1. Kwasy nukleinowe (DNA, RNA)

• DNA - na terenie komórki występują głównie w jądrze, znacznie mniejsze ilości występują na terenie mitochondriów i plastydów. Zarówno DNA jądrowy, jak i występ. w strukt. cyt. jest źródłem inform. gen. w k-ce.

• RNA - występ. w jądrze (gł. na terenie jąderka) oraz cytoplazmie. RNA w k-ce służy do wykorzystania infor. zawartych w DNA dla biosyntezy białka.

Budowa nukleotydu

• zasady azotowe

• skład cukrowy

Struktura kwasów nukleinowych:

• struktura I rzędowa - podaje sekwencje nukleotydów w łańcuchu.

• struktura II rzędowa - podaje przestrzenne ukształtowanie cząsteczek.

Struktura I rzędowa i II rzędowa

Odwracalne topnienie dwuniciowej helisy.

Denaturacja zwana także „topnieniem” jest to separacja dwuniciowej helisy na dwie pojedyncze nici wskutek zerwania wiązań wodorowych pomiędzy niciami.

Denaturację otrzymujemy poprzez:

• ogrzewanie roztworu DNA

• zakwaszanie lub alkalizację roztworu DNA

Temperatura, w której dochodzi do utraty połowy helikalnej struktury jest nazywana temperatura topnienia (Tm).

Dwunicieniowa helisa jest strukturą wysoce kooperacyjną utrzymującą się dzięki działaniu wielu wiązań, wzmacniających struktury stabilizujące:

• tworzenie par zasad,

• asocjacja warstwowa zasad;

Hybrydyzacja kw. nukleinowych

• jest to zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasów nukleinowych

• po usunięciu czynnika denaturacji nici łączą się ponownie czyli ulegają reneturacji

• jeśli do takiej mieszaniny wprowadzi się obce nici kwasów nukleinowych oprócz wyjściowych cząsteczek powstają cząsteczki hybrydowe stąd nazwa hybrydyzacja.

• szybkość hybrydyzacji zależy m.in. od długości fragmentów kwasów nukleinowych, podobieństwa i różnorodności sekwencji w próbce poddanej hybrydyzacji.

Rodzaj	B-DNA	A-DNA	Z-DNA
Liczba par zasad przypadająca na skręt helisy	10,4	11	12
Kąt skręcania	+34,6	+39	-30
Skok (mm)	3,54	2,53	4,56
Kierunek	P	P	L
Średnica helisy	2,37	2,55	1,84

RNA

K-ki życiowe zawierają trzy podstawowe rodzaje RNA:

• informacyjny RNA - mRNA,

• przenośnikowy RNA - tRNA,

• rybosomalny RNA - rRNA;

Nazwy te wskazują na różne funkcje odpowiednich kwasów nukleinowych. Z chemicznego punktu widzenia te trzy rodzaje RNA różnią się przede wszystkim ciężarem cząsteczkowym i składem zasad.:

• rRNA - ma ciężar cząsteczkowy ok. 500 000 lub ok. 1 000 000,

• mRNa - kilkaset tys., a po względem zasad upodabniają się do nici DNA,

• tRNA - ma niższy ciężar cząsteczkowy 25 000 - 50 000;

Kod genetyczny

DNA przechowuje i wykorzystuje informacje. Funkcje te może spełniać dzięki swoim właściwościom:

• cząsteczki DNA mogą się powielać (replikacja) tzn. mogą powodować syntezę innych cząsteczek DNA identycznymi z cząsteczkami wyjściowymi;

• cząsteczki DNA mogą dokładnie i w sposób specyficzny kierować syntezą białek charakterystyczny dla określonego organizmu;

Replikacja

Rozdzielenie podwójnej nici powoduje odsłonięcie lepkich, pojedynczych nici, które mają tendencje do ponownego łączenia się, zapobiegają temu białka SSBs (single stand binding).

Nić helisy jest skręcona i to skręcenie się nasila w miarę przesuwania się kompleksu replikacyjnego. Rozwiązaniem jest działanie topoizomerazy, która nacina jedną z nici przepuszcza drugą przez powstałą przerwę i doprowadza do powtórnego złączenia.

Kopiowanie musi przebiegać w jednym kierunku od 5' do 3'.

• rozwiązaniem jest „normalna” replikacja w przypadku nici „wiodącej” odcinka replik. (fragmenty Okazaki) spóźniającej się nici DNA;

• helikaza - rozdziela starą podwójną nić DNA umożliwia przyłączenie się polimerazy DNA do nici pojedynczej;

• polimeraza DNA - odpowiedzialna jest za dokładanie komplementarnych zasad do starych nici DNA czyli powstawanie nowych;

• topoizomeraza - likwiduje naprężona powstałe w rozplątywanej podwójnej nici DNA poprzez nacinanie pojedynczych nici, co pozwala na ich przeplecenie, a następnie połączenie;

• primaza RNA - tworzy krótkie komplementarne odcinki RNA na spóźniającej się nici DNA, które służą za startery (primers) do syntezy fragmentów Okazaki ;

• ligaza DNA - łączy fragmenty Okazaki w ciągłą nową nić;

DNA stanowi matrycę, na której powstają cząsteczki mRNA, która jest nośnikiem informacji z jądra do ......

