„stwo degeneracji szczepów i opanowania hodowli prze z mutanty o niekorzystnych
własnościach technologicznych,
üð trudnoÅ›ci z utrzymaniem aseptycznych warunków w bioreaktorze,
üð niekorzystne wskaz
niki reologiczne wynikające z tworzenia wielokomórkowych agregatów, zarastanie
biomasą ścian i przewodów fermentora,
üð niesprzyjajÄ…ce warunki produkcji niektórych substancji wytwarzanych przez komórki nie rosnÄ…ce,
üð niedostateczna znajomość dynamicznych wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci drobnoustrojów w hodowli ciÄ…gÅ‚ej.
HODOWLE TLENOWE
1. Powierzchniowa
Na powierzchni pożywek zestalonych agarem lub żelatyną oraz na pożywkach płynnych
drobnoustroje rosną w postaci kolonii, których struktura, zabarwienie, linia brzegowa są
diagnostycznymi cechami charakterystycznymi dla danego gatunku. Hodowle powierzchniowe na
podłożach zestalonych lub płynnych prowadzi się w warunkach statycznych.
2. Statyczna
Prowadzona jest w cieplarce lub w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze. Hodowle na
skutek wyczerpania składników odżywczych i gromadzenia produktów przemiany materii wymagają
okresowego przesiewania na świeżą pożywkę. Służą najczęściej do otrzymywania czystych kultur
drobnoustrojów oraz badań (morfologii, fizjologii, biochemii).
3. Wgłębna
Wzrost zachodzi w całej objętości pożywki, która jest intensywnie mieszana lub wytrząsana, co
zapewnia ciągły ruch pożywki, napowietrzenie, nie opadanie mikroorganizmów (wyjątek stanowi
Leuconostoc mesenteroides nie wymaga ani mieszania ani napowietrzania). Na mniejszÄ… skalÄ™
prowadzone są w kolbach płaskodennych, na większą w bioreaktorach z zapewnion ym
napowietrzaniem. Mogą być prowadzone metodą okresową lub ciągłą.
4. Ciągła
BIOSYNTEZA METABOLITÓW PRZEZ MIKROORGANIZMY
Podział metabolitów:
- pierwotne  związki niskocząsteczkowe, są konieczne do wzrostu komórek, np. aminokwasy, monosacharydy
- wtórne  często związki wielkocząsteczkowe, ich synteza zachodzi póz
niej podczas wzrostu hodowli, nie sÄ…
potrzebne do wzrostu komórki, są ważne z punktu widzenia przeżycia producenta
Jeśli chcemy otrzymywać metabolity pierwotne, musimy utrzymywać hodowle (ciągła) na etapie wzrostu
logarytmicznego, gdy chcemy metabolity wtórne  etap fazy stacjonarnej.
Jak przekonać komórkę, aby produk owała dany produkt?
Każdy organizm ma mechanizm kontroli, np.
Sprzężenie zwrotne  końcowy produkt szlaku metabolicznego hamuje cały szlak np.:
19
Jako inhibitor pierwszego enzymu ze szlaku  gdy stężenie produktu końcowego dojdzie do pewnego poziomu,
zachodzi inhibicja enzymu, gdy wyczerpuje siÄ™ produkt, cykl rusza od nowa
Produkt mo że też być represorem genu kodującego enzym, enzym w ogóle nie powstaje  większą oszczędność.
By komórka nadprodukowała dany produkt, trzeba ominąć system kontroli:
- Utrzymujemy stężenie produktu końcowego na niskim poziomie przez zwiększenie przepuszczalności błony,
np. dodajemy do podłoża antybiotyki uszkadzające błonę lub otrzymujemy szczep mutantów, które nie
wytwarzają błony, w ten sposób produkujemy kwas glutaminowy, ten sposób dodatkowo pozwala na łatwiejsze
uzyskanie produktu z komórki
- Wprowadza się zmiany genetyczne, które sprawiające, że organizm wytwarza enzym niewra żliwy na
sprzężenie zwrotne, wtedy szlak metaboliczny działa niezależnie od stężenia produktu końcowego, ten sposób
jest trudniejszy do wykonania
Podstawowy szlak regulacji metabolizmu to s przężenie zwrotne.
Enzym, którego synteza jest regulowana przy udziale końcowego produktu szlaku metabolicznego (mechanizm
represji) nazywamy enzymem represyjnym. Represorem mogą też być produkty pośrednie w szlaku
metabolicznym.
Znajomość mechanizmu regulacji jest bardzo ważna, gdy chcemy otrzymywać produkt końcowy lub sam enzym.
Przykłady omijania:
Komórki mutujemy tak, aby nie wytwarzały biotyny (która jest składnikiem błony komórkowej), zwiększa się
przepuszczalność błony komórkowej, taka komórka nie zatrzymuje produktu końcowego, nie następuje
sprzężenie zwrotne, komórka jest nadproducentem
 penicyliny, która uszkadza ścianę komórkową, przez to zwiększa się przepuszczalność
komórki
Represja kataboliczna  przy danym środowisku, komórka nie produkuje danego enzymu, dopiero zmiana w
środowisku prowadzi do uruchomienia jakiegoś szlaku metabolicznego, może to być np. ubytek określonego
z
ródła węgla. Niektóre komórki mogą być wrażliwe na własny antybiotyk, zwłaszcza w fazie wzrostu
logarytmicznego, gdzie przeważają młode, szybko dzielące się komórki. Natomiast w fazie stacjonarnej
przeważają dojrzałe komórki, bardziej odporne na własny antybiotyk. W tej fazie można sobie pozwolić na
produkcję antybiotyku. Może on eliminować szczepy konkurenckie, które zaczynają się namnażać. Komórka
zaczyna produkować antybiotyk gdy zabraknie jakiegoś składnika, np. z
ródła węgla, azotu czy fosforu.
