Biotechnologia oznacza zastosowanie technolog które używa systemów biologicznych, organizmów żywych lub ich składników żeby wytwarzać lub modyfikować produkty lub procesy w określonym zastosowaniu.
EUROPEJSKA FEDERACJA BIOTECHNOLOGOW- biotechnologia- integracja nauk przyrodniczych i inżynieryjnych w celu zastosowania komórek lub ich części oraz molekularnych analogów w celu pozyskania produktów i usług Termin biotechnologia został wprowadzony w 1919 roku przez Węgra- Karla Ereky (agronom).
AGROBIOTECHNOLOGIA (OECD,006)- technologie modyfikacji genetycznych (roślin i zwierząt), klonowanie organizmów żywych, selekcja z użyciem markerów molekularnych, diagnostyka (mikromacierze DNA i białek oraz czujniki biologiczne dla potrzeb wczesnego/precyzyjnego wykrywania chorób ), technologie produkcji paliwa z biomasy, biorolnictwo (dodatki do roślin). Biorafineria - integruje różnorakie procesy jednostkowe w celu uzyskania poszczególnych produktów tj. pożądane związki chemiczne, biopaliwa, ciepło czy energię elektryczną.
Biogaz - gaz pozyskany z biomasy w szczególności z instalacji przeróbki odpadów zwierzęcych lub roślinnych, oczyszczalni ścieków oraz składowisk odpadów.
GLOWNE DZIALY BIOTECHNOLOGII : a) zielona biotechnologia b) biała biotechnologia ( w przemyśle, w ochronie środowiska ochrona wód, mikroorganizmów) c) czerwona biotechnologia- w medycynie diagnostyka chorób leczenie d) fioletowa biotechnologia- testowanie produktów dopuszczanie na rynek. ZIELONA BIOTECHNOLOGIA- związana z rolnictwem obejmująca stosowanie metod inżynierii genetycznej w celu doskonalenia produkcji roślinnej czy zwierzęcej.
Kukurydza GMO z genem Bt nazwa handlowa YieldGard z genem MON 810 dopuszczona na terenie UE w tym Polski. Celem było uzyskanie większej odporności na Omacnicę Prosowiankę. Uprawiana jest na powierzchni ponad 107000 ha w 8 krajach (51odmian kukurydzy Bt). Polska w 2006 roku 30 ha, w 2007 250 ha. Najwięcej upraw kukurydzy z genem Bt uprawia Hiszpania.
Trzy obszary badań zielonej biotechnologii:
-produkcja roślin in vitro (w warunkach laboratoryjnych) reprodukcja całych roślin z ich części pojedynczych komórek a nawet organelli. Efektem tego jest jednorodność genetyczna i uwolnienie namnożonego materiału od chorób. Mikrorozmnażanie storczyków.
-inżynieria genetyczna - precyzyjne umieszczanie genów warunkujących powstanie wyłącznie pożądanych cech w roślinach lub u zwierząt. Ulepszony organizm zachowuje swoje właściwości i zyskuje dodatkową cechę o dużym znaczeniu z punktu widzenia ekonomii zdrowia lub ochrony środowiska np. pomidor transgeniczny Flavr Sarr 1994 (dojrzewanie i miękczenie pomidora)
-hodowla a wykorzystaniem markerów molekularnych - połączenie tradycyjnej hodowli selekcyjnej z inżynierią genetyczną, gdzie markery molekularne stanowią białko lub fragmenty DNA przyłączone do genu warunkującego pożądaną cechę, którą hodowca chce otrzymać w wyniku krzyżowania i selekcji nowej odmiany np. winogronaidentyfikacja odmian
Biała biotechnologia biotechnologia przemysłowa wykorzystująca systemy biologiczne w produkcji przemysłowej i ochronie środowiska. Opiera się na biokatalizie i bioprocesach.
Czerwona biotechnologia wykorzystywana w medycynie, ochronie zdrowia, w szczególności w zakresie produkcji nowych biofarmaceutyków, rozwoju diagnostyki genetycznej, genoterapia czy ksenotransplantologia.