Sekwencje zasad w łańcuchu RNA różnią się od ich sekwencji w matrycy DNA.

W rybosomie każda grupa zasad łączy się.

Kolejność w jakiej przyłączone są cząsteczki tRNA tzw. sekwencje w jakiej aminokwasy są wbudowane w łańcuch białkowy zależy od sekwencji zasad w łańcuchu mRNA.

W ten sposób UCU jest charakterystyczne dla seryny, UAC dla tyrozyny, GUC dla waliny.

Proces biosyntezy białka zachodzący na rybosomach z wykorzystaniem informacji genetycznej zawartej w mRNA nazywamy translacją.

Tworzenie łańcuchów peptydowych wymaga udziału dwu białek;

• transferazy peptydowej biorącej udział w tworzeniu wiązań peptydowych;

• czynnika przemieszczającego (translokazy), który cząsteczki mRNA przesuwa o jeden kodon;

• takie zestawienie umożliwia wykonanie 64 możliwych kombinacji i wystarcza do określenia 20 aminokwasów

UAA - kodon stop.

Cechy kodu gen.;

• bezprzecinkowy - między 3 kodującymi na obcych elementach;

• niezachodzący - 3 nie zachodzą na siebie;

• zdegenerowany - poszczególne aminokwasy mogą być kodowane przez kilka 3, np. GUU, GUC, GUA, GUG - kodują walinę;

• uniwersalny - dla wszystkich organizmów te same triplety koduje te same aminokwasy;

• kolinearny - aminokwasy łączone w sposób określony przez kodony matrycy kolejność ułożenia trójek kodujących odpowiada kolejności kodowania aminokwasów

Odstępstwa od reguł:

• nakładanie się genów w małych wirusach (dany odcinek DNA może syntetyzować różne białka);

• wyznaczenie przez niektóre kodony innych aminokwasów w mitochondrialnym DNA i w niektórych pierwotniaków;

Mutacje genowe:

• mutacje genowe - są to zmiany normalnej sekwencji DNA organizmu spowodowane błędami w replikacji DNA

• mutacje spontaniczne lub działanie czynników chemicznych i fizycznych - mutacje indukowane;

• zachodzą w zygocie podziały w komórkach somatycznych i rozrodczych w ciągu dalszego życia;

• mutacje w komórkach somatycznych nie są przekazywane potomstwu;

• mutacje w komórkach rozrodczych mogą zostać przekazane potomstwu;

• mutacje somatyczne odgrywają dużą rolę w rozwoju noworodków;

Mutacje jako skutek braku naprawy replikacji DNA:

• mutacje powstają gdy do DNA wstawimy zestaw niekompletnych nukleotydów;

• jeśli niekompletny nukleotyd zostanie szybko ............

Mutacje spontaniczne:

• błędy replikacyjne,

• poślizg replikacyjny,

• powstawanie str. trzecio i czwartorzędowych.

Mutacje indukowane:

• mutageny chemiczne,

• wprowadzenie analogu zasady w miejscu występowania prawidłowej zasady w DNA,

• czynniki deaminujące zasady w helisie DNA,

• czynniki alkilujące w prawidłowo dodanej grupie alkilowej lub arylowej w nukleotydzie,

• czynniki interkalkujace - płaskie cząsteczki wnikające pomiędzy pary zasad w podwójnej helisie najczęściej mutacje typu insercji;

Mutacje fizyczne:

• promieniowanie jonizujące,

• promieniowanie ultrafioletowe UV,

• ciepło;

Mutacje jako skutek braku naprawy replikacji DNA;

Błąd replikacji powoduje powstanie niedopasowania nukleotydu (mismatch ) ale się on utrwali, powiela się dalej jako zmieniona ale komplementarna para nukleotydów.

Polimeraza DNA działa tak by nie popełnić błędów.

Poślizg replikacyjny

• gdy w DNA mamy cząsteczki powtórne tj. 2 CA polimeraz DNA dość często się ślizga i dodaje kolejną parę CA. Jest to poślizg replikacyjny.

