Ćwiczenie 1
AMINOKWASY  BUDOWA I WA
AŚCIWOŚCI
BIAA
KA  BUDOWA I FUNKCJE
Część doświadczalna obejmuje:
- rozdział aminokwasów metodą chromatografii podziałowej (technika chromatografii bibu-
łowej wstępującej)
- wykonanie reakcji charakterystycznych dla wybranych aminokwasów
- ilościowe oznaczanie białek metodą biuretową
WPROWADZENIE
AMINOKWASY
Budowa i właściwości ogólne aminokwasów
Aminokwasy są kwasami organicznymi zawierającymi wolną grupą karboksylową
oraz wolną grupą aminową, położoną przy ą-atomie węgla. Poza tymi dwoma grupami,
każdy aminokwas ma charakterystyczny dla siebie łańcuch boczny R (Ryc. 1 i 2).
Ryc. 1. Schemat budowy i zróżnicowanie funkcjonalne aminokwasów (Koolman i R�hm
2005)
1
 Ryc. 2. A
ańcuchy boczne aminokwasów proteinogennych (Koolman i R�hm 2005)
Na Ryc. 2 przedstawiono łańcuchy boczne dwudziestu aminokwasów budujących białka
(aminokwasy proteinogenne), które ze względu na budowę chemiczną oraz polarność łań-
cuchów bocznych podzielono na siedem klas. Wartości podane na dole po lewej przedstawia-
ją stopień polarności danego łańcucha bocznego (najmniejszy dla Phe, Cys, Met, Ala, a naj-
większy dla Arg, Lys). Przy łańcuchach bocznych zdolnych do jonizacji podane są także war-
tości pK (czerwone liczby). Szczególną pozycję wśród aminokwasów zajmuje prolina (Pro).
Jej łańcuch boczny wraz z węglem ą i grupą aminową przy tym węglu tworzą 5-członowy
2
pierścień. Atom azotu w pierścieniu jest słabo zasadowy i w warunkach fizjologicznych nie
jest uprotonowany. Aminokwasy, które nie mogą być syntetyzowane w organizmach ludzkich
(aminokwasy egzogenne) oznaczone są czerwoną gwiazdką.
Aminokwasy są składnikami budulcowymi peptydów i białek (aminokwasy proteino-
genne). Niektóre aminokwasy wchodzą w skład lipidów, np. seryna występuje w fosfolipi-
dach, a glicyna w solach żółciowych. Glutaminian, asparaginian oraz glicyna odgrywają rolę
neuroprzekaz
ników. Wszystkie aminokwasy, za wyjątkiem lizyny i leucyny, mogą być me-
tabolitami pośrednimi szlaku glukoneogenezy (aminokwasy glukogenne), tzn. mogą posłużyć
do biosyntezy glukozy. Niektóre aminokwasy są wykorzystywane do syntezy zasad puryno-
wych i pirymidynowych (asparaginian, glutaminian), hemu (glicyna), amin biogennych
(np. seryna, glutaminian) (Ryc. 3). Aminokwasy są też donorami grup aminowych przenoszo-
nych na ketokwasy lub funkcjonują w cyklu mocznikowym (ornityna, cytrulina) (Ryc. 4).
Ryc. 3. Aminy biogenne wywodzące się z aminokwasów (Koolman i R�hm 2005)
Ryc. 4. Aminokwasy rzadkie (Koolman i R�hm 2005)
Właściwości amfoteryczne aminokwasów
Obecność w aminokwasach grupy karboksylowej i grupy aminowej powoduje, że są
one związkami amfoterycznymi. W roztworach wodnych występują głównie w formie jo-
3
nów. W zależności od pH środowiska jony te mogą mieć charakter kwasowy bądz
zasadowy,
zgodnie z poniższymi równaniami reakcji:
Zmiany stanu jonizacji aminokwasów w zależności od pH
W środowisku kwasowym aminokwas przyłącza proton, staje się kationem i zachowuje jak
kwas, gdyż występujące w cząsteczce grupa karboksylowa  COOH i grupa amoniowa  NH3+
mogą być donorami protonów. W środowisku zasadowym aminokwas oddając proton staje
się anionem i zachowuje się jak zasada, ponieważ zdysocjowana grupa karboksylowa COO-
i grupa aminowa NH2 mogą przyłączać protony. Jest taka wartość pH roztworu, przy której
cząsteczki aminokwasów występują w formie jonu obojnaczego, w którym liczba ładunków
ujemnych jest równa liczbie ładunków dodatnich, czyli sumarycznie ładunek równy jest zeru.
