Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka

Przedmiot: Enzymologia

Temat ćwiczenia:

Wyznaczanie stałych kinetycznych α-amylazy oraz określenie wpływu aktywatorów i inhibitorów na szybkość reakcji hydrolizy skrobi

Wprowadzenie:

Na szybkość przebiegu reakcji enzymatycznych mają zasadniczy wpływ różnego rodzaju aktywatory. Substancje te nie biorą udziału w reakcji, jednak aktywują lub zwiększają aktywność enzymów. Można je podzielić na trzy grupy:

1. kofaktory - koenzymy, grupy prostetyczne oraz jony niektórych metali, wbudowanych w cząsteczkę apoenzymu, a także niektóre aniony nieorganiczne

2. makrocząsteczki białkowe, odkrywające grupy czynne enzymu, przekształcające nieaktywną formę enzymu w aktywną

3. drobnocząsteczkowe połączenia organiczne, usuwające wpływ związków hamujących, redukujące potencjał oksydoredukcyjny środowiska

Organizm człowieka wymaga dostarczenia z pożywieniem niezbędnych mikroelementów, które są aktywatorami wielu enzymów. Zwykle są one częściami układu aktywującego, tzn. białko enzymatyczne jest niezdolne do aktywacji substratu, jeśli brakuje odpowiedniego jonu metalu. Metale są niezbędne do wytworzenia wiązania między enzymem a substratem lub między enzymem, koenzymem i substratem, albo wchodzą w skład centrum katalitycznego enzymu i warunkują jego działanie (bez nich enzym jest nieczynny). Do kationów aktywujących niektóre enzymy (enzymy przenoszące elektrony - fosfatazy, dehydrogenazy, lipaza i inne) należą Mg²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Na⁺, K⁺. Koenzymami są najczęściej witaminy i ich pochodne, odgrywają one rolę zwłaszcza w enzymach nieproteolitycznych. W przypadku enzymów proteolitycznych zasadnicze znaczenie mają jony Ca²⁺ (stabilizują aminopeptydazy, proteinazy serynowe i tiolowe), Co²⁺ (aktywują aminopeptydazy), Mn²⁺ (wpływają na aktywność prolidazy) i Zn²⁺ (warunkuje aktywność karboksypeptydazy A). Metale ciężkie hamują działanie enzymów. Aniony wywierają niewielki wpływ na działanie enzymów, wyjątek stanowi aktywowanie amylazy oraz katepsyny C przez chlorki.

Niektóre enzymy wytwarzane są w postaci nieaktywnej, jako prekursory enzymów (proenzymy lub zymogen), a ich działanie pobudzane jest przez przekształcenie w wyniku aktywności innych enzymów, np. enterokinaza przekształca nieaktywny trypsynogen
w aktywną trypsynę. Następuje to najczęściej przez przecięcie łańcucha peptydowego proenzymu w określonym miejscu, co powoduje zmianę konformacji peptydu i odsłonięcie miejsca aktywnego.

Aktywatorami nazywamy także czynniki, które usuwają wpływ inhibitorów, ograniczających czasowo działanie enzymu. Aktywność wielu enzymów jest hamowana
w obecności łagodnych środków utleniających, np. tlenu atmosferycznego, co jest katalizowane przez metale ciężkie, znajdujące się w śladowych ilościach w odczynnikach lub materiale badawczy, czy tez pochodzące z metalowych przedmiotów używanych podczas preparowania enzymów. Taka inhibicja jest często odwracalna, gdy np. zredukujemy grupę -S-S- za pomocą cysteiny, odtworzona zostanie aktywna grupa -SH, natomiast związki kompleksujące mogą związać metale ciężkie. Do enzymów, których aktywność zależy od obecności wolnych grup tiolowych należą katepsyny B, L i H.