• wynikiem jest mutacja zmiany fazy odczytu (powstaje przy ..... insercjach/ delecjach na trójkowych. Jest często bardzo szkodliwa, bo po punkcie zmienia się pozycja kodonu STOP

Rodzaje mutacji

1. Duże zmiany genu

• delecje - utrata części sekwencji DNA (α-talasemie, niedobór hormonu wzrostu, rodzinna hipercholesterolemia, dystrofia mięśniowa)

• duplikacje - powielane sekwencje DNA (rodzinna hipercholesterolemia, dystrofia mięśniowa)

• insercje - wbudowane dodatkowe sekwencje DNA (hemofilia, neurofibromatoza)

2. Mutacje punktowe

• insercje

• delecje

• translokacje

• transwersje

3. Mutacje transkrypcyjne

4. Mutacje translacyjne

5. Mutacje RNA

Efekt dużych zmian genu i mutacji punktowych

• mutacja missense (zmiana sensu) - zmiana nukleotydu w 1 lub 2 pozycjach kodonu powodująca zmianę kod. przez triplet aminokwasów

• mutacja neutralna (cicha) - nie powoduje zmiany kodowanego aminokwasu

Efekt mutacji

• mutacja transkrypcyjna - występuje w obszarze regulującym proces transkrypcji, efektem tych mutacji jest spadek produkcji białka

• mutacja RNA - zmieniają prawidłowe miejsca łączenia intronu i eksonu , w wyniku takiej mutacji może powstać niestabilnie szybko degradujące się RNA

• mutacja translacyjna

• mutacja nonsensu (stop) - w wyniku delecji lub insercji powstają przedwczesne dodatkowe stop

• mutacja zmiany ramki odczytu - delecja lub insercja w rejonie kodującym(nie będąca wielokrotnością 3 nukleotydów)

• mutacje dynamiczne - mutacje występujące tylko u człowieka, wykazują duże zmiany populacyjne

• mutacje polegające na wzroście liczby powtórzeń (3-,4-, 12-nukleotydów) - ilość powtórzeń może wzrastać w kolejnych pokoleniach, objawy mogą nasilać się lub wystąpić wcześnie w kolejnych pokoleniach (antycypacja)

• premutacja - wzrost ilości powtórzeń poniżej wartości granicznej - nie powoduje wystąpienia choroby 0- bezobjawowe nosicielstwo

Skutki mutacji genowych

• utrata funkcji - mutacja znosi lub zmniejsza aktywność białkową, większość tych mutacji jest recesywna, ale zdarzają się takie o charakterze dominującym

• nabycie funkcji - mutacja nadaje białku nietypową aktywność, mutacja tego typu występuje rzadziej i mają najczęściej charakter dominujący

Mutacja a funkcja białek

• mutacja bywa najbardziej szkodliwa gdy „trafia” w miejsca kodujące centra, aktywność enzymów lub promotor, mniej gdy w mniej ważny sposób obszaru eksonu, najmniej gdy w introny, chyba że uniemożliwia wycinanie tych ostatnich

II. Metody badań molekularnych

Enzymy restrykcyjne

• są to enzymy izolowane z bakterii, zdolne do rozpoznania specyficznych sekwencji w DNA z reguły są to sekwencje palindromowe, oraz do przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA w ściśle określonym miejscu w obrębie lub okolicy sekwencji rozpoznawalnej.

• otrzymane fragmenty DNA nie są losowe.

• różne enzymy rozpoznają odmienne sekwencje DNA, wyjątki izoschizomery - enzymy izolowane z różnych organizmów, ale rozpoznające te same sekwencje.

• nazewnictwo opiera się na literowych skrótach:

• pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii

• druga i trzecia od gatunku

• czwarta litera oznacza szczep lub typ

• kolejne enzymy z danego szczepu lub typu otrzymują cyfr rzymskie

• jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która trawi kompletnie 1 mg

Typ I

Wielopodjednostkowe kompleksy enzymatyczne zawierające aktywność metylazy i restryktazy . Przecinają DNA z dala od rozpoznawanej sekwencji, bliżej nieokreślonym miejscu. Z tego powodu nie mają większego zastosowania praktycznego.

Typ II

Przecinają DNA w zdefiniowanych miejscach w obszarze rozpoznanej sekwencji lub w jej pobliżu. Składa się z podjednostek polipeptydowych. Rozpoznaje sekwencje symetryczne.

Typ IIs

Zbliżone do typu II, przecinają z jednej strony rozpoznawanej sekwencji, która jest asymetryczna

Typ III

rozpoznaje dwie sekwencje nukleotydów w pobliżu siebie i dopiero wtedy dochodzi do cięcia, bez znaczenia praktycznego, za duże wymagania

Typ IV

zbliżony do typu II, zawiera aktywność metylazy, peptydazy (nie mogą działać jednocześnie), przycinają w zdefiniowanym obszarze poza sekwencją rozpoznawalną, enzym przyłącza się w zależności od substratu

Enzymy restrykcyjne rozpoznają tą samą sekwencję DNA, a przecinające DNA w odmiennych miejscach nazywamy neoschizomerami

Enzymy restrykcyjne różniące się sekwencją swojego polipeptydu i pochodzące z odmiennych organizmów, a rozpoznające tą samą sekwencję DNA i przecinające DNA w takim samym miejscu nazywamy izoschizomerami. Interesującą własnością izoschizomerów jest to, że pomimo tej samej specyficzności substratowej z reguły mają zupełnie odmienną strukturę trzeciorzędową co wskazuje na ich osobne pochodzenie ewolucyjne

Podział enzymów restrykcyjnych wg rodzaju wytwarzanych końców.