Taka wartość pH nosi nazwę punktu izoelektrycznego (pI).
Charakter amfoteryczny aminokwasów ujmuje graficznie krzywa miareczkowania
roztworów aminokwasów mocnymi kwasami lub zasadami (Ryc. 5). Krzywa przedstawia
zależność wartości pH miareczkowanego roztworu od liczby dodanych moli kwasu lub zasa-
dy. Zależność między wartością pH a stanem dysocjacji opisano równaniem Hendersona-
Hasselbalcha, gdzie Ka = stała kwasowa, a pKa = ujemny logarytm stałej kwasowej:
Z powyższego równania wynika, iż w warunkach, gdy formy zdysocjowana i niezdysocjowa-
na są w stężeniach równowagowych, to pKa = pH. Miareczkowanie roztworu aminokwasu
połączone z jednoczesnym pomiarem pH roztworu pozwala na doświadczalne wyznaczenie
krzywej dysocjacji aminokwasu, określenie jego wartości pI oraz wyznaczenie wartości pKa
jego grup funkcyjnych.
4
 Ryc. 5. Krzywa miareczkowania histydyny (Karlson 1987)
Rozdział aminokwasów
Jedną z metod rozdziału aminokwasów pozwalającą izolować z mieszaniny pojedyn-
cze aminokwasy jest chromatografia podziałowa. Opiera się ona na prawie podziału solutu
(substancji rozpuszczonej) między dwie fazy ciekłe  ruchomą i stacjonarną. Faza stacjo-
narna utrzymywana jest przez porowaty nośnik słabo adsorbujący składniki solutu. Porowa-
tym nośnikiem może być bibuła albo żel ułożony w kolumnie chromatograficznej lub wylany
na płytkę. Warunkiem decydującym o rozdziale substancji są różnice w ich rozpuszczalności
w fazie ruchomej i nieruchomej, tj. różnice we współczynnikach podziału między dwie nie
mieszające się ze sobą fazy ciekłe. Chromatografia podziałowa opiera się więc na prawie
Nernsta, które mówi, iż w układzie utworzonym przez dwie nie mieszające się ze sobą fazy
ciekłe i wspólny dla nich solut, stosunek stężenia tego solutu w fazie 1 (c1) do jego stężenia w
fazie 2 (c2) jest w stanie równowagi wielkością stałą zależną od temperatury i właściwości
substancji tworzących roztwory, a niezależną od ilości substancji rozpuszczonej: c1/c2 = k.
Miarą selektywności rozdziału dwóch substancji A i B w danym układzie jest stopień rozdzia-
łu, którego wartość określa wzór: � = KA/KB gdzie KA określa stosunek podziału substancji A,
KB  stosunek podziału substancji B między fazę ruchomą i nieruchomą.
Technika chromatografii bibułowej. W chromatografii bibułowej nośnikiem fazy stacjonar-
nej, najczęściej polarnej, jest odpowiednio spreparowana bibuła filtracyjna. Bibuła jest zbu-
dowana z włókien celulozowych ułożonych w porowatą, żelową strukturę stanowiącą fazę
5
nieruchomą. Cząsteczki wody zaadsorbowane na bibule łączą się z włóknami celulozy wią-
zaniami wodorowymi. Fazę ruchomą w chromatografii bibułowej stanowią odpowiednie roz-
puszczalniki organiczne pojedyncze lub zmieszane. Rozpuszczalniki muszą się częściowo
mieszać z wodą, np. szeroko rozpowszechnionym układem jest mieszanina n-butanolu/kwasu
octowego/wody, w zmiennych proporcjach.