Odpowiednio dobierając skład podłoża, możemy sterować produkcją antybiotyków. Obecność jakichś związków
w podłożu może indukować jakiś szlak metaboliczny. Związki te nazywamy induktorami.
Produkcja wielu antybiotyków również działa na zasadzie sprzężenia zwrotnego, np.
penicyliny, chloramfenikolu.
Jeżeli mamy komórki zmutowane tak, aby nadprodukowały jakiś związek (np. nie produkują biotyny)
otrzymujemy produkcje metabolitu nawet 1000-krotnie większą, musimy jednak zachować idealne warunki
sterylne, ponieważ w przypadku, gdy dojdzie do zakażenia jakimś dzikim szczepem, będzie on lepiej
przystosowany i wyprze nasz szczep producencki.
20
IMMOBILIZACJA W BIOTECHNOLOGII
ENZYMY
Enzymy to białka posiadające zdolność do katalizowania specyficznej reakcji. Enzymy charakteryzują
się wyjątkowo wysoką specyficzną aktywnością katalityczną. Różnorodność reakcji przebiegających przy
udziale enzymów jest ogromna; katalizują one wszystkie reakcje biochemiczne przeprowadzane przez żywa
komórkę.
Są to zwykle duże polipeptydy, zawierające w sek wencji ponad 100 aminok wasów. W stanie aktywnym
takie białko  katalizator, czyli enzym ma tylko jedną, określoną strukturę przestrzenną (opisuje ją
konformacja łańcucha głównego polipeptydu).
Miejsce wiÄ…zania substratu nazywa siÄ™ miejscem aktywnym. Do tego miejsca aktywnego
dopasowany jest zwykle tylko jeden, określony substrat. Ta cecha nazywa się specyficznością substratową
enzymu.
Jako katalizator enzym nie zmienia stanu równowagi reakcji chemicznej, tylko przyspiesza jego osiągnięcie.
Reakcja przemiany substratu S w produkt P przechodzi przez stan przejściowy. Wartość energii swobodnej stanu
przejściowego jest zdecydowanie wyższa niż energia swobodna substratu i produktu. W warunkach
fizjologicznych energia wewnętrzna układu jest na tyle niska, że nie wystarcza na pokonanie progu
energetycznego stanu przejścia. Enzym, jako katalizator obniża znacznie energię aktywacji  energię swobodną
Gibbs a oznaczaną jako .G. Enzymy mają niezwykle dużą siłę katalityczną - w obecności enzymu reakcja
zachodzi o kilka rzędów wielkości szybciej.
Budowa enzymów
Wiele enzymów białkowych ma bardzo złożoną strukturę. Oprócz części białkowej - apoenzymu zbudowanego
z jednego lub kilku łańcuchów polipeptydowych, występuje w nich również niebiałkowa, trwale związana z
cząsteczką enzymu grupa prostetyczna (np. jon metalu) lub nietrwale związany koenzym (np. witamina). Cały
tego typu kompleks nazywany jest holoenzymem. Centrum aktywne enzymu, a więc rejon odpowiedzialny za
katalizowanie reakcji stanowi z reguły niewielki rejon cząsteczki enzymu.
Właściwości środowiska mają wpływ na aktywność enzymów
Szybkość procesu enzymatycznego zależy od łatwości tworzenia kompleksu enzymu z substratem
(powinowactwo enzymu do substratu). Zależność tę przedstawia równanie matematyczne L. Michaelisa i M.L.
Menten, zawierające tzw. stałą Michaelisa charakterystyczną dla danego enzymu.
Szybkość reakcji zależy nie tylko od stężenia enzymu i substratu, lecz także od:
- temperatury (optimum dziaÅ‚ania enzymu zwykle mieÅ›ci siÄ™ w granicach 30 40°C).
Wyższe temperatury powodują z reguły trwałe unieczynnienie enzymu poprzez
denaturację jego struktury  wyjątkiem są tu enzymy niektórych archeonów i bakterii
zasiedlających środowiska ekstremalne, których enzymy osiągają optymalną
aktywność w temperaturach 80-90oC.
- stężenia jonów wodorowych (optymalne pH reakcji jest różne dla różnych
enzymów. Większość enzymów działa optymalnie w pH bliskim obojętnego, chociaż
na przykład niektóre enzymy trawienne wydzielane w soku żołądkowym, lub enzymy
obecne w lizosomach katalizują reakcje przy silnie kwasowym pH rzędu 2-3.
- obecności enzymatycznych aktywatorów i enzymatycznych inhibitorów.
Istnieje wiele typów cząsteczek , które są zdolne do zakłócania aktywności danego enzymu. Każda cząsteczka
działająca bezpośrednio na enzym w kierunku zmniejszenia jego aktywności katalitycznej jest określana jako
inhibitor.
21
Rozróżnia się dwa główne typu inhibicji :
- nieodwracalnÄ…
- odwracalnÄ…
Inhibicję odwracalną można podzielić na:
1) kompetycyjnÄ…
2) niekompetycyjnÄ…
Inhibicja nieodwrcalna polega na wiązaniu się inhibitora i enzymu w sposób trwały , nieodwracalny, często
tworząc wiązania kowalencyjne z resztami aminokwasów, znajdującymi się w miejscu aktywnym lub jego
pobliżu i w ten sposób inaktywują enzym na stałe. W wiązaniu tym biorą udział reszty Ser i Cys mające,
odpowiednio, reaktywne grupy -OH i -SH .
Inhibitor kompetycyjny jest zazwyczaj strukturalnie podobny do
normalnego substratu danego enzymu. Dzięki temu
współzawodniczy z cząsteczkami o wiązanie się z miejscem
aktywnym. Enzym może się wiązać albo z cząsteczkę substratu,
albo cząsteczkę inhibitora, ale nie z obiema jednocześnie.
