Wymagania wzrostowe komórek.
Podłoża hodowlane
Podłoża hodowlane (media, pożywki)
Do hodowli In vitro komórki Skład:
potrzebują mieszaniny
" Woda
składników odżywczych,
" Węglowodany
soli mineralnych,
" Aminokwasy
czynników wzrostowych,
" Witaminy i prekursory
transportujących i
nukleotydów
ochronnych, czyli tzw.
Medium. Odzwierciedlają
" Białka
one warunki panujące In
" Lipidy i kwasy tłuszczowe
vivo i są niezbędne do
" Sole nieorganiczne
przeżycia, wzrostu i
" Surowica
różnicowania komórek.
Woda
Ultra czysta woda  do pożywek z proszku lub
koncentratów. Podwójnie destylowana,
przepuszczana przez wymieniacze jonowe i
filtry z węgla aktywnego. Czystość wody
monitorujemy poprzez:
" Pomiar oporności - co najmniej 18 mW/cm.
" Pomiar TOC (total organic carbon) < 10 ppb
" Wolna od cząsteczek > 0,22 mm
Węglowodany:
" y
ródło energii. Najczęściej fruktoza, galaktoza,
maltoza lub glukoza (metabolizowana na drodze
glikolizy prowadzi do powstania kwasu
mlekowego, obniżającego pH pożywki). W
zależności od wymagań komórek 1 do 4.5 g/l.
" Dodawany dodatkowo pirogronian sodu
Aminokwasy:
" Glutamina, arginina, cysteina, lizyna itp. y
ródło
energii (glutamina) i materiał wyjściowy do
produkcji innych związków. Szczególnie potrzebne
aminokwasy egzogenne.
Hormony i czynniki wzrostu:
Witaminy - Grupa B
" witamina B1 (tiamina)
" FGF - Fibroblast growth factor
" witamina B2 (ryboflawina)
" EGF - Epidermal growth factor
" PDGF - platelet-derived growth factor
" witamina B3 (PP - niacyna)
" IGF-I i II -insulin-like growth factors
" witamina B5 (kwas
" Insulina
pantotenowy)
" witamina B6 (pirydoksyna)
Prekursory kwasów nukleinowych:
" witamina B7 (H - biotyna)
Nukleozydy:
" witamina B9 (kwas foliowy)
Adenozyna
" witamina B12
Guanozyna
(cyjanokobalamina) Cytydyna
Tymidyna
" Kwas askorbinowy
Urydyna
" Inozytol
Pentozy (ryboza)
Białka
" Fetuina, kolagen, laminina  czynniki adhezyjne, składniki macierzy
pozakomórkowej, ułatwiające przyleganie komórek i pobudzające
proliferację i różnicowanie.
" Albuminy  białko nośnikowe dla kwasów tłuszczowych, witamin
rozpuszczalnych w tłuszczach, hormonów, jonów Ni, Zn, Cu, metali
ciężkich i inhibitorów wzrostu (chroni komórki przed wpływem
toksyn), działa jako bufor i chroni przed uszkodzeniami
mechanicznymi, zapewnia izotoniczność płynu.
" Transferyna  transport metali, wanad, mangan i przede wszystkim
Fe. Zapobiega jego właściwościom toksycznym i hamuje infekcje
bakteryjne.
" Antyproteazy  a-antytrypsyna i a2-makroglobulina. Zapobiegają
uszkodzeniu komórek na skutek działania proteaz.
Lipidy i kwasy tłuszczowe: Sole mineralne:
" Kwas liponowy Na, K, Cl, Zn, Cu, Se, Fe -
(unieszkodliwia wolne kofaktory reakcji
rodniki, bierze udział w enzymatycznych,
przekształcaniu stabilizacja potencjału
pirogronianu) błonowego, usuwanie
wolnych rodników,
" Cholesterol  budowa
pomagają utrzymać
błony komórkowej
odpowiednie ciśnienie
" Niezbędne do hodowli
osmotyczne
niektórych linii
Mg2+, Ca2+  niezbędne do
komórkowych (Szpiczak
prawidłowej konformacji
mnogi NS-1, NS-0)
białek macierzy
zewnątrzkomórkowej
Surowica
Funkcje: Produkcja  krew zwierzęca  atest
pochodzenia zwierząt z obszarów wolnych
1. Stymuluje wzrost, proliferację i
od BSE i Scrapie.
różnicowanie komórek.
" Surowica bydlęca  calf serum/ bovine
2. Ułatwia adhezję komórek do powierzchni
serum - BS
wzrostowej.
" Surowica płodowa  fetal bovine serum 
3. Zapewniają dystrybucję hormonów, soli
FBS
mineralnych i lipidów.
" Surowica końska  Horse serum - HoS
4. Neutralizuje toksyczne produkty
przemiany materii, metale ciężkie, enzymy
proteolityczne, endotoksyny, działa jako
Przechowywać w -20 0C  jak najrzadziej
układ buforujący.
rozmrażać
Zawiera niezbędne do hodowli:
Inaktywacja  (Heat inactivation) polega na
" Białka (albuminy, transferyna, antyproteazy, trzymaniu surowicy przez 30 min w
czynniki adhezyjne) temperaturze 560C w łaz
ni wodnej. Cel:
inaktywacja układu dopełniacza i
" Czynniki wzrostu FGF, EGF, PDGF IGF-I i II
immunoglobulin, osłabienie wirusów i
(zwłaszcza FBS!)
mykoplasm.
" Hormony (insulina, glikokortykoidy)
W zależności od linii komórkowej 5-15 %
objętości podłoża
Hodowla komórek  pożywki bez
surowicy
Wady związane z używaniem surowicy: Pożywki bez surowicy
" Zmienność (między płodami, wiekiem,
pochodzeniem, karmieniem zwierząt,
Zalety:
porą roku itp.)
" Niższe ryzyko zanieczyszczeń
" Intensywne testy określające jakość 
(wirusowe, bakteryjne, grzybowe,
ryzyko zanieczyszczenia bakteriami,
priony).
grzybami, wirusami = duże koszty.
" A
atwiejsze oczyszczanie produktu.
" Ryzyko interakcji składników z
" Zdefiniowany i powtarzalny skład.
badanymi związkami.
Zwiększenie powtarzalności wyników.
" Oczyszczanie końcowego produktu np.
" Osiągnięcie selektywnego wzrostu
w przypadku biofarmaceutyków
poprzez dodanie czynników wzrostu
" Stosunkowo krótki okres ważności
swoistych dla danego typu komórek.
Wady związane z używaniem pożywki
bez surowicy:
" Nie działa tak dobrze jak pożywka z
surowicą
Układy buforujące i antybiotyki
" NaHCO3
" HEPES - (4-(2-hydroxyethyl)-1-
piperazineethanesulfonic acid ) - jon obojnaczy
(zwitterjon)
" PBS - Phosphate buffered saline
" HBSS - Hank's Balanced Salt Solution
Antybiotyki:
streptomycyna (100 mg/ml), penicylina (100 mg/ml)
Czerwień fenolowa  wskaz
nik pH
Działa bakterio statecznie i wykazuje słabe właściwości estrogenne
6,8 7,4 8,0
pH
Przykładowe podłoża
" MEM (Minimal Essential
Medium) i DMEM -
Dulbecco
" IPL-41, TC- 100, TNM -
FH hodowle komórek
owadzich.
" RPMI (Roswel Park
Memorail Institute) 1640
" Media dla określonych
komórek: Hepatopan,
Melanopan, Neuropan
Wyjaławianie pożywki przez filtrację
(niezbędne po rozpuszczeniu
sproszkowanej pożywki w wodzie)