Amylaza to ogólna nazwa enzymów hydrolizujących skrobię, do których zaliczamy α-amylazę, endoamylazę rozkładającą wiązania α-1,4-glikozydowe amylozy i amylopektyny; β-amylazę, rozkładającą skrobię od końca łańcucha, rozcinając wiązania α-1,4-glikozydowe oraz amyloglukozydazę i glukoamylazę, odcinające glukozę na końcu łańcucha skrobiowego, rozkładające zarówno wiązania α-1,4-glikozydowe, jak i α-1,6-glikozydowe. W wyniku działania α-amylazy powstają α-dekstryny o małej masie cząsteczkowej i niewielka ilość maltozy. W wyniku działania β-amylazy powstają duże amylodekstryny i znaczna ilość maltozy.

Z jodem skrobia daje zabarwienie niebieski, kolejne produkty pośrednie rozkładu skrobi dają odpowiednio barwę: niebieskofioletową (amylodekstryny), czerwoną (erytrodekstryny), czerwonobrunatną (achrodekstryny). Maltoza nie daje zabarwienia
z jodem.

Optymalne warunki działania amylaz, to, w zależności od pochodzenia enzymu, pH lekko kwaśne (zbożowe) do obojętnego (zwierzęce), temperatura 50-65^oC (zbożowe) i 37^oC (zwierzęce), obecność jonów Cl^-.

Celem ćwiczenia jest wyznaczenie K_M i V_max oraz określenie wpływu NaCl i mocznika
na szybkość reakcji enzymatycznej hydrolizy skrobi.

Wykonanie ćwiczenia:

Zadanie 1. Oznaczanie aktywności α-amylazy

1. Sporządzić 100 50g roztworu skrobi ziemniaczanej o stężeniu 10, 15, 20 i 25%.

2. Roztwór ogrzewać na kuchence, ciągle mieszając, aż do skleikowania skrobi.

3. Do zlewki odważyć 10 g kleiku, dodać 15 ml wody, całość wymieszać i oznaczyć stężenie produktów hydrolizy skrobi (naturalnie występującyc) przy użyciu refraktometru (próba kontrolna).

4. Do roztworu dodać 5 ml roztworu enzymu, dokładnie wymieszać i co 5 minut oznaczać stężenie produktów hydrolizy przy użyciu refraktometru.

5. Pomiar zakończyć po trzykrotnym powtórzeniu się tej samej wartości.

6. Otrzymane wyniki wprowadzić do tabeli nr 1.

Tab. 1. Stężenie produktów hydrolizy skrobi podczas hydrolizy [g/50g]

Stężenie skrobi [g/100 - 50g]	Czas hydrolizy [min]
		0	5	10	15	20	25	30	35	40
5%	1	1,5	1,5	1,5
7,5%	2	2,5	3	3,2	3,2	3,2
10%	0,05	1	1,8	2	3,1	3,1	3,1
12,5%	0,05	2,3	3,1	3,8	4	4,1	4,3	4,3	4,3

7. 
   Dla każdego stężenia skrobi narysować wykres stężenia produktu od czasu i do powstałej krzywej wyznaczyć styczną przechodzącą przez początek układu współrzędnych (rys. 1).

8. Następnie wyznaczyć szybkość początkową ze wzoru:

v_o = tg α = x/t

9. Uzupełnić tabelę nr 2. i wyznaczyć stałe kinetyczne K_M i V_max.

Stężenie początkowe substratu (skrobi) [g/50g]	Szybkość początkowa vo [g/50 g/min]	1/S	1/ vo
5	0,3	0,20	3,33
7,5	0,5	0,13	2,00
10	0,2	1,10	5,00
12,5	0,46	0,08	2,17

Zadanie 2. Określanie wpływu aktywatorów i inhibitorów oraz pH na aktywność
α-amylazy

1. Sporządzić 100 g roztworu skrobi ziemniaczanej o stężeniu 15%.

2. Roztwór ogrzewać na kuchence, ciągle mieszając, aż do skleikowania skrobi.

3. Do zlewki odważyć 10 g kleiku, dodać 14 ml wody i odpowiedni dodatek wg wariantów poniżej. Całość wymieszać i oznaczyć stężenie produktów hydrolizy skrobi przy użyciu refraktometru (próba kontrolna).