Inhibitor kompetycyjny wiąże się z miejscem aktywnym
odwracalnie.
Przy dużych stężeniach substratu działanie inhibitora
kompetycyjnego zostaje przezwyciężone , ponieważ duże stężenie
substratu będzie z powodzeniem współzawodniczyć z cząsteczką
inhibitora o wiązanie się w miejscu aktywnym. Nie nastąpi więc żadna zmiana w wartości Vmax enzymu , ale w
obecności inhibitora kompetycyjnego zmniejsza się powinowactwo enzymu do jego substratu i dlatego wartość
Km wzrasta.
Inhibitor niekompetycyjny wiąże się odwracalnie w innym
miejscu enzymu niż jego miejsce aktywne i powoduje zmianę
przestrzennego kształtu enzymu, co prowadzi do zmniejszenia
aktywności katalitycznej. Ponieważ inhibitor wiąże się w innym
miejscu niż substrat, enzym może wiązać albo inhibitor, albo
substrat równocześnie.
Efektu inhibitora niekompetycyjnego nie można przezwyciężyć
przez zwiększanie stężenia substratu i dlatego zmniejsza się
wartość Vmax . W inhibicji niekompetycyjnej powinowactwo
enzymu do substratu pozostaje nie zmienione, a więc wartość Km
nie zmienia siÄ™ .
Kataliza enzymatyczna
W czasie katalizy enzymatycznej cząsteczka substratu jest wiązana w określonym obszarze cząsteczki enzymu w
tzw. centrum aktywnym, w którym w enzymach złożonych znajduje się grupa prostetyczna; tworzy się wówczas
kompleks enzym substrat. Dzięki swoistemu układowi grup chemicznych w centrum, enzym oddziałuje na
grupy chemiczne substratu rozluz
niając określone wiązanie chemiczne. Po powstaniu produktów re akcji
cząsteczka enzymu uwalnia się z kompleksu i po powrocie do formy pierwotnej (w enzymach złożonych po
przyłączeniu przenoszonych grup do innego związku) tworzy nowy kompleks z następną cząsteczką substratu
itd.
Wyróżniamy dwa typy mechanizmów łączenia się enzymu z substratem:
-model klucza i zamka  gdzie enzym, tzn. jego miejsce aktywne, musi być dopasowany swoim ks ztałtem do
substratu by móc przekształcić go w produkt. Teoria ta jednak ma już tylko znaczenie historyczne
- model indukowanego dopasowania -mechanizm opierający się na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu
lub odpowiedniej grupy substratów i przekształceniu ich w produkty. Poza tym enzym może zniekształcić
substrat wymuszając w nim konformację podobną do stanu przejściowego. Przykładem może być związanie
glukozy z heksokinazÄ….
22
Enzymy wyodrębniane są z tkanek roślinnych i zwierzęcych oraz z drobnoustrojów. Niezależnie od
z
ródła pochodzenia mogą one katalizować te same reakcje chemiczne, ale nie muszą posiadać identycznej
budowy chemicznej.
W wyniku rozwoju biotechnologii obecnie podstawowe z
ródło enzymów stanowią drobnoustroje.
Mikroorganizmy te podczas hodowli korzystają ze składników pożywki, które ze względu na małe wymiary
mogą dyfundować przez ścianę komórkową. Po ich wyczerpaniu komórki wydzielają do środowiska enzymy,
które degradują makrocząsteczki do małych rozpuszczalnych cząsteczek, ulegających przyswojeniu.
Organizmy niosą w swoim materiale genetycznym informację o syntezie szerokiego zakresu enzymów
pozakomórkowych. Są one wytwarzane jedynie w obecności induktorów lub ich analogów strukturalnych, które
indukują syntezę enzymów niezbędnych do rozkładu tych substancji. Wydajność enzymu jest determinowana
przez potencjalne możliwości użytego szczepu i warunki hodowli.
Regulacja syntezy enzymów odbywa się m.in. poprzez zjawisko represji i depresji genu operatorowego
kontrolującego syntezę danego enzymu. Geny strukturalne dla wielu enzymów są nieaktywne w wyniku represji
genu operatorowego przez represor, który jest wytwarzany przez gen regulatorowy. Depresja następuje po
inaktywacji represora na skutek jego zwiÄ…zania przez swoisty dla danego enzymu substrat lub jego strukturalny
analog. Tak więc obecność substratu indukuje biosyntezę enzymu.
Na wydajność biosyntezy enzymu wpływają również własności fizyczne środowiska: temperatura,
potencjał redox, pH, napięcie powierzchniowe, fazy środowiska: ciekła-stała.
Metody izolacji i oczyszczania enzymów
Wykonanie szybkiej i wydajnej izolacji enzymu wymaga spełnienia kilku podstawowych warunków:
vð Wybór dobrego z
ródła enzymu (tkanki roślinne, zwierzęce, komórki mikroorganizmów), przy
zwróceniu uwagi na:
" łatwość i wydajność separacji interesującego enzymu
" dostępność oraz koszt uzyskania surowca
" właściwości otrzymywanego enzymu (np. enzymy o dużej termostabilności musimy izolować
najczęściej z organizmów termofilnych)
Obecnie coraz częściej w celu uzyskania potrzebnych białek doprowadza się do ich nadprodukcji w komórkach
bakteryjnych, drożdżowych lub w hodowlach komórek ssaczych. Otrzymane w ten sposób białka nazywane są
białkami rekombinowanymi. Zaletą tych technik jest możliwość otrzymania dużej ilości potrzebnego białka, a
jego oczyszczanie do homogenności jest stosunkowo proste.
vð ðZachowanie warunków pozwalajÄ…cych na otrzymanie enzymu bez utraty jego aktywnoÅ›ci
katalitycznej, tj. :
żð utrzymanie odpowiedniej temperatury (najczęściej ok. 0oC) i pH (najczęściej w granicach 5-9),
żð ograniczenie denaturacji powierzchniowej (tj. pienienia roztworów) oraz inaktywacji przez metale
ciężkie
żð zabezpieczenie przed dziaÅ‚aniem proteaz
żð zapewnienia wysokiej czystoÅ›ci pracy, aby nie doprowadzać do wtórnego zanieczyszczenia
proteazami i innymi substancjami hamującymi aktywność (p.w.)
