AMINOKWASY I BIAA
KA
Aminokwasy są związkami organicznymi, które posiadają w cząsteczce grupę karboksylową i
grupę aminową.
W zale\
ności od miejsca poło\
enia grupy aminowej, wyró\
nia się ą, �, ł (itd.) aminokwasy.
Aminokwasy mo\
na podzielić tak\
e w zale\
ności od budowy łańcucha bocznego. Wyró\
nia
się:
a) aminokwasy, których łańcuch boczny stanowi wodór lub grupa alkilowa:
glicyna (Gly, G), alanina (Ala, A), walina (Val, V), leucyna (Leu, L), izoleucyna (Ile, I);
b) aminokwasy zawierające w łańcuchu bocznym grupę hydroskylową:
seryna (Ser, S), treonina (Thr, T);
c) aminokwasy zawierające w łańcuchu bocznym siarkę:
cysteina (Cys, C), metionina (Met, M);
d) aminokwas, w którym grupa aminowa jest częścią pierścienia i jest drugorzędowa:
prolina (Pro, P);
e) aminokwasy zawierające w pierścieniu ugrupowanie aromatyczne:
fenyloalanina (Phe, F), tyrozyna (Tyr, T), tryptofan (Trp, W);
f) aminokwasy kwaśne, zawierające jedną grupę aminową i dwie karboksylowe:
kwas asparaginowy (Asp, D), asparagina (Asn, N), kwas glutaminowy (Glu, E), glutamina
(Gln, Q);
g) aminokwasy zasadowe, zawierające jedną grupę karboksylową i grupy zasadowe:
lizyna (Lys, K), arginina (Arg, R), histydyna (His, H).
Charakterystycznymi cechami aminokwasów są: bardzo wysokie temperatury topnienia,
bardzo dobra rozpuszczalność w wodzie i brak rozpuszczalności w niepolarnych
rozpuszczalnikach organicznych. Jest to spowodowane szczególnymi właściwościami
chemicznymi wynikającymi z faktu, i\
aminokwasy są związkami amfoterycznymi, co
oznacza, \
e mogą reagować zarówno z kwasami jak i zasadami (a zarazem posiadają w swojej
strukturze zarówno ugrupowanie kwasowe jak i zasadowe). Najbardziej stabilną formą
aminokwasu jest sól wewnętrzna (tzw. jon obojnaczy). Natomiast w roztworze, w zale\
ności
od pHzmienia się forma, w jakiej występują. pH, w którym wypadkowy ładunek aminokwasu
jest równy zero nosi nazwę punktu izoelektrycznego (pI). W pI rozpuszczalność
aminokwasów w wodzie jest najmniejsza.
1
Dzięki tym właściwościom mo\
liwe jest wykorzystanie szeregu metod analitycznych w
analizie aminokwasów, nale\
ą do nich np. elektroforeza, elektroforeza kapilarna,
chromatografia jonowymienna.
W określonych warunkach pomiędzy grupą aminową jednego aminokwasu i grupą
karboksylową innego aminokwasu mo\
e powstać wiązanie peptydowe. Aminokwasy tworzą
w taki sposób łańcuchy, które w zale\
ności od długości (od ilości budujących aminokwasów)
nazywa się peptydami, polipeptydami (łańcuchy krótsze) lub białkami (łańcuchy dłu\
sze).
wiązanie peptydowe
dwa ą-aminokwasy dipeptyd
Ponad 700 ró\
nych aminokwasów wstępuje naturalnie w przyrodzie, jednak tylko 20 z nich
buduje białka charakterystyczne dla \
ywych organizmów. Wszystkie aminokwasy tworzące
białka nale\
ą do szeregu ą oraz posiadają konfigurację L (wyjątek stanowi glicyna, która nie
posiada centrum asymetrycznego). Ka\
dy z nich oprócz nazwy zwyczajowej posiada
trzyliterowy skrót, który stosuje się podczas pisania struktury peptydów, a tak\
e skrót
jednoliterowy stosowany podczas zapisywania sekwencji aminokwasów w białkach.