1. 1 ml 50% roztworu soli kuchennej (0,5 g soli w 1 ml - stężenie końcowe 2%)

2. 1 ml 50% roztworu mocznika (0,5 g mocznika w 1 ml)

3. 1 ml 0,1 n NaOH

4. 1 ml 0,1 n HCl

4. Do roztworu dodać 5 ml roztworu enzymu, dokładnie wymieszać i co 5 minut oznaczać stężenie produktów hydrolizy przy użyciu refraktometru.

5. Pomiar zakończyć po trzykrotnym powtórzeniu się tej samej wartości.

6. Otrzymane wyniki wprowadzić do tabeli nr 3.

Tab. 3. Stężenie produktów podczas hydrolizy [g/100g]

Wariant	Czas hydrolizy [min]
		0	5	10	15	20	25	30
NaCl			4,9
mocznik			8,2
NaOH
HCl

7. Dla każdego wariantu narysować wykres stężenia produktu od czasu i do powstałej krzywej wyznaczyć styczną przechodzącą przez początek układu współrzędnych (rys. 1).

8. Następnie wyznaczyć szybkość początkową ze wzoru:

v_o = tg α = x/t

9. Porównać szybkości początkowe poszczególnych wariantów z próbą z zadania pierwszego (stężenie skrobi 15%) i wyciągnąć wnioski.

Zagadnienia do przygotowania:

1. Wpływ różnych czynników na szybkość reakcji enzymatycznych.

1. Wyjściowe stężenie substratu, enzymu

2. Czynniki zewnętrzne:

1. Temperatura

2. Obecność aktywatorów i inhibitorów

3. pH środowiska

4. Lepkość roztworu, skład roztworów, zanieczyszczenie itp.

Stężenie substratu, w jednakowych warunkach:

1. Przy małym stężeniu szybkość reakcji chemicznej wzrasta wprost proporcjonalna do stężenia substratu. (Wzrost stężenia enzymu powoduje nieznacznie wzrost szybkości reakcji ale nie będzie to wzrost liniowy)

2. Przy średnim stężeniu substratu szybkość reakcji wzrasta, i jest równe K_M, osiąga połowę V_max.

3. Przy dużym stężeniu substratu, nie ma wpływu na szybkość reakcji, osiąga wartość maksymalną. Dochodzi do tego w momencie, gdy wszystkie cząsteczki enzymu są połączone z substratem, tworząc kompleksy E - S. (Wzrost stężenia enzymu powoduje wzrost wprost proporcjonalnie szybkości reakcji)

Temperatura.

Wzrost temperatury powoduje zwiększenie szybkości reakcji enzymatycznej, po osiągnięciu optimum szybkość ta zaczyna spadać ze względu na denaturację cieplną enzymu.

Optymalna temperatura zależy od długości inkubacji (gdy enzym ma działać kilka sekund, może być wysoka, gdy kilka dni - musi być niska, by długo zachował aktywność), pH środowiska, stężenia soli (różnych nie tylko NaCl),oraz obecności aktywatorów i inhibitorów (głównie jonów metali obecnych w odczynnikach jako zanieczyszczenia).

W temperaturze do ok. 37^oC (gdy nie grozi denaturacja cieplna enzymu, w pH zbliżonym do punktu izoelektrycznego, temperatura powoduje szybszą denaturację białka, denaturacja białka enzymatycznego powoduje trwałą utratę zdolności katalitycznej), podniesienie temp. o 10^oC powoduje 2-krotne zwiększenie szybkości reakcji. Zmianę szybkości reakcji w zależności od temperatury wyraża reguła van't Hoffa, według której wzrost temperatury o 10 ⁰K powoduje 2-4-krotny wzrost szybkości reakcji.

Z regułą van't Hoffa wiąże się temperaturowy współczynnik szybkości reakcji (TWSR), wyznaczający stosunek szybkości reakcji chemicznej po zmianie temperatury do szybkości reakcji przed zmianą temperatury (wzrostem lub spadkiem).