• tępe końce - nici rozcięte naprzeciwko siebie, wszystkie nukleotydy są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu

• lepkie końce - 3' lub 5' ssDNA - ogony na obu końcach utworzone przez niesymetryczne cięcie.

Końce te są komplementarne do podobnych tworzonych w innych.

Zastosowanie:

• konstrukcja map restrykcyjnych. Mapa restrykcyjna to obraz cząsteczki DNA na którym zaznaczone sa miejsca rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w nukleotydach.

• klonowanie i obróbka DNA

• badanie polimorficzne miejsc restrykcyjnych RFLP

Ligazy - trwale łączą pocięte fragmenty

Główne kierunki analizy DNA

Genomy DNA

↓ ↓

Amplifikacja DNA hybrydyzacja molekularna

↓ ↓

amplifikacja in vitro - southern Blot

PCR - northern Blot

• dot Blot

• DNA fingerprint

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

• metoda badań oparta na zdolności tworzenia kompleksu dwuniciowego przez jednoniciowe fragmenty kwasów nukleinowych

• polega na wzajemnym oddziaływanie pomiędzy badanym fragmentem kwasów nukleinowych a sondą molekularną, która prowadzi do wytworzenia hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze

• w przypadku dwuniciowego fragmentu kwasu nukleinowego tworzenie hybrydu poprzedzone jest denaturacją pod wpływem działania zasad lub wysokich temperatur

• proces łączenia sondy molekularnej z fragmentem docelowym kwasu nukleinowego jest wysoce specyficzny i zachodzi zgodnie z zasadą komplementarności

• odpowiednio przygotowana sonda molekularna w optymalnych warunkach rozpoznaje sekwencje różniące się zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe kompleksy

• badany kwas nukleinowy może być denaturowany i unieruchomiony w filtrach, a następnie poddawany procesowi identyfikacji za pomocą znakowanej radioaktywnie lub nieradioaktywnie sondy molekularnej

Tm- jest to tzw. odwracalny punkt topnienia - temperatury przy której istnieje równowaga dynamiczna pomiędzy hybrydami rozpadającymi się w wyniku denaturacji i tworzącymi się w wyniku renaturacji

• ze statycznego punktu widzenia w tej temperaturze 50% hybryd ulega rozpadowi

• Tm zależy od wielu czynników: stężenia jonów Na⁺, liczby par zasad G-C, długości hybrydy, stężenia formamidu lub mocznika

Kompleksy:

• DNA - DNA (gdy sonda wyznaczony ssDNA)

• DNA - RNA

• RNA-RNA

Sondy molekularne

• w analityce molekularnej wykorzystuje się sondy oligonukleotydowe pochodzenia naturalnego (kilkaset nukleotydów), które można otrzymać przez określone zabiegi molekularne (zwykle o długości 10-50 nukleotydów)

Zalety sond syntetycznych

• stosunkowo łatwa dostępność

• możliwość dowolnego programowania sekwencji sond

• nie ma potrzeby denaturacji, gdyż sonda jest jednonicowa

• krótki czas hybrydyzacji

• wysoka selektywność

Znakowana najczęściej wykonuje się poprzez wprowadzenie radioizotopu w miejsce niepromieniotwórczych at. fosforu

W korzystaniu z tego typu sond metodą wykrywania utworzonych struktur hybrydy jest bezpośrednia autoradiografia.

Powszechnie stosuje się również techniki niepromieniotwórczego znakowania sond molekularnych polegające na dołączeniu biotyny lub oligoksygeniny w procesach dwustopniowych

Hybrydyzacja Southern

• hybrydyzacja mająca na celu identyfikację określonego fragmentu DNA

• najczęściej dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA

Etapy:

1. Izolacja i oczyszczenie DNA z komórek lub tkanek

2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami

3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA wg wielkości i ich denaturacja in situ

4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy

5. Związane DNA z filtrem w temperaturze 80^oC lub poprzez naświetlania UV

6. Hybrydyzacja z sondą

7. Ustalenie położenia fragmentów do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii reakcji barwnych lub fluoroscencji

Zastosowanie H. S. umożliwia:

• wykrycie rearażacji genowych (np. delecje, insercje większych niż 50 p.z.)