Dla każdego enzymu powinno się zastosować indywidualny schemat o czyszczania wykorzystujący jego
własności fizykochemiczne.
Pierwszym krokiem przy oczyszczaniu białek jest przeprowadzenie ich do roztworu, chyba że izolujemy je z
płynnego z
ródła (np. z krwi, śliny itp.). Stosuje się w tym celu techniki doprowadzające do zniszczenia ścian,
błon komórkowych lub struktury całych komórek (dezintegracja komórek), takie jak: degradacje ścian
komórkowych przez lizozym, rozrywanie komórek pod wpływem ciśnienia osmotycznego, sonifikację (pękanie
komórek pod wpływem wibracji wywołanych ultradz
więkami) oraz homogenizacje, rozcieranie z piaskiem lub
perełkami szklanymi i inne metody mechaniczne.
Enzymy rozpuszczalne łatwo poddają się procesowi ekstrakcji wodą lub rozcieńczonymi roztworami soli i
buforami. Natomiast związane z błonami wymagają użycia roztworów detergentów lub rozpuszczalników
organicznych, które rozpuszczają lipidy.
23
Dalsze metody stosowane w celu otrzymania preparatu enzymatycznego są bardzo różnorodne i ich stosowanie
zależy od aktualnego i pożądanego stopnia oczyszczenia enzymu.
Najczęściej stosowanymi wstępnymi procesami oczyszczania są:
Fð frakcjonowanie roztworami soli (np. siarczanem amonu)
Fð ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi (np. etanolem, acetonem lub eterem).
Metody te opierają się na odciąganiu wody z roztworów koloidalnych, jakie tworzą białka (w tym enzymy).
Ponieważ białka są cząsteczkami zawierającymi różne ilości grup kwasowych i zasadowych, ich
rozpuszczalność zależy od stężenia rozpuszczonej soli, polarności i pH rozpuszczalnika oraz temperatury.
Dlatego pewne białka wypadają z roztworu, podczas gdy inne w tych samych warunkach nadal tworzą roztwór
koloidalny. Przez odpowiedni dobór stężenia soli odwadniających można przeprowadzić ich stopniowe
wytrącanie, np. odwodnienie globulin nastąpi już przy 50 %-wym wysyceniu roztworu siarczanem amonu, a
albumin dopiero przy całkowitym wysyceniu roztworu siarczanem amonu.
Mieszające się z wodą rozpuszczalniki organiczne, takie jak etanol czy aceton, obniżają zdolność działania wody
jako rozpuszczalnika, dzięki czemu bardzo dobrze strącają białka. Mieszaninie z woda w różnych proporcjach
pozwalają na wybiórcze strącanie białek. Proces ten należy prowadzić w temperaturze 0oC lub niższej, ponieważ
w wyższych temperaturach nastąpi ich denaturacja.
Otrzymane osady białkowe oddzielane są metodami filtracji lub wirowania. Następnie są rozpuszczane, a w
przypadku wykorzystywania procesów wysalania mogą być poddawane dializie. Dializę stosuje się w celu
usunięcia niskocząsteczkowych związków (np. soli) z roztworu białka, umieszczonego wewnątrz
półprzepuszczalnej membrany. Na zewnątrz znajduje się roztwór o niskiej sile jonowej. Niskocząsteczkowe
substancje, dążąc do wyrównania ciśnień osmotycznych po obu stronach membrany dializacyjnej, migrują przez
niÄ… do otaczajÄ…cego ro ztworu.
Kolejnymi etapami, stosowanymi dla dalszego oczyszczania preparatów enzymatycznych, mogą być:
üð chromatografia
üð elektroforeza
üð ultrawirowanie.
W zależności od rodzaju stałej i ruchomej fazy wyróżniamy różne typy chromatografii, np. w chromatografii
cieczowej fazy stanowią dwie niemieszające się ciecze, z których jedna związana z nieruchomym nośnikiem
stanowi fazę nieruchomą, a druga fazę ruchomą. Ponieważ różnice pomiędzy rozdzielanymi związkami dotyczą
wielu ich właściwości (hydrofobowości, rozpuszczalności w wybranych rozpuszczalnikach, kształtu cząsteczek
itd.), wśród metod chromatograficznych wykorzystywanych w procesach oczyszczania wyróżniamy:
·ð chromatografiÄ™ wymiany jonowej  wykorzystuje różnice w sumarycznym Å‚adunku na
powierzchni białka
·ð chromatografiÄ™ adsorpcyjnÄ…  oparta na różnicach współczynnika adsorpcji adsorbenta w
stosunku do poszczególnych składników mieszaniny
·ð chromatografiÄ™ podziaÅ‚owÄ…  wykorzystuje różnice współczynników podziaÅ‚u skÅ‚adników
mieszaniny pomiędzy dwie niemieszające się fazy
·ð sÄ…czenie molekularne (chromatografia sitowa)  rozdziela czÄ…steczki w zależnoÅ›ci od ich
kształtu i wielkości
·ð chromatografiÄ™ powinowactwa  oparta na sile powinowactwa czÄ…steczek biaÅ‚ka do ligandu
wiązanego z faza stałą. Jest to szczególny typ chromatografii powinowactwa.