ΔT = T₂ - T₁

γ - temperaturowy współczynnik szybkości reakcji (TWSR)

Obniżanie temperatury zmniejsza szybkość reakcji biochemicznych, ale nawet zamrożenie enzymu nie powoduje trwałego utracenia jego aktywności; ponowne ogrzanie przywraca zdolność katalityczną enzymu.

pH. Szybkość reakcji jest optymalna w optymalnym pH, czyli większość w pH około 7, ale zależy od rodzaju występowania enzymu, enzymy działające pozakomórkowo, w świetle przewodu pokarmowego, charakteryzują się znacznym zróżnicowaniem optymalnych warunków kwasowości środowiska. Wpływ pH na aktywność enzymów tłumaczy się tym, że są one białkami, a liczba dodatnich i ujemnych ładunków cząsteczki białka i ukształtowanie powierzchni cząsteczki są zależne od kwasowości środowiska i zjonizowanej formy. Ogólne ramy określamy jako niskie i wysokie zależące od środowiska występowania enzymu i stopnia zjonizowania enzymu i substratu tam gdzie stopień zjonizowania występuje w enzymie i substracie tam występuje reakcja .

Inhibitory i aktywatory występujące jako jony metali ciężkich które różnie działają w zależności od enzymów o które chodzi, mogą być dodane jak i ujemne, obecne jako zanieczyszczenia w odczynnikach, substancje niskocząsteczkowe, które przyłączając się do enzymu powodują zmianę struktury przestrzennej enzymu, uniemożliwiając tworzenie kompleksów E-S. Substancje te mogą również działać jako aktywatory, przyłączając się do centrum aktywnego i polepszenie wiązania substratu. Substancje te nie biorą udziału w reakcji, jednak aktywują lub zwiększają aktywność enzymów. Można je podzielić na trzy grupy: kofaktory, makrocząsteczki białkowe, drobnocząsteczkowe połączenia organiczne.

2. Stałe kinetyczne, opisujące aktywność enzymów.

1. Stała Michaelisa -to takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji jest równa połowie szybkości maksymalnej. Szybkości początkowe oraz stałe reakcji enzymatycznych można wyznaczyć, korzystając z odpowiednich wykresów. Szybkość reakcji I rzędu można wyznaczyć, obliczając tangens kąta utworzonego przez styczną do krzywej w danym punkcie. (Wzrost stężenia enzymu powoduje proporcjonalnie wzrost szybkości reakcji.)

2. Szybkość maksymalna - Przy dużym stężeniu substratu, stężenie nie ma wpływu na szybkość reakcji, osiąga wartość maksymalną.

3. Właściwości i działanie enzymów amylolitycznych. Amylaza to ogólna nazwa enzymów hydrolizujących skrobię, Optymalne warunki działania amylaz to, w zależności od pochodzenia enzymu, pH lekko kwaśne (zbożowe), obojętnego (zwierzęce 37^oC), zasadowe temperatura 50-65^oC (zbożowe), obecność jonów Cl^-. do których zaliczamy;

1. α-amylazę, endoamylazę rozkładającą od środka wiązania α-1,4-glikozydowe amylozy i amylopektyny, nie działa na rozgałęzienia; W wyniku działania α-amylazy powstają α-dekstryny o małej masie cząsteczkowej i niewielka ilość maltozy.

2. β-amylazę, rozkładającą skrobię od końca łańcucha, rozcinając wiązania α-1,4-glikozydowe oraz amyloglukozydazę. W wyniku działania β-amylazy powstają duże amylodekstryny i znaczna ilość maltozy i dekstryna graniczna

3. glukoamylazę, odcinające glukozę na końcu łańcucha skrobiowego po jednej cząsteczce od zewnątrz i powstaje glukoza, rozkładając zarówno wiązania α-1,4-glikozydowe, jak i α-1,6-glikozydowe.