• badanie polimorfizmu dł. fragmentów restrykcyjnych DNA RFLP

Polimorfizm może mieć charakter naturalny lub może ustąpić w wyniku zmian mutacyjnych w DNA, które powodują zanikanie bądź pojawienia się miejsc restrykcyjnych

Analiza RFLP wykorzystywana jest m.in. w badaniach dziedzicznie uwarunkowanych chorób jak również w wykrywaniu mutacji somatycznych w badaniach genetycznych.

Hybrydyzacja Northern

Jest to metoda służąca detekcji kwasów rybonukleinowych (RNA). Najczęściej stosuje się ją do badania aktywności określonych genów (badanie ekspresji genu).

Metodyka zbliżona jest do hybrydyzacji Southern

• rozdział elektroforetyczny RNA na żelu w warunkach denaturujących

• przeniesienie RNA na odpowiednią membranę

• utrwalenie RNA na membranie

• hybrydyzacja RNA z sondą

• odpłukanie nadmiaru sondy

Sonda daje sygnał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA

DNA- fingerprinting

• metoda oparta na hybrydyzacji Southerna

• opracowana w 1984 r. przez Brytyjczyka Aleca Jeffreysa

• polega na izolowaniu i sporządzaniu fragmentów DNA

• wykorzystuje obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtórzonych WNTR (variable number of tandem repeats) zmienna liczba tandemowych powtórzeń.

Występujących w eukariotycznym DNA sekwencji powtórzonych cechujących się dużą zmiennością, nadaje DNA poszczególne osobnicze cechy indywidualne

Metodyka

• trawienie wyizolowanego DNA odp. enzymów restrykcyjnych, które tną kwasy nukleinowe w specyficznych miejscach

Zastosowanie:

• badania medyczno-sądowe

• ustalenie ojcostwa

Więcej niż jeden prążek niezidentyfikowany - wykluczenie

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy

• należy do najczęściej stosowanych technik biologii molekularnej

• w znaczny sposób przyspieszyła uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów

• umożliwia specyficzną amplifikację in vitro wybranych odcinków DNA i RNA

• charakteryzujący się wysoką czułością

Założenie reakcji

1. technika enzymatycznej amplifikacji określonej sekwencji DNA

2. specyficzność reakcji zapewniają 2 startery komplementarne do sekwencji docelowej

3. czułość reakcji pozwala amplifikować DNA pojedynczych genów ponad 1: 000 000 razy mimo obecności innych sekwencji

4. możliwość amplifikacji pojedynczych matryc

Przebieg reakcji

Cykle reakcji PCR

1. Denaturacja wstępna - 92 - 95 ^oC

2. Cykle (25-35)

denaturacja - 92-95 ^oC

wiązanie starterów - 40-62 ^oC

synteza - 68-72 ^oC

3. synteza końcowa - 68-72 ^oC

4. przechowywanie 4 ^oC

Skład mieszaniny reakcyjnej

1. matryca DNA, RNA

2. startery

3. dNTP

4. MgCl₂

5. polimeraza Tag

6. bufor

Analiza produktów PCR

1. elektroforeza w żelach agarozowych

• barwienie bromkiem etydyny

• autoradiografia

2. elektroforeza w żelach poliakryloamidowych

• barwienie bromkiem etydyny, srebrzenie

• autoradiografia, fluorografia

Główne zastosowanie

Klonowanie - YAC, BAC, produkty PCR

Hybrydyzacja - klony cDNA, produkty PCR

Amplifikacja - PCR, RT-PCR, PCR-multipleks, RFLP-PCR, Reel-time PCR, nasted-PCR, RAPD-PCR, RACE PCR, ASA-PCR, cometitive PCR

Sekwencjonowanie - klony genomowe i cDNA, produkty PCR

RT-PCR

• matrycą wyjściową jest RNA , które w procesie odwrotnej transkrypcji jest przepisywane na komplementarne DNA (cDNA)

• następnie cDNA ulega amplifikacji jak w zwykłym PCR

• zastosowanie badanie ekspresji genów

PCR-multipleks

• metoda polega na jednoczesnej amplifikacji kilku fragmentów DNA, różniących się wielkością co w praktyce polega na użyciu w jednej mieszaninie reakcyjnej kilku par starterów

• zastosowanie - jednocześnie amplifikujemy kilka regionów jednego lub kilku genów, w jednej reakcji uzyskać można nawet 13 amplikanów

PCR-RFLP

• połączenie reakcji PCR z analizą restrykcyjną,

• produkty amplifikacji poddaje się działaniu enzymów restrykcyjnych i porównuje się wzór powstałych prążków

• zastosowanie - wykrywanie znanych mutacji/polimorfizmów, analiza bezpośrednia - mutacje, analiza pośrednia - polimorfizmy

Reel-time PCR

• metoda ilościowa pozwalająca na obserwowanie amplifikacji w czasie rzeczywistym

• wraz z przybywaniem produktów PCR wzrasta intensywność fluorescencji rejestrowanej przez detektor