Szczególnymi przypadkami tej chromatografii są:
vð chromatografia kowalencyjna  wykorzystujÄ…ca zdolność zwiÄ…zków zawierajÄ…cych
grupy tiolowe do wiązania z grupami tiolowymi złoża
vð chromatografia chelatujÄ…ca  oparta na zdolnoÅ›ci odwracalnego wiÄ…zania metali
przez białka
vð chromatografia oddziaÅ‚ywaÅ„ hydrofobowych  wykorzystujÄ…ca różnice siÅ‚
oddziaływań białek z bardzo hydrofobowymi ligandami związanymi z nośnikiem.
Należy przy tym pamiętać, że duże stężenia soli stosowane w trakcie wysalania
powodują wzrost hydrofobowości oczyszczanych białek.
vð chromatografia fazy odwróconej  nie znajduje praktycznie zastosowania w
preparatywnym oczyszczaniu enzymów, ponieważ wymaga stosowania niepolarnych
rozpuszczalników (denaturujących cząsteczkę) do elucji białek związanych z silnie
hydrofobowym ligandem.
24
IMMOBILIZACJA
Mimo imponujących właściwości enzymów, takich jak: wysoka aktywność katalityczna, unikalna
specyficzność, zdolność działania w łagodnych warunkach (temperatura otoczenia, normalne ciśnie nie, wodne
roztwory) posiadają one poważne wady: więks zość z nich nie posiada dostatecznej stabilności w warunkach
przemysłowych, trudno je oddzielić od produktów reakcji, ze względu na rozpuszczalność w wodzie nie można
ich stosować wielokrotnie. Chcąc obejść te problemy zastosowano enzymy immobilizowane.
Immobilizacja, czyli unieruchomienie enzymu polega na jego przekształceniu ze stanu
rozpuszczalnego w wodzie  ruchomego, do stanu nierozpuszczalnego w wodzie  unieruchomionego.
Stabilność (trwałość) to podstawowa cecha biotechnologiczna enzymu. Unieruchomienie enzymów w wielu
przypadkach prowadzi do podwyżs zenia ich stabilności  wzajemne przestrzenne utrwalenie cząsteczek
zapobiega międzycząsteczkowej agregacji. Enzymy nierozpuszczalne są odporniejsze na ogrzewanie i
przechowywanie.
Enzymy immobilizowane wykazujÄ… wiele zalet takich jak:
żð możliwość wielokrotnego użycia lub wykorzystania w procesach ciÄ…gÅ‚ych,
żð immobilizacja może stabilizować strukturÄ™ biaÅ‚ek, dziÄ™ki czemu zwiÄ™kszona jest ich termostabilno ść i
odporność na działanie czynników denaturujących,
żð możliwość stosowania enzymów w Å›rodowisku organicznym,
żð ograniczenie inhibicji enzymu, zarówno przez substrat jak i przez produkt, podnosi wydajność procesu
biokatalizy
żð Å‚atwość wydzielania produktu i biokatalizatora z mieszaniny poreakcyjnej,
żð otrzymane produkty nie sÄ… zanieczyszczone biaÅ‚kiem,
żð przedÅ‚użona stabilność katalityczna enzymu,
żð prosta technologia i aparatura do procesów z ich użyciem,
żð obniżone koszty technologiczne procesów z ich użyciem.
W porównaniu z natywnymi, immobilizowane enzymy są bardziej odporne na działanie podwyższonej
temperatury, inhibitorów i rozpuszczalników organicznych.
Immobilizacja powoduje, że nie występują niektóre wielkocząsteczkowe procesy inaktywacji, takie jak
agregacja i autoliza. Unieruchomienie biokatalizatora na powierzchni lub wewnątrz nośnika powoduje na ogół
powstawanie wokół cząsteczek enzymu ograniczeń sterycznych, które mogą stanowić osłonę przed
niekorzystnym oddziaływaniem cząsteczek z zewnętrznego roztworu.
Aktywność natywnych enzymów jest związana z ich określoną konformacją, polegającą na
odpowiednim sfałdowaniu łańcucha polipeptydowego. Rozfałdowanie tego łańcucha zmienia konformację
powodując utratę aktywności enzymu. Immobilizowanie enzymów powoduje u trwalenie konformacji i tym
samym zwiększenie stabilności.
PODZIAA
ENZYMÓW IMMOBILIZOWANYCH
Immobilizacja to jedna z form modyfikacji enzymów.
Metody unieruchamiania biokatalizatorów można ogólnie podzielić na dwie grupy:
1. fizyczne
2. chemiczne.
W przypadku pierwszych, pomiędzy enzymem a złożem tworzą się wiązania jonowe, wodorowe,
obecne są również oddziaływania van der Waalsa. Do fizycznych metod immobilizacji zalicza się adsorpcję
enzymu na nierozpuszczalnej matrycy, a także pułapkowanie biokatalizatora wewnątrz struktury naturalnych lub
syntetycznych polimerów.
Immobilizacja na drodze chemicznej polega na tworzeniu wiązań kowalencyjnych łączących
biokatalizator z nierozpuszczalnÄ… matrycÄ…, sieciowaniu enzymu z zastosowaniem wielofunkcyjnych
odczynników lub wiązaniu biokatalizatora z innymi cząsteczkami (np. innym białkiem lub rozpuszczalnym
syntetycznym polimerem), poprzez tworzenie wiązań sieciujących, co umożliwia wydzielenie go z mieszaniny
reakcyjnej przy użyciu techniki ultrafiltracji.