4. Działanie wszystkich enzymów może zhydrolizować skrobię do glukozy.

Działanie a-amylazy możemy badać za pomocą płynu Lugolla, z jodem skrobia daje zabarwienie niebieski, kolejne produkty pośrednie rozkładu skrobi dają odpowiednio barwę: niebieskofioletową (amylodekstryny), czerwoną (erytrodekstryny), czerwonobrunatną (achrodekstryny). Maltoza nie daje zabarwienia z jodem.

5. Badanie ilościowe; badamy stężenie produktów:

1. Badamy glukozę - metody chemicznie,

2. Zawartość cukrów prostych - maltozę za pomocą refraktometru.

4. Mechanizmy aktywacji i inhibicji enzymów.

Białko enzymatyczne jest niezdolne do aktywacji substratu, jeśli brakuje niezbędnych mikroelementów, które są aktywatorami wielu enzymów, np. odpowiedniego jonu metalu.

Metale są niezbędne do wytworzenia wiązania między enzymem a substratem lub między enzymem, koenzymem i substratem, albo wchodzą w skład centrum katalitycznego enzymu i warunkują jego działanie (bez nich enzym jest nieczynny).

Substancje, które nie zmieniając sumarycznego procesu zmniejszają energię aktywacji nazywamy katalizatorami. Katalizator nie zużywa się podczas reakcji, dlatego nie występuje w równaniu stechiometrycznym.

Katalizatory ujemne, zmniejszają szybkość reakcji nazywamy inhibitorami.

Rolę katalizatora mogą pełnić pierwiastki i związki chemiczne (zwłaszcza metale grup pobocznych i ich tlenki oraz białka - enzymy - w reakcjach enzymatycznych), a także zanieczyszczenia i światło (w reakcjach fotochemicznych).

Aktywność enzymów może być zakłócana przez działanie wielu substancji. Inhibicja może być odwracalna i nieodwracalna, inhibicja odwracalna zaś może być kompetycyjna lub niekompetycyjna. Związki, które tworzą wiązania kowalencyjne z resztą aminokwasu znajdującą się w centrum aktywnym enzymu (Ser lub Cys) lub w jego pobliżu, inaktywują enzym na stałe.

Inhibitorami kompetycyjnymi (współzawodniczącymi) mogą być związki strukturalnie podobne do normalnego substratu danego enzymu, które konkurują z nim o centrum aktywne. Enzym może wiązać albo cząsteczkę substratu, albo cząsteczkę inhibitora ale nie obie równocześnie. Hamowanie będzie tym większe im większe będzie stężenie inhibitora oraz wartość K_M oraz im mniejsze będzie stężenie inhibitora i wartość K_M (stała dysocjacji kompleksu enzymu z inhibitorem). Przy dużym stężeniu substratu, działanie jego skutecznie współzawodniczy z działaniem inhibitora, więc nie zmieni się wartość V_max, jednak wzrośnie wartość K_M (pozornie mniejsze powinowactwo enzymu do substratu).

Działanie inhibitora kompetycyjnego można rozpoznać po zastosowaniu równania Lineweavera-Burka - mierzy się szybkości początkowe v₀ przy różnych stężeniach substratu i stałym stężeniu inhibitora. Inhibicja kompetycyjna zmienia nachylenie prostej oraz punkt przecięcia z osią x (wzrasta K_M), natomiast punkt przecięcia z osią y pozostaje bez zmian (stała wartość V_max).

Inhibitorami niekompetycyjnymi są związki, które wiążą się z miejscem innym niż centrum aktywne enzymu i powodują zmianę przestrzennego kształtu enzymu, a przez to zmniejszenie jego aktywności katalitycznej. Mogą one wiązać się z wolnym enzymem lub z kompleksem enzym-substrat, a ich działanie nie zależy od stężenia substratu (wartość V_max zmniejsza się), a jedynie od stężenia inhibitora i jego wartości K_M, charakteryzującej powinowactwo inhibitora do enzymu. Powinowactwo substratu do enzymu nie ulega zmianie, dlatego wartość K_M pozostaje stała.