Identyfikacja aminokwasów mo\
liwa jest zarówno dzięki charakterystycznym reakcjom grup
aminowej i karboksylowej, występujących we wszystkich aminokwasach, ale równie\

reakcjom specyficznym dla poszczególnych grup funkcyjnych występujących w łańcuchu
bocznym.
2
ĆWICZENIA LABORATOTYJNE
W otrzymanych probówkach znajdują się próbki badanych związków.Na podstawie
wykonanych prób analitycznych nale\
y stwierdzić, w której probówce znajduje się
odpowiednia substancja.
Rodzaj Reakcje charakterystyczne Wynik próby
substancji
Stapianie z sodem i próba Lassaigne a Potwierdzenie obecności azotu
Reakcja ninhydrynowa
ą-Aminokwas
Reakcja z solami miedzi Reakcja pozytywna
Reakcja deaminacji i dekarboksylacji
Aminokwas z Stapianie z sodem i próba Lassaigne a Potwierdzenie obecności azotu
ugrupowaniem
Reakcja ksantoproteinowa Reakcja pozytywna
aromatycznym
Aminokwas Stapianie z sodem i wykrywanie siarki Potwierdzenie obecności siarki
zawierający Reakcja pozytywna, jeśli
siarkę(grupa występuje grupa  SH, negatywna,
Wykrywanie grup tiolowych
-SH lub -CH2- gdy siarka występuje w postaci
S-CH3) -CH2-S-CH3
Reakcja ninhydrynowa Reakcja pozytywna
Reakcja pozytywna jeśli w skład
Reakcja ksantoproteinowa białka wchodzą aminokwasy
aromatyczne
Białko
Reakcja biuretowa
Reakcje strąceniowe Reakcja pozytywna
Denaturacja
REAKCJA NINHYDRYNOWA
Aminokwasy oraz białka dają barwną reakcję z etanolowym roztworem ninhydryny. Reakcja
ta nie jest specyficzna wyłącznie dla aminokwasów. Amoniak oraz część związków
zawierających I-rzędową grupę aminową dają z ninhydryną charakterystyczne zabarwienie.
Aminokwasy, peptydy i białka powodują, i\
powstaje zabarwienie niebieskie, fioletowe,
czerwono-fioletowe lub czerwone.
Wykonanie oznaczenia:
Ok. 50 mg aminokwasu nale\
y rozpuścić w ok. 0,5 ml 0,2% etanolowego roztworu
ninhydryny. Zabarwienie powstaje natychmiast lub dopiero w następstwie ogrzania
mieszaniny do wrzenia.
3
REAKCJA DEAMINACJI I DEKARBOKSYLACJI
ą-Aminokwasy ulegają deaminacji i dekarboksylacji pod wpływem czynników utleniających
(podbromianu lub podchlorynu sodu). Końcowymi produktami reakcji są: amoniak oraz
aldehyd ubo\
szy o jeden atom węgla ni\
wyjściowy aminokwas. Aldehyd powstaje przez
dekarboksylację tworzącego się pośrednio ą-ketokwasu.
O O
H2N O
+ NaClO C C NH3 + NaCl
+
CH C
R OH
R OH
O
CO2
+
R C
H
Utworzony aldehyd mo\
na wykryć np. w reakcji z odczynnikiem Schiffa.
Wykonanie oznaczenia:
Około 50 mg substancji miesza się z ok. 0,5 ml nasyconego roztworu podchlorynu sodu,
probówkę mo\
na łagodnie ogrzać. Następnie dodaje się kilka kropli odczynnika Schiffa
(roztwór fuksyny w kwasie siarkowym (IV)). O obecności aminokwasu świadczy ró\
owa lub
czerwona barwa.
REAKCJA Z SOLAMI MIEDZI
Alifatyczne ą-aminokwasy oraz aminokwasy aromatyczne z grupą  NH2 w bocznym
łańcuchu dają barwne kompleksy z jonami metali, np. w reakcji z siarczanem miedzi (II)
tworzą kompleksy o zabarwieniu ciemnoniebieskim:
CO
O
R-CH-NH2
Cu
CO-O H2N-CH-R
Wykonanie oznaczenia:
Do wodnego roztworu aminokwasu nale\
y dodać kroplami roztwór CuSO4. Probówkę mo\
na
łagodnie ogrzać. Roztwór przyjmuje ciemnoniebieskie zabarwienie. Aby właściwie
zinterpretować wynik nale\
y równolegle wykonać ślepą próbę.