Szybkość wędrowania danego związku w określonych warunkach jest wartością stałą.
Jej miarą jest wartość Rf: Rf = x/y, gdzie x oznacza odległość od linii startowej do środka
plamy aminokwasu, a y  odległość od linii startowej do czoła rozpuszczalnika. W Tabeli 1
podane są wartości Rf dla większości aminokwasów rozdzielanych w warunkach zbliżonych
do tych, w jakich będzie wykonywane ćwiczenie.
Tabela 1. Wartości Rf aminokwasów (faza ruchoma: n-butanol/kwas octowy/woda, 4:1:1)
Wartości Rf x 100 w układzie
Lp. Nazwa aminokwasu Symbol aminokwasu rozpuszczalników:
n-butanol/CH3COOH/H2O
1. alanina Ala A 30
2. arginina Arg R 15
3. kwas asparaginowy Asp D 22
4. asparagina Asn N 12
5. cystyna 5
6. cysteina Cys C 8
7. kwas cysteinowy CysSO3H 7
8. fenyloalanina Phe F 60
9. glicyna Gly G 23
10. kwas glutaminowy Glu E 28
11. glutamina Gln Q 17
12. histydyna His H 11
13. leucyna Leu L 70
14. izoleucyna Ile I 67
15. lizyna Lys K 12
16. metionina Met M 50
17. sulfonian metioniny MetSO3H 22
18. prolina Pro P 34
19. hydroksyprolina ProOH 22
20. seryna Ser S 22
21. treonina Thr T 26
22. tryptofan Trp W 50
23. tyrozyna Tyr Y 45
24. walina Val V 51
25. ornityna Orn 12
26. cytrulina Cytr 18
6
BIAA
KA
Budowa, podział i funkcje białek
A
ączenie się aminokwasów wiązaniami amidowymi prowadzi do utworzenia liniowej
makrocząsteczki  polipeptydu. A
ańcuchy polipeptydowe zawierające ponad 100 reszt ami-
nokwasowych przyjęto określać jako białka. Wiązanie amidowe, nazywane również wiąza-
niem peptydowym, powstaje z grupy ą-karboksylowej i grupy ą-aminowej. Na Ryc. 6A
przedstawiono dipeptyd (seryloalaninę) utworzony z seryny i alaniny. Wiązanie peptydowe
jest stabilizowane mezomerycznie, gdyż wiązanie C N ma częściowo charakter wiązania
podwójnego C=N (Ryc.6B). To usztywnienie wiązania peptydowego powoduje, że we
wszystkich ułożeniach przestrzennych białek grupy amidowe pozostają płaskie. Swobodna
rotacja jest możliwa tylko wokół wiązania N-Cą i Cą C, a obroty są opisywane przez warto-
ści kątów torsyjnych � (fi) i � (psi) (Ryc. 6A).
Ryc. 6. Właściwości wiązania amidowego (peptydowego) (Koolman i R�hm 2005)
Konformacja łańcucha peptydowego utworzona przez kilka kolejnych reszt amino-
kwasowych i stabilizowana wiązaniami wodorowymi pomiędzy atomami tlenu i azotu z
ugrupowań peptydowych definiuje strukturę drugorzędową (Ryc. 7).
7
 Ryc. 7. Struktury drugorzędowe białek (ą-helisa, helisa kolagenu, pofałdowanej kartki,
�-pętla) (Koolman i R�hm 2005)
8
Białka, ze względu na skład, dzieli się na białka proste i złożone. Białka proste zbu-
dowane są tylko z aminokwasów, natomiast białka złożone zawierają szereg różnych kompo-
nentów nieaminokwasowych, których rodzaj jest podstawą podziału białek na:
- glikoproteiny  białka zawierające cukry obojętne (galaktoza, mannoza, fukoza), amino-
cukry (N-acetyloglukozamina, N-acetylogalaktozamina) lub kwasy pochodne monosacha-
rydów (kwas uronowy, kwas sjalowy)
- lipoproteiny  zawierają fosfolipidy, cholesterol i inne związki lipidowe
- metaloproteiny  zawierają jony metali związane jonowo lub koordynacyjnie
- fosfoproteiny  reszty tyrozyny, treoniny lub seryny są zestryfikowane kwasem fosforo-
wym
- nukleoproteiny  zawierają RNA lub DNA
- chromoproteiny  zawierają grupę prostetyczną, którą stanowią różne związki barwne
Na Ryc. 8 pokazano potencjalne miejsca modyfikacji łańcucha polipeptydowego. Modyfi-
kacjom ulegają zwykle polarne reszty aminokwasów, stanowiąc ważne z
ródło różnorodności
białek.