25
METODY IMMOBILIZOWANIA ENZYMÓW
METODY Z WYKORZYSTANIEM ODDZIAA
YWAC
FIZYCZNYCH
vð Immobilizacja oparta na adsorpcji i adhezji, które wykorzystujÄ… siÅ‚y
jonowe, wiązania wodorowe, oddziaływania van der Waalsa i inne słabe
oddziaływania fizykochemiczne do związania enzymu z nośnikiem, takim jak:
drewno, celuloza, polimery syntetyczne, antracyt, tlenki metali, szkło porowate,
ziemia okrzemkowa, węgiel aktywny, pumeks czy jonity (DEA E-Sephadex,
CM-celuloza, itp.).
Immobilizacja enzymów metodą adsorpcji na nierozpuszczalnych nośnikach następuje w wyniku
kontaktu wodnego roztworu enzymu z nośnikiem. Po odmyciu nie zaadsorbowanego enzymu, preparat
jest gotowy do użycia.
Sposoby immobilizowania enzymów metodą adsorpcji:
·ð sposób statyczny  noÅ›nik wprowadza siÄ™ do wodnego roztworu enzymu i pozostawia na pewien czas
bez mieszania. Immobilizacja następuje dzięki samorzutnej dyfuzji enzymu do powierzchni nośnika, a
potem adsorpcji
·ð sposób z mieszaniem  noÅ›nik zawiesza siÄ™ w roztworze enzymu i poddaje ciÄ…gÅ‚emu mieszaniu za
pomocą mieszadła albo na wytrząsarce
·ð elektroosadzanie enzymu na noÅ›niku  w roztworze enzymu zanurza siÄ™ dwie elektrody, a na
powierzchni jednej z nich umieszcza się warstwę nośnika. Po włączeniu prądu cząsteczki enzymu o
odpowiednim ładunku przemieszczają się w roztworze, w kierunku elektrody z nośnikiem i osadzają się
na jego powierzchni
·ð nanoszenie na kolumnie  przez kolumnÄ™ wypeÅ‚nionÄ… noÅ›nikiem tworzÄ…cym upakowane zÅ‚oże, przy
użyciu pompy w kierunku z góry w dół przepuszcza się roztwór enzymu w warunkach ciągłej
cyrkulacji
Przebieg procesu adsorpcji i trwałość połączenia enzymu z nośnikiem w znacznym stopniu są zależne od
warunków przeprowadzenia immobilizacji.
Adsorpcję enzymu warunkują głównie:
·ð powierzchnia wÅ‚aÅ›ciwa i porowatość noÅ›nika
·ð wartość pH
·ð siÅ‚a jonowa roztworu
·ð stężenie enzymu w roztworze
·ð temperatura prowadzenia procesu
26
vð PuÅ‚apkowanie biokatalizatora wewnÄ…trz struktury naturalnych
lub syntetycznych polimerów; przykładowymi nośnikami są: agar, alginian,
kolagen, poliakrylamid, poliuretan, polistyren, żywice sieciowane energią świetlną
Zasada tej metody polega na tym, że cząsteczki enzymu zamyka się w trójwymiarowej sieci ściśle
splecionych łańcuchów polimerów tworzących żel. Średnia odległość między sąsiednimi łańcuchami w żelu jest
mniejsza od rozmiarów cząsteczki zamkniętego enzymu, dlatego też nie może on opuścić polimerycznej matrycy
i przejść do otaczającego roztworu, czyli znajduje się w stanie immobilizowanym. Do utrzymywania enzymu w
sieci przestrzennej żelu mogą dodatkowo przyczyniać się także wiązania jonowe i wodorowe między
cząsteczkami enzymu i otaczającymi je łańcuchami polimerów.
Przestrzenie między łańcuchami polimerów tworzących żel są wypełnione wodą, która zwykle stanowi znaczną
część ogólnej objętości żelu.
Stosuje się dwa podstawowe sposoby immobilizacji enzymów w żelu. W jednym z nich enzym dodaje
się do wodnego roztworu monomeru, a następnie przeprowadza się jego polimeryzację, w wyniku której
powstaje polimeryczny żel z zamkniętymi w nim cząsteczkami enzymu. Do mies zaniny reakcyjnej często dodaje
się dwufunkcyjne czynniki sieciujące, które nadają powstającemu polimerowi strukturę trójwymiarowej sieci
przestrzennej.
Drugi sposób polega na tym, że enzym wprowadza się do roztworu gotowego polimeru. Metoda ta
opiera się na zdolności naturalnych polisacharydów, takich jak: skrobia, agar-agar, karagenian i agaroza do
tworzenia żeli po ochłodzeniu gorących wodnych roztworów. Wodną zawiesinę polisacharydu ogrzewa się do
temperatury 80-90·ðC, do caÅ‚kowitego rozpuszczenia i gorÄ…cy roztwór powoli chÅ‚odzi siÄ™. BezpoÅ›rednio przed
rozpoczęciem żelowania do układu dodaje się wodny roztwór enzymu. Przy dalszym ochładzaniu tworzy się żel
zawierajÄ…cy immobilizowany enzym.
Trwałe wiązania między polimerycznymi łańcuchami żelu mogą również powstać dzięki oddziaływaniom
elektrostatycznym. Na przykład alginian sodowy tworzy trwały żel w obecności jonów wapniowych. W tym
przypadku jony wapniowe, tworzące wiązania jonowe z grupami karboksylowymi alginianu, występują w roli
 mostków między łańcuchami polimeru.
Wpływ różnych czynników na aktywność enzymów immobilizowanych przez zamknięcie w żelu
Katalityczna aktywność immobilizowanego preparatu wzrasta wraz ze zwiększeniem ilości
zamkniętego enzymu. Takie zwiększenie można uzyskać podwyższając stężenie enzymu w wyjściowej
mieszaninie, użytej do przygotowania żelu. Rozpuszczalność białek w systemach tworzących żele może być
jednak znacznie niższa niż rozpuszczalność w wodnym roztworze buforowym.