Fioletowa biotechnologia związana z ustawodawstwem, które dotyczy biotechnologii (prawne, społeczne uwarunkowania) np. rozporządzenie parlamentu europejskiego, dyrektywa parlamentu europejskiego, dyrektywa rady.
ISAAA- monitoruje co sie dzieje w uprawach, ukazuje raporty. PRODUKTY ZAWIERAJACE GMO- będące genetycznie modyfikowanymi organizmami GMO np pomidory, zawierające przetworzone GMO np pasztet sojowy, płatki kukurydziane. Produkowane z zastosowaniem GMO np sery wino, będące pochodnymi GMO lecz nie zawierające żadnych składników zmodyfikowanych genetyczne np olej z transgenicznej soi. KOLEJNE FAZY ROZWOJU AGROBIOTECHNOLOGII: I faza cechy agronomiczne- pomagają rolnikom uzyskać większe plon przy zastosowaniu mniejszej ilości Śródków chemicznych 2 faza- cechy jakościowe- produkcja lepszej jakości 3 faza- biomateriały- rośliny jako zrównoważone biofabryki
KULTURY IN VITRO- hodowla części roślin, tkanek lub pojedynczych komórek na sztucznych pożywkach w sterylnych warunkach. TOTIPOTENCJA- zdolność pojedynczej komórki roślinnej do odtworzenia całego organizmu. DROGI REGENERACJI ROSLIN W KULTURACH IN VITRO: 1) organogeneza: bezpośrednia- tworzenie merystemow w wyszczepionych fragmentów roślin, pośrednia- tworzenie merystemow w tkance kalusowej 2) embriogeneza somatyczna: bezpośrednia- tworzenie zarodków w wyszczepionych fragmentach roślin, pośrednia- tworzenie zarodków w tkance kalusowej. WYKORZYSTANIE TECHNIK KULTUR IN VITRO 1) utrzymanie zmienności genetycznej i rozmnożenie roślin: mikrorozmnażanie, nasiona syntetyczne, uwalnianie roślin od patogenów, zachowanie zasobów genowych 2) otrzymywanie nowej zmienności genetycznej: zmienność somaklonalna (raczej nie korzysta sie) , mutageneza (proces ma charakter losowy nie wiemy jaka będzie mutacja, rzadko pozytywne zmiany) , mieszance generatywne, (krzyżowanie z rożnych gatunków w wyniku krzyżowania nie otrzymujemy nasion) mieszance somatyczne, (niema polaczenia jadra dokonuje sie fuzji z 2 komórek które nie maja ściany) haploidyzacja(tam gdzie tkanki haploidalne) zachodzi haploidyzacja) rośliny transgeniczne. ETAPY PROWADZENIA KULTUR IN VITRO: przygotowanie materiału roślinnego, przygotowanie pożywek, pobranie fragmentu rośliny, powierzchniowa sterylizacja materiału roślinnego (zapewnienie sterylnych warunków), wyszczepienie fragmentu rośliny na pożywkę (wyłożenie) , dobór odpowiednich warunków środowiska, pasażowanie , przesadzenie zregenerowanej rośliny do gleby
INVIVO DO GLEBY INVITRO W LABORATORIUM. MATERIAL ROSLINY- hodowli w warunkach in vitro mogą podlegać wszystkie części roślin, organy, tkanki, pojedyncze komórki lub cale rośliny. Odpowiedni wybór materiału roślinnego decyduje o przebiegu kultury. KRYTERIA WYBORU MATERIALU ROSLINNEGO a) wiek rośliny matecznej (łatwiej regenerują rośliny młode ,w początkowych fazach rozwoju, zdrowie i intensywnie rosnące ) b) wybór organu do pobrania eksplantatu (najodpowiedniejsze części roślin to młode organy zawierające rożnego rodzaju tkanki merystematyczne, które w warunkach in vitro łatwo podejmują rozwój) c) warunki wzrostu roślin matecznych (rośliny powinny być zdrowe, wolne od patogenów, rosnące w optymalnych warunkach- oświetlenie, nawożenie, ochrona roślin, głownie rośliny uprawiane w szklarni) d) pora roku (w okresie wiosennym