Ryc. 8. Potranslacyjne modyfikacje łańcucha polipeptydowego (Koolman i R�hm 2005)
9
Białka ze względu na pełnione funkcje można podzielić na:
- enzymatyczne  najliczniejsza grupa białek (ponad 2000) o zróżnicowanej masie czą-
steczkowej
- strukturalne  są odpowiedzialne za mechaniczną stabilność narządów i tkanek (kolagen,
elastyna, tubulina, aktyna, ą-keratyna); do białek strukturalnych zalicza się także histony
pełniące kluczową rolę w upakowaniu DNA w chromatynie
- transportujące  np. hemoglobina uczestniczy w transporcie tlenu i CO2, niektóre białka
osocza (prealbumina) transportujące hormony, transferyna przenosząca żelazo, niektóre
białka błonowe np. kanały jonowe pośredniczące w transporcie jonów, nośniki w trans-
porcie metabolitów i jonów, pompy funkcjonujące w transporcie aktywnym jonów i meta-
bolitów
- regulacyjne  np. niektóre hormony (somatotropina, insulina), a także receptory uczestni-
czące w percepcji różnych cząsteczek sygnałowych; białkami regulatorowymi są także
czynniki transkrypcyjne, regulujące ekspresję genów
- odpornościowe  białka układu immunologicznego (np. immunoglobuliny) chronią orga-
nizm przed czynnikami chorobotwórczymi i ksenobiotykami (substancjami obcymi dla
organizmu)
- motoryczne  uczestniczą w procesach związanych z ruchem (aktyna, miozyna); kinezyna
funkcjonuje w przemieszczaniu organelli w komórce
- zapasowe  np. owoalbumina w białku jaja stanowi z
ródło aminokwasów dla rozwijające-
go się zarodka, ferrytyna wiąże żelazo w wątrobie, kazeina jest białkiem zapasowym mle-
ka, niektóre białka budujące mięśnie mogą być wykorzystywane jako materiał energe-
tyczny; także wiele białek roślinnych pełni funkcję zapasową
Ze względu na rozpuszczalność i kształt, białka dzielą się na globularne (kuliste) i fi-
brylarne (włókienkowate, skleroproteiny). Do białek fibrylarnych należą: ą-keratyny wło-
sów, wełny, piór, paznokci, kolageny zawarte głównie w tkance łącznej, elastyny, fibroina
jedwabiu. Białka globularne obejmują: białka obojętne (albuminy, globuliny), białka kwaśne
(prolaminy, gluteiny) oraz białka zasadowe (histony, protaminy).
Na Ryc. 9 przedstawiono schematycznie, w około 1,5-milionowym powiększeniu, struktu-
ry kilku wewnątrz- i pozakomórkowych białek.