27
Innym czynnikiem wpływającym na zawartość enzymu w żelu jest struktura samego żelu, a ściślej
rozmiary porów. Im mniejsza jest średnica porów, tym bardziej skutecznie enzym jest utrzymywany w matrycy
żelu i tym wyższa jest aktywność katalityczna immobilizowanego preparatu. Porowatość żelu można regulować
zmieniając skład mieszaniny.
Skuteczność zamykania zwiększa się nie tylko wraz ze zmniejszaniem średnicy porów żelu, ale i ze
zwiększaniem rozmiarów cząsteczki enzymu. Dlatego, enzymy o małej masie cząsteczkowej przed
immobilizacją poddaje się niekiedy traktowaniu aldehydem glutarowym, w wyniku czego powstają duże,
kowalencyjnie usieciowane agregaty, silnie zatrzymywane przez polimerycznÄ… matrycÄ™ i nie wymywajÄ…ce siÄ™ z
żelu.
vð Immobilizacja z wykorzystaniem półprzepuszczalnych membran
lub układów fazowych, gdzie membrana lub granica faz stanowi przegrodę
uniemożliwiającą migrację enzymu:
·ð zamykanie w komórkach naturalnych, np. w erytrocytach
·ð kapsuÅ‚kowanie i mikrokapsuÅ‚kowanie (liposomy, kapsuÅ‚ki nylonowe,
polimocznikowe, pochodne celulozowe)
·ð zamykanie pomiÄ™dzy półprzepuszczalnymi membranami lub w wężach
(np. silikonowych, nylonowych)
Metoda mikrokapsułkowania polega na zamknięciu roztworu enzymu w mikrokapsułkach-
pęcherzykach z półprzepuszczalnych membran, przez które mogą dyfundować tylko małocząstec zkowe
substraty. Mikrokapsułki otrzymuje się w wyniku podwójnego emulgowania lub polikondensacji na granicy faz.
Najbardziej rozpowszechnione są mikrokapsułki poliamidowe. W mikrokapsułkach można zamykać, poza
pojedynczymi enzymami, także systemy wieloenzy mowe, komórki oraz enzymy immobilizowane uprzednio
innÄ… metodÄ….
vð PuÅ‚apkowanie we włóknach (włókna z octanu celulozy)
28
METODY Z WYKORZYSTANIEM ODDZIAA
YWAC
CHEMICZNYCH
vð Immobilizacja poprzez tworzenie wiÄ…zaÅ„ kowalencyjnych
(peptydowego, estrowego, węgiel-węgiel, węgiel-azot i in.); nośniki i odczynniki
wiążące to, np.: hydroksyalkilometakrylan - aldehyd glutarowy, CM-celuloza 
karbodiimid, szkło porowate lub silikażel  aldehyd glutarowy, a także: diaminy,
kwasy dikarboksylowe, bromocyjan, izomocznik
Jest to efekt oddziaływań między białkiem a nośnikiem. W iązanie przeprowadza się za pośrednictwem
związku dwufunkcyjnego, np. aldehydu glutarowego, wiążącego grupę funkcyjną nośnika z odpowiednią grupą
enzymu.
Ważne jest, aby nowe wiązania kowalencyjne nośnik-enzym były tworzone z grupami
funkcyjnymi nieistotnymi dla aktywności katalitycznej enzymu.
29
vð unieruchamianie bez makroskopowego noÅ›nika mechanicznego, np. sieciowanie
przestrzenne, kopolimeryzacja enzymów z nośnikami rozpuszczalny mi przy użyciu odczynników
dwufunkcyjnych) oraz sieciowanie kryształów i agregatów białek enzymatycznych (enzym pełni rolę
matrycy i biokatalizatora)
30
Zaletami metod fizycznych jest zachowanie struktury enzymu oraz łatwość i niski koszt
przeprowadzenia procesu immobilizacji. Często jednak następuje wymywanie biokatalizatora ze złoża,
zwłaszcza w przypadku stosowania prostej adsorpcji białka na powierzchni matrycy.
Metody chemiczne zapewniają stabilność układu, ale w wielu przypadkach wiąże się to z częściową
utratą aktywności enzymu, spowodowaną zmianą konformacji białka. Wiązanie kowalencyjne z nośnikiem jest
łatwą metodą i daje stabilny układ, lecz jest kosztowne. Pułapkowanie w żelu jest tanie, ale nie można stosować
go do enzymów hydrolitycznych, działających na substraty wielkocząsteczkowe, czyli mogących degradować
żel. Kapsułkowanie stosuje się przede wszystkim w farmacji, jest jednak trudne w kontroli i znajduje
zastosowanie jedynie do przemian niskocząsteczkowych, podobnie jak memb rany półprzepuszczalne. Natomiast
wzajemne sieciowanie jest łatwe i tanie, zapewnia dużą aktywność i stabilność chemiczną, jednak przy tym
niską stabilność mechaniczną.
Ponadto jest to stosunkowo kosztowny proces, wymagający użycia dodatkowych związków
sieciujących lub aktywujących grupy funkcyjne złoża lub/i enzymu.