WYKRYWANIE SIARKI
Stwierdzenie obecności jonów siarczkowych (S2-) w przesączu uzyskanym po stopieniu
związku z sodem, jest pośrednim dowodem na obecność siarki w badanym związku. Poni\
ej
podano dwie metody identyfikacji jonów siarczkowych (reakcja z
pentacyjanonitrozylo\
elazianem (III) sodu, reakcja z HCl).
4
1. Reakcja z pentacyjanonitrozylo\
elazianem (III) sodu (tzw. nitroprusydkiem sodu)
Wykonanie oznaczenia:
Do probówki zawierającej ok. 1 ml przesączu otrzymanego po stopieniu analizowanej
substancji z sodem dodaje się 2-3 krople świe\
o sporządzonego 1% roztworu nitroprusydku
sodu. W przypadku obecności jonów S2- powstaje rozpuszczalne w wodzie połączenie
kompleksowe o intensywnie fioletowo-czerwonym zabarwieniu.
Na2S + Na2[Fe(CN)5NO] Na4[Fe(CN)5NOS]
Próba ta jest bardzo czuła i pozwala wykryć śladowe ilości jonów siarczkowych.
2. Reakcja z HCl
Wykonanie oznaczenia:
Do probówki zawierającej ok. 1 ml przesączu otrzymanego po stopieniu analizowanej
substancji z sodem dodaje się kroplami 10% HCl do uzyskania pH w granicach 1-3 (wobec
papierka wskaz
nikowego). Przy du\
ym stę\
eniu jonów S2-wyczuwalny jest nieprzyjemny
zapach siarkowodoru.
Na2S + 2HCl 2NaCl + H2Sę!
WYKRYWANIE GRUP TIOLOWYCH
Grupy tiolowe  SH tworzą z pentacyjanonitrozylo\
elazianem (III) sodu (nitroprusydkiem
sodu)w środowisku zasadowym związek kompleksowy o zabarwieniu czerwono-fioletowym,
według przedstawionej reakcji:
[Fe3(CN)5NO]2- + NH3 + R-SH [Fe2(CN)5NOS-R]3- + NH4+
Wykonanie oznaczenia:
Do wodnego roztworu badanej substancjidodaje się 5 kropli 10% amoniaku, po czym wkrapla
się świe\
o sporządzony 1-2% roztwór nitroprusydku sodu  powstaje zabarwienie czerwone
lub czerwono-fioletowe.
REAKCJA KSNATOROTEINOWA
Aminokwasy aromatyczne jak i białka zwierające w swoim składzie aminokwasy
aromatyczne reagują ze stę\
onym kwasem azotowym (V) tworząc nitrowe pochodne tych
aminokwasów o charakterystycznym \
ółtym zabarwieniu. W środowisku zasadowym
pochodne odszczepiają barwne aniony nitrofenolanowe.
5
Wykonanie oznaczenia:
Do ok. 0,5 ml roztworu aminokwasu aromatycznego lub rozcieńczonego roztworu białka
dodaje się 0,5 ml stę\
onego HNO3. Powstaje \
ółte zabarwienie. W wypadku braku
zabarwienia próbkę mo\
na ostro\
nie ogrzać. Po ostudzeniu próbkę alkalizuje się 5%
roztworem NaOH. Powstaje zabarwienie pomarańczowe.
UWAGA!!! Stę\
ony HNO3 jest odczynnikiem \
rącym, wszystkie reakcje, które wymagają
jego u\
ycia nale\
y wykonywać pod digestorium.
REAKCJA BIURETOWA
Obecność wiązania peptydowego (-CO-NH-) charakterystycznego dla białek wykrywa się
za pomocą tzw. reakcji biuretowej. Daje ją równie\
mocznik (po ogrzaniu) oraz związki,
które posiadają dwa wiązania amidowe w cząsteczce jak diamid kwasu szczawiowego i
malonowego.Z siarczanem miedzi (II) w roztworze zasadowym substancje te dają barwne
związki kompleksowe.