• odzwierciedlone jest to w postaci wykresu na monitorze komputera

• zastosowanie - pomiar liczby cząsteczek wirusów lub bakterii w materiałach klinicznych, umożliwia monitorowanie postępów leczenia(określenie wyjściowego poziomu wiremii lub bakteremii jest wskazaniem koniecznym

ASA-PCR

• technika umożliwiająca wykrycie mutacji przy pomocy specyficznych oligonukleotydów

• oprócz starterów flankujących stosuje się starter w pełni komplementarny do allela z mutacją lub startery z których 1 jest w pełni komplementarny do allela z mutacją a drugi do allela niezmutowanego

• startery są tak zlokalizowane, ze w wyniku PCR powstają produkty różniące się długością w zależności od genotypu użytej próbki DNA

• zastosowanie - wykrywanie znanych mutacji

III. Dziedziczenie mendlowskie

Cele analizy genetycznej

Uwarunkowania dobrostanu ciąży

• Ocena ryzyka występowania u płodu

• chorób uwarunkowane genetycznie

• wad rozwojowych

• wyodrębnienie ciąż wysokiego ryzyka, rozpoznania patologii genetycznej, współudział w kształtowaniu dalszych decyzji diagnostycznych i leczniczych

• określenie ryzyka genetycznego dla następnej ciąży

Ryzyko genetyczne:

• jest oceniane jako prawdopodobieństwo występowania zdefiniowanych zaburzeń

• powinno być oceniane ilościowo

• dotyczy zawsze określonej pary

Małe <5% teoretycznie wyliczone z praw Mendla dla chorób jednogenowych

Średnie 5-10% rodzinnych abberacji strukturalnych chromosomowych zmodyfikowane j.w. z uwzględnieniem dodatkowych poprawek

Duże >10% empiryczne z obserwacji populacji dla chorób wielogenowych, abberacji liczbowych chromosomowych, zespoły wad

Techniki diagnostyki genetycznej

• analiza rodowodowo - kliniczna

• analiza fenotypu

• analizy laboratoryjne

• diagnostyka cytogenetyczna

• diagnostyka molekularna DNA i RNA

• diagnostyka biochemiczna

Analiza rodowodowo- kliniczna:

• dane o zachorowaniach, utrata ciąż, niepłodność w zakresie wszystkich krewnych 1^o wsparte dokumentacją lekarską,

• weryfikacja charak. dziedziczenia niekiedy może być nietypowy w określonej dziedzinie

• taki sam fenotyp może wynikać z różnych uwarunkowań

• zapis symboliczny umożliwia lepszą orientację w uwarunkowaniach

Dziedziczenie autosomalne dominujące i recesywne wg Mc Kusicka z roku 2000 - 11 000 chorób monogenowych

• 10671 cech zlokalizowanych na autosomach

• 624 na chromosomie X

• cechy monogenowe - cechy mendlowskie

• zasady segregacji

• zasady niezależnego doboru

Zasady Mendla:

zasada segregacji - organizmy rozmnażające się w sposób płciowy posiadają geny, które występują parami, ale tylko jeden …..

Prawdopodobieństwo:

Genotyp- gen

Fenotyp - rzeczywisty obraz fizyczny lub kliniczny danej jednostki , jest wynikiem współdziałania pomiędzy genot. i czynnikami środowiska

Rodowód - określa związki pomiędzy członkami rodziny i pokazuje, którzy z nich są dotknięci chorobą , a którzy nie

Dziedziczenie autosomalne dominujące

• 1/200 osób

• chory rodzic może przekazać swoim dzieciom gen „zdrowy” lub „chory”

• potomstwo1/2

• osobnicy obu płci wykazuje cechy chorobowe w różnych proporcjach

• dana cecha pojawia się w każdym pokoleniu (pionowy schemat przekazywania choroby)

• chora heterozygota przekazuje cechę połowie swoich dzieci

• niepełna penetracja genowa (100% penetracji - achondroplazja)

• choroba jednogenowa autosomalnie dominujące

Dziedziczenie autosomalne recesywne

• rodzice osób chorych na choroby recesywne to heterozygotyczni nosiciele

• 1/4 potomstwa będzie zdrowymi homozygotami, 1/2 fenotypowo zdrowymi heterozygotami, 1/4 homozygotami, u których występuje choroba

• choroba występuje u jednego lub kilku członków rodzeństwa, ale nie we wcześniejszych pokoleniach

• mężczyźni i kobiety chorują w równym proporcjach

• średnio 1/4 potomstwa dwóch heterozygotycznych nosicieli będzie dotkniętych chorobą

• najczęściej choroba ujawnia się w związkach pokrewieństwa (większe prawdopodobieństwo wspólnych genów)

Choroby sprzężone z chromosomem X

Nietypowe choroby jednogenowe

• choroby sprzężone z chromosomem Y, tylko w linii męskiej, defekty spermatogenezy