5. Rodzaje substancji aktywujących, ich wpływ na działanie odpowiednich enzymów.

Aktywatory - ubstancje te nie biorą udziału w reakcji, jednak aktywują lub zwiększają aktywność enzymów. Można je podzielić na trzy grupy:

1) kofaktory - koenzymy, grupy prostetyczne oraz jony niektórych metali, wbudowanych w cząsteczkę apoenzymu, a także niektóre aniony nieorganiczne

2) makrocząsteczki białkowe, odkrywające grupy czynne enzymu, przekształcające nieaktywną formę enzymu w aktywną

3) drobnocząsteczkowe połączenia organiczne, usuwające wpływ związków hamujących, redukujące potencjał oksydoredukcyjny środowiska

1. Kationy aktywują niektóre enzymy (enzymy przenoszące elektrony - fosfatazy, dehydrogenazy, lipaza i inne) należą Mg²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Na⁺, K⁺.

2. Koenzymami są najczęściej witaminy i ich pochodne, odgrywają one rolę zwłaszcza w enzymach nieproteolitycznych. W przypadku enzymów proteolitycznych zasadnicze znaczenie mają jony Ca²⁺ (stabilizują aminopeptydazy, proteinazy serynowe i tiolowe), Co²⁺ (aktywują aminopeptydazy), Mn²⁺ (wpływają na aktywność prolidazy) i Zn²⁺ (warunkuje aktywność karboksypeptydazy A). Metale ciężkie hamują działanie enzymów.

3. Aniony wywierają niewielki wpływ na działanie enzymów, wyjątek stanowi aktywowanie amylazy oraz katepsyny C przez chlorki.

4. Niektóre enzymy wytwarzane są w postaci nieaktywnej, jako prekursory enzymów (proenzymy lub zymogen), a ich działanie pobudzane jest przez przekształcenie w wyniku aktywności innych enzymów, np. enterokinaza przekształca nieaktywny trypsynogen w aktywną trypsynę. Następuje to najczęściej przez przecięcie łańcucha peptydowego proenzymu w określonym miejscu, co powoduje zmianę konformacji peptydu i odsłonięcie miejsca aktywnego.

3. Aktywatorami nazywamy także czynniki, które usuwają wpływ inhibitorów, ograniczających czasowo działanie enzymu. Aktywność wielu enzymów jest hamowana w obecności łagodnych środków utleniających, np. tlenu atmosferycznego, co jest katalizowane przez metale ciężkie, znajdujące się w śladowych ilościach w odczynnikach lub materiale badawczy, czy tez pochodzące z metalowych przedmiotów używanych podczas preparowania enzymów. Taka inhibicja jest często odwracalna, gdy np. zredukujemy grupę -S-S- za pomocą cysteiny, odtworzona zostanie aktywna grupa -SH, natomiast związki kompleksujące mogą związać metale ciężkie. Do enzymów, których aktywność zależy od obecności wolnych grup tiolowych należą katepsyny B, L i H

1. Inwertaza i oksydaza glukozowa.

Inwertaza (E.C. 3.2.1.26) jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy sacharozy do fruktozy i glukozy. Inwertaza jest wytwarzana przez komórki drożdży, pozwala rozłożyć sacharozę do łatwo przyswajalnych cukrów prostych, jakimi są glukoza i fruktoza.

W przemyśle spożywczym inwertaza jest wykorzystywana np. podczas produkcji czekoladek nadziewanych półpłynnym nadzieniem.

2. Izolacja i oczyszczanie enzymów.

Enzymy są przeważnie bardzo nietrwałe w środowisku o pH mniejszym niż 5 lub większym niż 9, łatwo ulegają też denaturacji cieplnej (powierzchniowej - podczas pienienia się roztworów) oraz są inaktywowane przez metale ciężkie.

Izolowanie należy przeprowadzać w taki sposób, aby zapobiegać utracie zdolności katalitycznych, tzn.