obserwuje sie większe zdolności regeneracyjne). PRZEGLAD KULTUR IN VIRRO- materiał wyjściowy do kultur in vitro stanowią pierwotne które wyłożenie na pożywkę regenerują w pędy lub formują kalus. Ze względu na rodzaj użytego eksplantatu wyróżniamy kilka rodzajów kultur- kultury merystemow, kultury pylników i mikrospor, kultury niezapylonych zalążni i zalążków, kultury kalusa, kultury zawiesin komórkowych, kultury protoplastów, kultury zarodków, kultury organów roślinnych. MERYSTEM- stożek wzrostu, ZALAZNIA- ZENSKI W KWIECIE Załazek- miejsce gdzie powstaje 1 nasiono, PROTOPLAST- Komorka roślinna pozbawiona ściany komórkowej
Skład i przygotowanie pożywek w skład pożywek powinny sie znalesc składniki łatwo rozpuszczalne w wodzie (składniki mineralne, organiczne czyli węglowodany, źródło azotu ,witaminy gl z grupy b, regulatory wzrostu oraz inhibitory oraz drożdże mleko kokosowe ekstrakty roślinne hydrolizant kazeiny, pepton, trypton oraz musi być optymalne pH. Pożywka zawiera:
- makroelementy - azot, fosfor, potas, siarka, sód, magnez, wapń, żelazo, chlor
- mikroelementy - bor, molibden, miedź, mangan, cynk, kobalt, jod, glin, nikiel, tytan
- witaminy - tiamina, kwas pantotenowy, pirydoksyna, biotyna, kwas askorbinowy
- węglowodany - sacharoza, glukoza, maltoza itp.
- regulatory wzrostu i rozwoju roślin - auksyny (IAA, IBA, NAA, 2,4D), cytokininy (zeatyna, kinetyka, BAP), gibereliny (GA3)
- wyciągi naturalne - mleko kokosowe, hydrolizat kazeiny
- inne - wolne aminokwasy, inozytol, węgiel aktywowany, agar
WITAMINY: Tiamina- (witaminaB1; 0,1-1,0 mg/l), Kwas pantotenowy- (itaminB3, lub B5; 0,1-10 mg/k), Pirydoksyna, biotyna, kwas askorbinowy, kwas nikotynowy(witamina PP 0,5-1,0 mg/l), kwas foliowy. WEGLOWODANY- sacharoza (dwucukier zbudowany z glukozy i fruktozy od1 do 5 %, glukoza od3 do 4% (około 30-40g nie dla wszystkich kultur sie nie nadają), maltoza, inozytol- alkoholowa pochodna cukrów prostych. SUBSTANCJE ZESTALAJACE POZYWKE: dodaje sie nie zwierzęce (agar- pochodzi z glonów morskich około 6g na L), agaroza (z glonów innego rodzaju) , gerlite 2,5 G NAL)).REGULATORY WZROSTU I ROZWOJU ROSLIN 1) takie same regulatory roślinne mogą: działać Roźnie nie tylko na rożne eksplantanty ale również na odmiany i klony tego samego gatunku. Działać Roźnie na eksplantanty z tej samej rośliny pochodzące z rożnych tkanek i organów (np auksyny). Działać Roźnie na ekplantanty z tej samej rośliny w rożnych etapach rozwoju (inaczej w fazach) 2) kolejne podanie rożnych regulatorów daje odmienny efekt niz ich równoczesne zastosowanie. 3) wzrastająca koncentracja może wywoływać nasilanie sie efektu (działać coraz lepiej) po przekroczeniu progu liściowego może spowodować zmianę efektu (spadek) 4) rożne regulatory mogą powodować taka sama reakcje morfogenetyczna z rożnych tkanek lub roślin należących do rożnych grup taksonomicznych 5) reakcja eksplantantu na fitohormony jest modyfikowana przez środowisko 6) działanie regulatorów wzrostu zależy od wieku kultur.(im bedzie je prowadzimy tym bardziej sie uodparniają) 7) reakcja morfogenetyczna ekplantantu na regulatory wzrostu następuje po rożnym okresie (zależy od stężenia i rodzaju regulatora, rodzaju eksplntantu i jego wrażliwości) 8) większość regulatorów wzrostu jest co najmniej częściowo metabolizowane do form nieaktywnych fizjologicznie