• mutacje genomu mitochondrialnego dziedziczenie matczyne

• mutacje dynamiczne, antycypacja - mutacja w każdym następnym pokoleniu będzie nasilona i szybciej występować

• fenyloketonuria

• choroba Huntingtona (14p16.3)

• Zespół Retta (gen MECP2 na Xq)

• dystrofia mięśniowa

IV. Problemy teratogenezy w genetyce klinicznej

Wszystkie organizmy żywe są narażone na działanie czynników mutagennych:

• endogennych (produkowanych w toku procesów metalicznych , np. wolne rodniki, tlenki azotu)

• egzogennych ( pochodzenia środowiskowego:

• biologiczne, np.wirusy

• chemiczne, np. Benzen,

• fizyczne, np. promieniowanie jonizujących

Czynniki mutagenne indukują zmiany w genomie, które można obserwować na wszystkich poziomach jego organizacji: chromosomów, genów i nukleotydów. Teoretyczna częstość samoistnych mutacji wynosi dla jednej generacji komórek ok.. 10^-7 mutacji na gen. Istnieją mutageny, które zwiększają częstość mutacji ponad 1000 - krotnie Większość uszkodzeń DNA zostaje usunięta za pomocą systemów reperacyjnych komórek. Jeśli uszkodzenie DNA nie zostanie usunięte, zmiana genetyczna może zostać utrwalona w postaci mutacji.

Konsekwencje biologiczne mutacji:

• dotyczą pojedynczej komórki lub

• dotyczą całego organizmu

Komórki z uszkodzonym DNA mogą wejść w cykl podziałowy, co prowadzi do powstania linii komórek, zawierających mutację.

Mutacja może spowodować:

• zahamowanie cyklu komórkowego „komórka drzemiąca”, która ponownie może wejść w podziały po zadziałaniu kolejnych czynników mutagennych (promotorów np. pobudzających proliferację komórek)

Zmiana informacji genetycznej może doprowadzić do zaburzenia podstawowych funkcji życiowych komórki, tak że będzie przyczyną jej śmierci.

W odniesieniu do całego organizmu biologiczne działanie czynników mutagennych może wyrażać się:

• mutagenezą (mutacje komórek rozrodczych)

• kancerogenezą (transformacja nowotworowa)

• teratogenezą (indukcja wad wrodzonych)

Skutki biologiczne zależą od typu komórek, które zostały uszkodzone (komórki płciowe lub somatyczne)

• komórki płciowe:

• obniżenie płodności

• lub mutacje będą zawierały wszystkie komórki płodu (jeżeli komórka z mutacją weźmie udział w procesie zapłodnienia)

• prowadzi do:

• poronienie

• urodzenie dziecka z aberracjami chromosomowymi

• lub zespołem uwarunkowanym mutacją pojedynczego genu

• lub z chorobą nowotworową

Mutacja w komórkach somatycznych (zmiana będzie się powtarzała jedynie w linii komórek wywodzących się z nieprawidłowej komórki):

• okres prenatalny

* przed ->

* w trakcie ->

* po organogenezie -> teratogeneza

• okres postnatalny (wpływ rakotwórczy)-> indukcja transformacji nowotworowej

Mutacje komórek rozrodczych - mutageneza

• dziedziczne wady wrodzone lub/i nowotworów

Mutacje komórek somatycznych - kancerogeneza

• inicjacja (pierwsza zmiana, zwykle genetyczna, zapoczątkowująca proces transformacji

• promocja (etap proliferacji pierwotnie uszkodzonej komórki)

• progresja (nabycie przez linie komórek cech nowotworu złośliwego)

Proces transformacji nowotworowej wynika z kumulacji zmian:

• genetycznych np. mutacje punktowe, delecje, amplifikacje, mutacje liczby i struktury chromosomów) w trzech grupach genów: protoonkogenach, genach supresorowych i mutatorowych

• epigentycznych np. regulacja ekspresji genów kontrolujących cykl komórkowy, różnicowanie komórek i ich adhezyjność

Wszystkie czynniki indukujące zmiany informacji genetycznej, zarówno poprzez bezpośredni wpływ na sekwencję DNA (działanie genotoksyczne), jak i epigenetyczną regulację ich funkcji, mogą być czynnikami rakotwórczymi

Zależność pomiędzy wielkością narażenia a ryzykiem indukcji procesu nowotworowego jest bezprogowa i liniowa.

Ryzyko transformacji nowotworowej występuje przy każdym narażeniu na działanie czynników mutagennych. NIE MA DAWKI BEZPIECZNEJ !

Nie obserwuje się zależności pomiędzy wielkością narażenia a ciężkością przebiegu choroby. Wraz ze wzrostem wielkości narażenia wzrasta częstość występowania choroby nowotworowej w populacji narażonych.