10
Ryc. 9. Strukturalne i funkcjonalne zróżnicowanie białek (schematyczne struktury w około
1,5 mln powiększeniu; długość kolagenu w tym powiększeniu wynosi około 30 cm) (Ko-
olman i R�hm 2005)
11
WYKONANIE
Chromatografia bibułowa aminokwasów (wstępująca)
Na arkusz bibuły o wymiarach 15 x 20 cm z zaznaczoną linią startową, nanieść w 2
cm odstępach po kilka �l roztworu wzorcowych aminokwasów (glicyna, alanina, tyrozyna,
leucyna) oraz taką samą objętość roztworu zawierającego mieszaninę aminokwasów (próba
badana). Każdy aminokwas wzorcowy oraz próbę badaną nanieść na bibułę dwukrotnie w
celu wyeliminowania ewentualnych artefaktów. W czasie nanoszenia próbek miejsce nano-
szenia należy suszyć suszarką do włosów, tak by wielkość plamek była możliwie jak naj-
mniejsza. Arkusz bibuły z naniesionymi próbkami zwinąć w cylinder, spiąć zszywkami i
umieścić do rozwinięcia w komorze chromatograficznej. Rozdział przerwać, gdy rozpusz-
czalnik dotrze na wysokość około 1,5 cm od górnego brzegu bibuły. Po wyjęciu bibuły z ko-
mory, zaznaczyć ołówkiem czoło rozpuszczalnika, bibułę wysuszyć w strumieniu ciepłego
powietrza (ok. 500C), spryskać roztworem ninhydryny, a następnie wysuszyć w suszarce w
temperaturze 800C w celu zlokalizowania miejsca położenia rozdzielonych aminokwasów.
Pomierzyć odległości od linii startu do środka wybarwionych plamek oraz odległość do czoła
rozpuszczalnika, a następnie obliczyć wartości współczynnika Rf. Porównując wartości Rf
aminokwasów wzorcowych i aminokwasów zawartych w próbce zidentyfikować aminokwa-
sy występujące w otrzymanej do analizy mieszaninie. Należy również porównać wyliczone
wartości Rf z wartościami zamieszczonymi w Tabeli 1.
Reakcje charakterystyczne aminokwasów
A. Reakcje ogólne:
Reakcja z ninhydryną
Do 0,1 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 1 kroplę 0,1% roztworu ninhydryny i
ogrzać do wrzenia. Pojawia się fioletowo-niebieskie zabarwienie. Aminokwasy pod wpły-
wem ninhydryny ulegają utlenieniu do iminokwasów (reakcja poniżej). Kolejne etapy prze-
mian to deaminacja i dekarboksylacja oraz wytworzenie aldehydu skróconego o 1 atom wę-
gla. W wyniku kondensacji utlenionej i zredukowanej w powyższym procesie cząsteczki nin-
hydryny oraz amoniaku powstaje kompleks o fioletowo-niebieskiej barwie (maksimum ab-
sorpcji przy  = 570 nm), którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu amino-
wego aminokwasu. Reakcja z ninhydryną może służyć do ilościowego oznaczania aminokwa-
sów metodą spektrofotometryczną. Dodatni odczyn ninhydrynowy dają obok aminokwasów,
peptydów i białek także sole amonowe, aminocukry i amoniak.
12
Reakcja aminokwasów z ninhydryną
B. Reakcje charakterystyczne dla wybranych aminokwasów
Reakcja ksantoproteinowa
Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 0,25 ml stężonego HNO3 i kroplę stężone-
go H2SO4. Roztwór barwi się na żółto. Po zalkalizowaniu 30% roztworem NaOH, zabarwie-
nie przechodzi w pomarańczowe. Reakcja ta jest charakterystyczna dla aminokwasów aro-
matycznych i fenoli. W wyniku działania stężonego HNO3 pierścień benzenowy ulega ni-
trowaniu, a powstałe żółte pochodne wielonitrowe dają w roztworze zasadowym pomarań-
czowe aniony nitrofenolanowe.
Reakcja cystynowa
Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 0,5 ml 10% roztworu NaOH i kilka kropel
nasyconego roztworu octanu ołowiu. Podczas ogrzewania ze stężonym NaOH, z cystyny i
cysteiny wydziela się siarkowodór, który w reakcji z Pb2+ daje siarczek ołowiu. Po dłuższym
gotowaniu roztwór staje się brunatny, a następnie wytrąca się osad PbS.
NaOH NaOH H2S
Pb(OOC-CH3)2 Pb(OH)2 Pb(OH)3- PbS �!
13
Kolorymetryczne oznaczanie białek metodą biuretową
Zasada metody:
Metoda polega na oznaczaniu natężenia barwy powstałej w wyniku wytworzenia
związków kompleksowych białek z jonami miedzi (II) w środowisku zasadowym, z mak-
simum absorbancji przy  = 540 nm. Intensywność barwy w reakcji biuretowej jest propor-
cjonalna do liczby wiązań peptydowych. Zależność ta jest wykorzystywana do ilościowego
oznaczania białek. Czułość metody  0,1 mg/ml.
