Agrobiotechnologia – ćwiczenia

Pomieszczenia laboratoryjne:

- pomieszczenie do przygotowania próbki

- pomieszczenie do pracy sterylnej (komory z laminowym przepływem sterylnego powietrza)

- pokój wzrostowy (fitotron) – kontrolowana wilgotność, półki i szklarnie

- pomieszczenie gospodarcze (mycie szkła itd., obieranie warzyw)

- szklarnia, pokój izolacyjny i komory klimatyczne, wegetacyjny

Ćw II

1. Korzenie marchwi starannie umyć w bieżącej wodzie i obrać ze skórki

2. Zlewkę i płytkę używaną do sterylizacji przetrzeć watą nasączoną 70% EtOH

3. Korzenie marchwi umieścić w zlewce, zalać 20% roztworem Domestosu, przykryć płytką. Dezynfekcje prowadzić przez 60 min.

4. Materiał roślinny zalać sterylną wodą destylowaną (2X 20 min)

5. Przygotować stół komory do pracy sterylnej

6. Eksplantaty wycinać w warunkach sterylnych według zamieszczonego schematu. Wycięte fragmenty korzenia umieścić w probówkach na pożywce agarowej, odwrotnie do kierunku wzrostu rośliny.

7. Kulturę przenieść do pomieszczenia wzrostowego (natężenie światła ok. 100 umol x n^-2 x s^-1, temperatura ok. 25^oC)

8. Przeprowadzić obserwacje po 2 tygodniach kultury, wyniki zestawić w tabeli.

Wybór metody izolacji zależy od:

1. Rodzaju izolowanego DNA

- całkowite

- jadrowe

- organellowe (Tridan x 100 z buforami uszkadza błonę mitochondrialną nie z jądra komórkowego)

- plazmidowe

2. Organizmu z którego izolujemy

- zwierzę, bądź roślina (CTAB – jeśli jest dużo sacharydów – skutecznie usuwa polisacharydy; polifenole – blokują enzymy; PVP – do usuwania polifenoli)

- bakteria lub virus

3. Rodzaj tkanki z jakiej izolujemy

- miękkie (liście, wątroba)

- twarde (nasiona, kości)

4. Cel do jakiego wykorzystujemy DNA

- PCR

- hybrydyzacja

- sekwencjonowanie

- klonowanie

Izolacja DNA

1. Zniszczenie struktury tkankowej i komórkowej (homogenizacja)

- fizyczne (ciekły azot, ultradźwięki)

- chemiczne (detergenty) – SDS, Sankozyl

- enzymatyczne (lizozym)

2. Oddzielenie DNA od innych struktur komórkowych, cząsteczek RNA i białek

- SDS

- CTAB

- Izytriocyjamnian guanidyny (bufor D)

3. Usunięcie zdegradowanych elementów komórkowych

- usunięcie białek (proteinoza K, fenol, chloroform)

- usunięcie lipidów (chloroform)

- usunięcie polisacharydów (CTAB)

- polifenoli (PVP)

- RNA (RNAza, chlorek litu)

4. Usunięcie detergentów i inch związków użytych we wcześniejszych etapach izolacji

- wytrącanie DNA w etanolu lub izopropanolu

5. Przygotowanie DNA do przechowywania

- roztwór wody

- bufor TE (tris – stabilizuje pH, EDTA – możliwość wiązania jonów dwuwartościowych)

Przygotowanie pożywki

Autoklaryzacja pożywki: Warunki sterylizacji: temperatura 120-121^oC, ciśnienie 0,1 Pa, 20 minut (w zależności od wielkości naczyń), składniki termo labilne (np. aminokwasy, niektóre regulatory wzrostu, antybiotyki) sterylizujemy przez filtrowanie.

Sterylizacja papieru, szkła, narzędzi w autoklawie (tak jak pożywka). Sterylizacja narzędzi 180^OC przez 4 godziny. Narzędzia można sterylizować również w autoklawie. W laboratorium In vitro znajdują się: destylarki, waga, lodówki, autoklaw, pHmetr, mikrofalówka (do rozpuszczania agaru), szkło, pipety. Odczyn pH po dodaniu regulatorów wzrostu zmienia się.

Reakcja PCR (polemerase chain re action)

Thermus aquaticus – zyją w gejzerach, posiadają polimerazę – odporna na działanie wysokich temperatur.

I etap – denaturyzacja 95^oC (rozpad wiązań zasadowych adenina-tymina, guanina-cytozyna) – kopiowanie odcinka.

II etap – przyłączanie starteru – aminokwasu (krótki odcinek DNA o długości od kilku do kilkunastu nukleotydów – do reakcji PCR wykorzystuje się starter od 8 do dwudziestu kilku nukleotydów, który w etapie II redukcji PCR przyłącza się do pojedynczej nici DNA na zasadzie komplementarności. Jego obecność umożliwia rozpoczęcie syntezy nici DNA przez polimeraze DNA. Zachodzi w temperaturze 35-60^oC. Zależy od długości starterów i jaką mają sekwencje.

III etap – polimeryzacja – dobudowywuje do startera nic zgodnie z zasadą komplementarności. Po polimeryzacji następują dwie cząsteczki DNA dwuniciowe. Zachodzi w temperaturze około 70⁰C

Te 3 etapy to jeden cykl reakcji PCR – w reakcji jest ich od 30-40 cykli

RAPD – stosujemy starter – tylko jeden.

Elektroforeza – zjawisko kinetyczne, w którym pod wpływem przyłożonego napiecia makroczateczki obdarzone ładunkami elektrycznymi, przemieszczaja się w polu elektrycznym, technika stosowana do rozdzialu i oczyszczania kwasow nukleinowych i bialek

- elektroforeza swobodna (w roztworze)

- elektroforeza stabilizowana na złożach.

Prędkość przemieszczania się czasteczek zalezy od:

- wielkości czasteczek (szybkość migracji wprost proporcjonalna logarytmu dziesiętnego z masy cząsteczek

- oporu środowiska w którym następuje rozdział (stężenie żelu)

- konformacji (kształtu czasteczek)

- natężenia pola elektrycznego

- składu elektrodowego

Rodzaje nośników elektrofonerycznych:

- bibula

- azotan celulozy (plytki)

- agarowa (żel) polisacharyd otrzymany z glonów morskich rozpuszczony w roztworze wodnym – tworzy stały żel.

- poliakrylamid (polimer akryl amidu i bis akryl amidu – czynnik sieciujący.