• w buforach o pH około 7,

• w niskiej temperaturze (najczęściej około 0^oC),

• stosując wodę podwójnie destylowaną oraz

• środki kompleksujące metale ciężkie, a w razie konieczności również związki tiulowe,

• zachowując wyjątkową czystość na stanowisku pracy.

Oczyszczanie enzymów

Dla każdego enzymu powinno się zastosować indywidualny schemat oczyszczania wykorzystujący jego własności fizykochemiczne.

1. 1 etap oczyszczania białek jest przeprowadzenie ich do roztworu, chyba że izolujemy je z płynnego źródła (np. z krwi, śliny itp.). Stosuje się w tym celu techniki doprowadzające do zniszczenia ścian, błon komórkowych lub struktury całych komórek, takie jak: -degradacja ścian komórkowych, czynniki biologiczne - lizozym, ciśnienie enzymatyczne (sól, cukier), ultradźwięki, homogenizacja, rozrywanie komórek piaskiem lub perełkami szklanymi, inne metody mechaniczne,

Enzymy rozpuszczalne łatwo poddają się procesowi ekstrakcji wodą lub rozcieńczonymi roztworami soli i buforami. Natomiast związane z błonami wymagają użycia roztworów detergentów lub rozpuszczalników organicznych, które rozpuszczają lipidy, dalsze czynności zależą od konkretnego enzymu

2) 2 etap to wstępne procesy oczyszczania:

- frakcjonowanie roztworami soli (np. siarczanem amonu)

- ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi (np. etanolem, acetonem lub eterem).

Metody te opierają się na odciągnięciu wody z roztworów koloidalnych, jakie tworzą białka (w tym enzymy) ponieważ białka są cząsteczkami zawierającymi różne ilości gr kwas i zasad ich rozpuszczanie zależy od stęż soli, polarnosci i pH rozpuszczalnika i temp. Dlatego pewne białaka wypadają z roztworów, podczas gdy inne w tych samych warunkach nadal tworzą roztwór koloidalny (nie można doprowadzić do denaturacji bialka). Otrzymane osady białkowe oddziela się przez wirowanie lub filtracyjne. Następnie są oczyszczane za pomocą dializy.

1. 3 etap - chromatografia,

-elektroforeza, analityczne, diagnostyczne badanie metodą - bibułowa, żelowa, swobodna.

-ultrawirowanie, wykorzystuje znacznie wyższe przeciążenia (nawet powyżej 600 000 x g)

- krystalizacja w najczystszych jednorodnych białkach z roztworów już oczyszczonych poprzednimi metodami.

Duże znaczenie w procesach oczyszczania białek mają techniki elektroforetyczne. Podobnie jak metody chromatograficzne mają one zastosowanie w przypadku wykonywania badań analitycznych (np. określania stopnia czystości izolowanych enzymów) jak i badań preparatywnych, wykonywanych w celu oczyszczenia białka.

1. 4 etap kontrola

- jakościowej (wzrastająca czystość białka),

- ilościowej (badanie stężenia i/lub jego aktywności).

Kontrole jakościową wykonuje się wykorzystując techniki elektroforetyczne (zwłaszcza SDS-PAGE). Do oznaczania stężenia enzymów wykorzystywane są zazwyczaj techniki spektrofotometryczne, np. metoda Lowry'ego, metoda biuretowa. Oznaczanie aktywności enzymów wykonuje się w oparciu o ich zdolności katalityczne, badamy i porównujemy z wzorcem

Literatura:

1. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.): „Ćwiczenia z biochemii”, PWN Warszawa - Poznań 1982.

2. Stryer L.: „Biochemia”, PWN Warszawa 1986.

3. Dziuba J., Kostyra H.: „Biochemia żywności (metody, zadania i testy)”, Wydawnictwo UW-M w Olsztynie, Olsztyn 2000.

4. Kołakowski E., Bednarski W., Bielecki S. „Enzymatyczna modyfikacja składników żywności”, Akademia Rolnicza w Szczecinie, Szczecin 2005.

6

t [min]

x [g/50g]

t [min]

x [g/100g]

---