Nazwa reakcji pochodzi od biuretu, związku powstającego w wyniku kondensacji dwóch czą-
steczek mocznika, zawierającego w swej cząsteczce wiązania amidowe:
Metoda biuretowa nie nadaje się do oznaczania białek w obecności soli amonowych, gdyż jon
amonu daje również barwne kompleksy z jonami miedzi (II). W reakcji przeszkadza także
14
siarczan (VI) magnezu, ponieważ wytrącający się w środowisku nierozpuszczalny wodorotle-
nek magnezu maskuje właściwy odczyn.
Odczynniki:
1. Standardowy roztwór albuminy  10 mg/ml w 0,9% NaCl
2. Odczynnik biuretowy  1,5 g 5hydratu CuSO4 i 6,0 g winianu sodu i potasu rozpuścić w
500 ml wody dest. w kolbie miarowej na 1000 ml. Następnie małymi porcjami stale miesza-
jąc dodać 300 ml 10% NaOH i uzupełnić objętość wodą dest. do 1 l. Dodać 2g KJ. Odczyn-
nik jest stabilny.
Wykonanie krzywej standardowej i oznaczenie stężenia białek w surowicy krwi
Do suchych probówek odmierzyć kolejno pipetą podane w tabeli objętości standardo-
wego roztworu albuminy, wody i odczynnika biuretowego. Każdą próbę wykonać w dwóch
powtórzeniach.
Nr próby 1 2 3 4 5 6
Stężenie albuminy (mg/próbę) 1 2 3 4 5 0
Roztwór standardowy (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0
Woda destylowana (ml) 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0,5
Odczynnik biuretowy (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
A1
A540nm A2
Aśr
mg albuminy w próbie
K =
A540 nm
Równocześnie należy oznaczyć zawartość białka w 10-krotnie rozcieńczonej surowicy krwi.
Do oznaczeń pobrać 0,5 ml surowicy (w dwóch powtórzeniach) i dodać 2 ml odczynnika biu-
retowego. Po upływie 30 minut zmierzyć absorbancję wszystkich prób przy długości fali  =
540 nm w 1 cm kuwetach. Pomiaru dokonać względem próby zerowej nie zawierającej białka
15
(próba 6). Zapisać wyniki w tabeli i obliczyć współczynnik kierunkowy K. Narysować krzy-
wą wzorcową (zależność wartości absorbancji od stężenia białka w próbie). Przy obliczaniu
ilości białka w próbie stosować obliczony współczynnik K. Z oznaczonej w próbie zawartości
białka obliczyć stężenie białka w surowicy.
Zagadnienia do przygotowania:
- wzory, symbole trzy- i jednoliterowe aminokwasów proteinogennych oraz aminokwasów
cyklu mocznikowego (ornityna, cytrulina)
- klasyfikacja aminokwasów oparta na budowie chemicznej łańcucha bocznego oraz jego
polarności
- podstawowe funkcje aminokwasów (przykłady)
- ogólne zasady chromatografii podziałowej; technika chromatografii bibułowej wstępującej
- reakcje ogólne na aminokwasy (znajomość reakcji z ninhydryną)
- wybrane reakcje charakterystyczne dla aminokwasów
- budowa i właściwości wiązania amidowego (peptydowego)
- struktury drugorzędowe białek (wiązania stabilizujące strukturę)
- wiązania stabilizujące III- i IV- rzędową strukturę białek
- podział białek ze względu na funkcję (przykłady)
- kolorymetria (zasada ilościowego oznaczania białek metodą biuretową)
Literatura:
Biochemia  JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
Zarys biochemii  P Karlson PWN, Warszawa, 1987
Ćwiczenia z biochemii  pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz PWN, Warszawa, 2005
Biochemia. Ilustrowany przewodnik  J Koolman, K-H R�hm, PZWL, Warszawa 2005
16