AUKSYNY- odpowiadają za wzrost wydluzeniowy łodyg, indukcje tworzenia korzeni. dominacje wierzchołkowa, wykształcanie tkanek przewodzących, IAA IBA NAA (3 pierwsze naturalne) 2 4-D DiKAMBA PIKLORAM ( 3 ostatnie syntetyczne). CYTOKININY- odpowiadają pobudzanie podziałów komórkowych (mitotycznych ) roznicoanie ksylemu i lignifikację Komorek, stymulowanie tworzenia pędów bocznych, hamują ryzogenezy, redukowanie długości pędów, opóźnianie starzenia, zeatyna (naturalna) kinetyna BAP) GIBERALINY- GA3, odpowiadają za pobudzanie wydłużania międzywęźli pędów
Pożywki: - MS- B5- White - Nitsch
DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA ROSLIN- gen- odcinek NA odpowiedzialny za kodowanie funkcjonalnego produktu białka (np keratyna, kolagen, hormony insulina regulują,) tRNA(transportujący), rRNA(rybosomowy) do syntezy białka, snRNA, miRNA pełnia funkcje regulatorowa. BUDOWA GEU- sekwencje regulatorowe-poczatek rozplatania TATA-box- początek transkrypcji- wiązanie rybosomy ATG- egzon części kodujące- intro nie kodujące- STOP- terminator. BIALKO ---------- -----
mRNA ------------- ---------AAA pre-mRNA ---------- WIELKOSC GENOMU WYBRANYCH GATUNKOW ROSLIN: rzodkiewnik pospolity 145 Mpz/1C, cebula zwyczajna 4024, owies zwyczajny 11315, kukurydza zwyczajna 15966, kapusta polna 507, pomidor zwyczajny 883, ryz siewny 419, jęczmień 4873, Pępowa zielona 1867, zwierzęta pies 2,4 a kon 2,7. WIELKOC WYBRANYCH GENOMOW EUKARIOTYCZNYCH: muszka owocowa 140, człowiek 3000, mysz 3300, pszenica 1700 w mln par zasad= Mpz. ZWIAZEK MIEDZY ZLOZONOSCIA ORGANIZMU A WIELKOSCIA GENOMU: istnieje u niższych organizmów (do obleńców), korelacja minimalnej obserwowanej wielkości genomu ze złożonością , Komorka zwierzęca-, Komorka roślinna- 2 rodzaje organelli: mitochondria i chloroplasty (odpowiedzialne za fotosyntezę). POZIOMY MAPOWANIA GENOMU- rożne stopnie poznania genomu a) mapa genetyczna- odległość miedzy genami (x,y,z) oparte sa na częstości crossing-over i podane w centymorganach (cM) b) mapa cytogenetyczna- ukazuje charakterystyczny układ prążków w których zlokalizowane sa poszczególne geny c) mapa fizyczna- położenie specyficznych sekwencji (a-d) wyznaczone jest np przez kolejność charakterystycznych miejsc restrykcji i podane w milionach par zasad (Mb) d) pełna sekwencja zasad określonego odcinka DNA. STRUKTURA GENOMU ROSLIN- genom dzieli sie na a)geny i sekwencje związane z genami oraz a)sekwencje pozagenowe. a) dzieli sie na geny pojedyncze oraz geny powtarzalne b)dzieli sie na geny i sekwencji związane z genami oraz geny i sekwencje związane z genami. SEKWENCJE W GENOMIE CZLOWIEKA: człowiek genom 3000 Mb. DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA: markery molekularne: polimorfizm białek (rozwijająca sie od 60lat), polimorfizm DNA. (od1976r). MARKER GENETYCZNY: charakterystyczna właściwość organizmu wykorzystywana do określenia jego genotypu, zwykle jest to obecność lub brak jakiegoś genu lub białka albo występowanie jakiejsc szczególnej jego postaci, markery genetyczne znajdują zastosowanie do identyfikowania osób lub osobników zwierząt czy roślin oraz identyfikacja gatunków i szczepów drobnoustrojów oraz do określania wzajemnego położenia poszczególnych genów w genomie jakiegoś organizmu (mapowanie genomu). MARKER MOLEKULARNY: to marker bezpośrednio oparty na właściwościach kwasów nukleinowych, markery molekularne służące do klasyfikowania populacji lub identyfikowania pewnych osobników powinny byc tak dobrane aby badana populacja była pod ich względem niejednorodna czyli powinny one wykazywać polimorfizm, jest to Prażek na żel lub lub membranie odpowiadający za odcinek DNA rożnej długości lub allozyn będący efektem końcowym reakcji enzymatycznej lub hybrydyzacji z sonda molekularna, wzory prążkowe specyficzne dla poszczególnych roślin mogą być wykorzystywane podobnie jak cechy morfologiczne, nie podlegają modyfikacym wpływom środowiska. RODZAJE MARKEROW MOLEKULARNYCH: A)izoenzymy- homologiczne enzymy w obrębie danego organizmu które katalizują te sama reakcje ale różnią sie nieznacznie struktura oraz właściwościami regulacyjnymi. często ulęgają ekspresji w rożnych tkankach lub organelli lub w rożnych stadiach rozwojowych, sa kodowane przez geny zajmujące jeden locus lub rożne loci, można często odróżnić od siebie na podstawie właściwości biochemicznych takich jak ruchliwość elektroforetyczna. b)Warianty alleliczne jednego enzymu nazywane sa allozymami. ETAPY ANALIZY IZOENZYMATYCZNEJ: sporządzanie ekstraktu białkowego, elektroforeza otrzymanego ekstraktu, wykrywanie w żelu specyficznej aktywności enzymatycznej (barwienie), interpretacja elektroforogramu.
MARKERY DNA: POLIMORFIZM- występowanie różnic w DNA populacji. Kryterium zaliczenia do tej kategorii jest częstość powyżej 1% (innymi slowy zbyt częsta, by można mówić o mutacji). POLIMORFIZM DNA a)POLIMORFIZM GENETYCZNY- występowanie w populacji, w danym locus, dwóch lub więcej alleli, z częstością większa niż wynikająca z częstości mutacji, stanowi o zróżnicowaniu wewnątrz gatunku, jest powszechny szczególnie w nie kodujących regionach DNA, wynika z różnic sekwencji lub wielkości fragmentu DNA spowodowanej rożna liczba powtórzeń charakterystycznych sekwencji DNA. Polimorfizm DNA wynika z różnic w sekwencji homologicznych odcinków DNA, został on zapisany przez Wymana i White'a w 1980r, jest to zjawisko polegające na występowaniu rożnej długości fragmentów restrykcyjnych w homologicznych odcinkach DNA swoiście hybrydyzującymi z sonda molekularna. Markerami sa tu zarówno sekwencje kodujące genów jak i nie kodujące regiony DNA, wszystkie polimorfizm odzwierciadlają zmiany sekwencji DNA, obecność tych zmian może być wykrywana rożnymi metodami. POLIMORFIZM można podzielić na: SNP (ang SIngle Nucleotide Polymorphism)- polimorfizm pojedynczego nukleotydu, polimorfizm sekwencji mini- i mikrosatelitarny (tych które posiadaj przewężenie wtórne, sekwencje powtarzalne), polimorfizm może odnosić sie do sekwencji kodujących lub niekodujących. PRZYKLADY:TEST PRZYKLADY MARKEROW SKROTY RFLP- polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (charakteryzuje raczej wariant określonego genu niz genom) RAPD- polimorfizm losowo powielonych fragmentów DNA (charakteryzuje genom), AFLP- polimorfizm długości powielonych fragmentów DNA (charakteryzuje genom), SCAR- produktów powielania zsekwencjonowanego regionu (charakteryzuje głównie wariant jakiegoś genu), CAPS- sekwencji powielonej i pociętej (charakteryzuje głownie wariant jakiegoś genu), SNP- pojedynczego nukleotydu (charakteryzuje wariant określonego genu).ZASTOSOWANIE POLIMORFIZM: charakterystyka zmienności genetycznej (polimorfizm DNA) materiałów wyjściowych dla hodowli oraz kolekcji, selekcja genotypów przy użyciu MAS (marker assisted selection), ustalenie sprzężeń pomiędzy loci cech ilościowych (QTL-quantitative trait loci) np:masa tysiąca nasion, w hodowli zyta, analiza mieszańców wewnątrz- i międzygatunkowych, ustalenie pokrewieństwa form oddalonych oraz ich filogeneza, identyfikacja odmian i materiałów hodowlanych pozwalająca na ochronę praw autorskich hodowcy., przewidywanie efektu heterozji w oparciu o badanie dystansu genetycznego pomiędzy liniami rodzicielskimi, badanie czystości nasion, weryfikacja jednorodności klonów gatunków rozmnażanych wegetatywnie. (do weryfikacji sadzeniaków ziemniaka, szkółkarstwo). TECHNIKI GENETYKI MOLEKULARNEJ REAKCJA PCR (Polymerase Chain Reaction) ważne nazwa ang. Technika wynaleziona w 1983r przez Kary'ego Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus. Za prace w tej dziedzinie Kary Mullis otrzymał w roku 1993 nagrode Nobla. PCR jest reakcja cykliczna, co oznacza ze jej etapy tworzą cykle, które sa wielokrotnie (20-40razy) powtarzane. Cykl zazwyczaj sklada sie z trzech etapów. Reakcja katalizowana jest przez termostabilna polimerazę DNA, DNA- zależna, która w niewielkim stopniu traci aktywność enzymatyczna po kolejnych cyklach ogrzewania i schładzania (polimeraza wytrzymuje 90C). POLIMERAZA TAQ- enzym polimeraza DNA wykorzystywany powszechnie w reakcji PCR dzięki swojej stabilności termicznej. Nie wykazuje aktywności 3'5' egzonukleazy, przez co popełnia stosunkowo dużo błędów. Dostępne w sprzedaży polimerazy Taq wprowadzają jeden błąd na 10000 nukleotydów. Jest w stanie dokonać replikacji 1000 par zasad w ciągu 30 sekund w temp 72C. Po swojej reakcji zostawia na końcu 3' kilka nukleotydów adeninowych. Ta właściwość wykorzystywana jest przy klonowania produktów PCR. Wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus. DO swojej aktywności wymaga jonów Mg. THERMUS AQUATICUS A THERMOPHILUS AWUATICUS: gatunek bakterii który dobrze znosi wysokie temp, ETAPY (temp)- PCR jest reakcja cykliczna, co oznacza ze jej etapy tworzą cykl, ktore sa wielokrotnie (20-40 razy) powtarzane. Cykl zazwyczaj składa sie z 3 etapów: a)denaturacja DNA- zachodzącym najczęściej w temp 92-95C rozdzielania nici DNA, w kolejnych etapach beda one matryca dla syntezy komplementarnych nici, b) temp 30-50C przyłączania oligonukleotydow (starterów)- obniżenie temp powoduje hybrydyzacje starterów z jednoniciowych DNA (patrz etap denaturacji) c) 72C, wydłużania starterów związanych z matryca powielanego DNA. REACJA katalizowana jest przez stabilna polimerazę DNA, DNA- zależna która w niewielkim stopniu traci aktywność enzymatyczna po kolejnych cyklach ogrzewania i schładzania.
KOŁO PCR- powielanie wybranych fragmentów (2), woda, wolne nukleotydy dNTP (G,C,T,A), mg2+ TERMOCYKLER- podnosi i obniża temp w krótkim czasie, podgrzać ok 90 by rozpad nastąpił, schłodzić do temp startera 40-60 C (52-3 C) podgrzać do 72C dołączanie przez polimerazę nowych fragmentów 0,5-2mm, cykle 30-45. Gdy fragment krótki- szybko będzie na żeli się przecinał PCR- stosowanie: ojcostwo, kryminalistyka, odporność na patogeny, diagnostyka medyczna