NOŚNIKI DO IMMOBILIZACJI ENZYMÓW
Materiały, z których wytwarza się nośniki powinna charakteryzować:
·ð duża trwaÅ‚ość chemiczna i biologiczna
·ð duża odporność mechaniczna
·ð odporność termiczna
·ð odporność na biodegradacjÄ™
·ð nietoksyczność
·ð dostateczna przenikalność dla enzymu i substratów
·ð duża hydrofilowość
·ð duża powierzchnia wÅ‚aÅ›ciwa, pojemność i porowatość
·ð Å‚atwość przeprowadzenia noÅ›nika w formÄ™ zdolnÄ… do reakcji
W przypadku klasycznych metod immobilizacji ważny jest racjonalny wybór złoża do unieruchamiania
enzymu. Nośnik powinien być nierozpuszczalny w środowisku, w którym prowadzona jest reakcja katalizowana
enzymatycznie (zwykle jest to roztwór wodny). Musi charakteryzować się dużą zdolnością wiąza nia enzymu,
która uzależniona jest od ilości i rodzaju grup funkcyjnych zdolnych do przyłączenia białka, a także podatności
na modyfikacje prowadzące do zwiększenia ilości tych grup (aktywacja nośnika). O pojemności złoża decyduje
również jego porowatość i kształt cząstek. Nośnik powinien być ponadto odporny na degradację chemiczną i
mikrobiologiczną oraz nietoksyczny. O przydatności złoża decydują też jego właściwości mechaniczne, cena
oraz dostępność. Do immobilizacji enzymów stosuje się różne nośniki, zarówno pochodzenia naturalnego, jak i
syntetyczne. W przypadku metody adsorpcyjnej wykorzystywane sÄ…: drewno, celuloza, antracyt, tlenki metali
(np. tlenek glinu  alumina), krzemionka, szkło porowate, ceramika, ziemia okrzemkowa, węgiel aktywny, koks,
proszek kostny, czy wymieniacze jonowe (np. DEA E-celuloza). Do pułapkowania biokatalizatora w żelu stosuje
się: alginian, karagenian, kolagen, agarozę, chitozan, poliakrylamid, poliuretan, a także mieszaniny tych
związków (np. chitozan-alginian). Enzymy można też pułapkować we włóknach z octanu celulozy. Membrany i
węże półprzepuszczalne wykorzystywane do unieruchamiania biokatalizarorów są najczęściej nylonowe lub
silikonowe. Natomiast w metodzie kapsułkowania wykorzystuje się liposomy, kapsułki nylonowe,
polimocznikowe oraz z pochodnych celulozy. Nośniki stosowane do kowalencyjnego wiązania enzymu muszą
posiadać szereg grup funkcyjnych zdolnych do tworzenia z białkiem wiązań peptydowych, estrowych,
disiarczkowych, węgiel-węgiel, węgiel-azot lub innych. Grupy te mogą stanowić naturalny składnik matrycy, np.
grupy hydroksylowe chityny i celulozy, czy grupy hydroksylowe i aminowe chitozanu. Mogą być też
wprowadzone sztucznie w procesie aktywacji matrycy, np. grupy epoksydowe (złoże poliakrylamidowe
zawierajÄ…ce grupy epoksydowe) lub tiosulfonowe (tiosulfonowana agaroza). W ostatnich latach prowadzone sÄ…
też badania nad wykorzystaniem tzw.  inteligentnych polimerów do immobilizacji enzymów. Polimery te,
rozpuszczalne w wodzie, po przekroczeniu pewnej wartości granicznej przez jakiś parametr środowiska, np. pH,
zmieniają swoje właściwości z hydrofilowych na hydrofobowe, co powoduje ich wytrącenie się. Wykorzystanie
takiego polimeru jako nośnika dla enzymu sprawia, że po zakończeniu reakcji bardzo łatwo można go wydzie lić
ze środowiska reakcyjnego, zmieniając jego właściwości z hydrofilowych na hydrofobowe, jeżeli reakcja
31
przebiega w środowisku wodnym (bądz
z hydrofobowych na hydrofilowe, jeżeli proces prowadzony jest w
środowisku rozpuszczalników organicznych).
Odczynniki wiążące
Wiązania kowalencyjne pomiędzy nośnikiem i immobilizowanym enzymem zazwyczaj nie powstają
spontanicznie, ale wymagają zastosowania dwufunkcyjnych związków sieciujących wchodzących w skład
wiązania lub związków aktywujących grupy funkcyjne i umożliwiających ich powstawanie, ale nie
wchodzących w skład wiązania: aldehydu glutarowego, bromocyjanu, diamin, kwasów dikarboksylowych,
bezwodników kwasowych, karbodiimidu, epichlorohydryny, czy chlorku tosylu.
Jeżeli immobilizowany biokatalizator ma być stosowany w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym
lub kosmetycznym, jedynym rozwiązaniem jest kowalencyjne związanie go z nośnikiem. Tylko ta metoda
zapewnia uzyskanie czystego produktu, nie zanieczyszczonego białkiem enzymatycznym, które może
powodować reakcję alergiczną u konsumentów. Najczęściej do tworzenia stabilnych układów enzym-nośnik
stosowany jest aldehyd glutarowy.
Podstawowym parametrem technologicznym jest stabilność operacyjna enzymu, która określa czas
pracy, po którym zachodzi utrata połowy początkowej aktywności biokatalizatora.
W czasie procesu technologicznego immobilizowany biokatalizator stopniowo traci swojÄ…
produktywność, co spowodowane jest:
1. wymywaniem enzymu ze złoża oraz rozpuszczaniem się lub ścieraniem matrycy,
2. utratą aktywności na skutek zatruwania lub denaturacji enzymu,
3. pogorszeniem się warunków kontaktu substratu z enzymem na skutek zanieczyszczenia i zatkania się
porów złoża lub mechanicznego zgniatania matrycy,
4. zanieczyszczeniem mikrobiologicznym.
Wady stosowania immobilizacji enzymów są następujące:
üð wysoki koszt, zwiÄ…zany głównie z otrzymaniem czystego preparatu enzymatycznego
üð utrata aktywnoÅ›ci wywoÅ‚ana zmianÄ… warunków fizykochemicznych Å›rodowiska, w
porównaniu do warunków, jakie panowały wewnątrz komórki przed izolacją
üð utrata aktywnoÅ›ci podczas prowadzenia procesu immobilizacji (w tym iloÅ›ciowe straty
enzymu).
Tabela 1. Przemysłowe zastosowanie unieruchomionych enzymów.
32
33