Tworzenie biuretu z mocznika:
ogrzewanie
2NH2-CO-NH2 NH2-CO-NH-CO-NH2 + NH3ę!
Wykonanie oznaczenia:
Do roztworu lub zawiesiny białka w wodzie dodaje się 1 ml 10% roztworu NaOH i 1-2 krople
roztworu CuSO4. Roztwór barwi się na kolor fioletowy (lub czerwono-fioletowy).
REAKCJE STR
CENIOWE
Charakterystyczną właściwością białek jest mo\
liwość wytrącania ich z roztworów za
pomocą kationów lub anionów. Gdy wytrącanie białka z roztworu zachodzi pod wpływem
roztworów soli, mówimy wtedy o tzw. wysalaniu. Po dodaniu do roztworu białka nasyconego
roztworu soli jak np. (NH4)2SO4, MgSO4, Al2(SO4)3, zachodzi zobojętnianie ładunków
elektrycznych cząsteczek białka przez jony o przeciwnym znaku. Obserwuje się powstanie
osadu. Białko mo\
e być ponownie przeprowadzone w postać rozpuszczoną, gdy jego
cząsteczki ponownie uzyskają swój ładunek elektryczny. Dzieje się tak po rozcieńczeniu
osadu wodą.
Wykonanie oznaczenia:
Do probówki zawierającej ok. 0,5 ml roztworu białka dodaje się taką samą ilość nasyconego
roztworu MgSO4. Wytrąca się biały osad, który rozpuszcza się po dodaniu wody.
6
DENATURACJA BIAA
KA
Denaturacja polega na trudno odwracalnej lub nieodwracalnej zmianie struktury II- i III-
rzędowej białka. Zachodzi pod wpływem ró\
nych czynników jak: podwy\
szona temperatura,
kwasy, zasady, niektóre odczynniki  95% etanol, aceton.
Wykonanie oznaczenia:
a) probówkę zawierającą ok. 0,5 ml roztworu białka umieścić we wrzącej łaz
ni wodnej.
Powstaje biały osad, który jest nierozpuszczalny w wodzie.
b) do probówki zawierającej ok. 0,5 ml roztworu białka dodać ok. 0,5 ml etanolu. Po kilku
minutach wytrąca się osad.
Analiza spektralna aminokwasów
Analizę spektralną aminokwasów wykonuje się w oparciu o zasady przedstawione dla
związków posiadających określone wiązania i/lub grupy funkcyjne. Nale\
y przy tym zwrócić
uwagę, \
e aminokwasy oprócz typowych grup funkcyjnych (tj. grupy aminowej i
karboksylowej) posiadają szereg innych ugrupowań, które mogą zmieniać właściwości
spektroskopowe poszczególnych związków.
Aminokwasy spotyka się w trzech postaciach: wolnego aminokwasu (jon obojnaczy), lub soli
utworzonych przez grupę karboksylową lub aminową. Postacie te, z uwagi na odmienny
charakter chemiczny, mogą ró\
nić się właściwościami, a co za tym idzie dawać ró\
ne widma.
1. Spektroskopia w podczerwieni (IR)
Charakterystyczne dla aminokwasów pasma absorpcyjne w IR:
Charakterystycznepasmaabsorpcji Rodzajdrgań
(cm-1)
3400-2600 N H rozciągające
3300-2800 O H rozciągające
1660-1590 N H deformacyjneasymetryczne
1550-1480 N H deformacyjnesymetryczne
1755-1730 C=O rozciągajace
2. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (1H-NMR i 13C-NMR)
1
W widmie H-NMR aminokwasów poza protonami łańcucha węglowego lub układu
aromatycznego pojawia się pojedynczy sygnał protonów grupy -NH2, charakteryzujący się
zmiennością poło\
enia (jego poło\
enie zale\
y między innymi od tego w jakiej postaci
występuje aminokwas) i sygnał pochodzący od protonu grupy COOH przy bardzo wysokich
wartościach przesunięcia chemicznego 10-12 ppm.
13
Analiza widma C-NMR opiera się na znajomości wartości przesunięć chemicznych
poszczególnych węgli budujących konkretny aminokwas np. węgle łańcucha
węglowodorowego, węgle ugrupowań aromatycznych, węgle grupy karboksylowej itd.
7