Mutacje komórek somatycznych

Teratogen - każdy czynnik uszkadzający rozwijający się zarodek lub płód, prowadzący do wystąpienia wad wrodzonych

Mechanizm:

• zaburzenie podziałów i funkcji komórek w trakcie życia płodowego, co prowadzi do zaburzenia procesów tworzenia się i rozwoju narządów u płodu

Efekt teratogenny jest skutkiem zaburzeń dotyczących wielu komórek, wynikającym z uszkodzenia DNA lub innych molekuł

W efekcie:

• zmiana ekspresji genów

• zaburzenia apoptozy

• zaburzeń migracji i/lub proliferacji komórek

• zaburzeń syntezy lub/i funkcji białek komórkowych

• oraz zaburzeń produkcji energii

Wady wrodzone, indukowane działaniem czynników teratogennych mogą być zmianami:

• anatomicznymi (dysplazje, malformacje, deformacje, dystrupcje)

• funkcjonalnymi (ślepota, głuchota, upośledzenie rozwoju umysłowego)

Przykład
Talidomid fokomelia (brak rozwoju kończyn górnych/lub i dolnych) poprzez prawidłowego zaburzenie ukrwienia rozwijających się kończyn

• IGF-I (insulin -like growth factor I) insulinopodobny czynnik wzrostu

• FGF -2 (fibroblast growth factor) czynnik wzrostu fibroblastów 2

regulacja transkrypcji podjednostek av i ß3 integryn stymuluje angiogenezę w rozwijających się kończynach

Sekwencje promotorowe genów IGF -1 i FGF - 2 oraz av i ß3 nie posiadają sekwencji TATA , ale sekwencje powtarzalne CG

Talidomid lub jego aktywny biologicznie produkt jego degradacji łącza się z sekwencjami powtarzalnymi regionów promotorowych-> obniżenie aktywności transkrypcyjnej genów-> zahamowanie angiogenezy ->zahamowanie rozwoju kończyn

Kwas retinoidowy - reguluje rozwój szkieletu poprzez:

• jądrowe receptory hormonów

• RARs (retinoic acid receptors) receptor kwasów retinoidowych

• RXRs (retinoid - X - receptors) retinoidowe receptory X

Zaburzenia RARs zahamowanie procesu tworzenia chrząstek zaburzenie różnicowania chondroblastów

Nikotyna wzrost ekspresji onkogenu c-fos ->indukcja apoptozy w prawidłowych komórkach -> zaburzenie procesu różnicowania komórek neuronalnych

Przykłady wad wrodzonych wywołanych przez teratogeny swoiste

Toxoplazmoza - wady OUN, zapalenie naczyniówki, małogłowie, zwapnienia śródczaszkowe, upośledzenie umysłowe

Różyczka - małogłowie, żółtaczka, hepatosplenomegalia, zaćma, ślepota, głuchota, upośledzenie umysłowe, wady serca i mózgu

Ospa wietrzna, półpasiec - wady kończyn, zaniki kory mózgowej, opóźnienie rozwoju umysłowego

Alkohol etylowy - dystrofia wewnątrzmaciczna, cechy dysmorficzne twarzoczaszki, wady serca, mózgu, zaburzenia

zachowania, upośledzenie umysłowe

Warfaryna - wady OUN, niedorozwój twarzoczaszki, uszkodzenia nasad kości

Talidomid - niedorowój kończyn do całkowitego braku ich wykształcenia, wady twarzy

Pochodne witaminy A - wady mózgu, wady serca, zaburzenia rozwoju twarzoczaszki

Przykłady zespołów AR, charakteryzujących się występowaniem wad wrodzonych i skłonnością do rozwoju nowotworów (wg OMIM)

Ataksja - Teleangiektazja (mutacje ATM, niestabilność chromosomowa) - Ataksja (1-3rż) naczyniaki w obrębie skóry, i oczu, (6rż) podwyższony poziom a-fetoproteiny białczki, chłoniaki, niedobory immunologiczne, nadwrażliwość na promieniowanie jonizujące

Zespół Blooma (mutacje BLM, niestabilność chromosomowa) - karłowatość z zachowaniem proporcji ciała, cechy dysmorficzne twarzoczaszki, nadwrażliwość skóry na światło słoneczne, obszary hipo i hiperpigmentacji, cukrzyca, nieplodność u mężczyzn, nowotwory

Zespół Nijmegen (mutacja NBS, niestabilność chromosomowa) - małogłowie, cechy dysmorficzne twarzoczaszki,, nawracające infekcje, bielactwo, nowotwory, dysfunkcja gonad

Anemia Fanconiego (mutacje różnych genów, nadwrażliwość chromosomów na związki indukujące wiązania poprzeczne) - malformacje układu kostnego, żołądkowo-jelitowego, OUC,.Niedokrwistość aplastyczna, biaałaczki. Duża zmienność ekspresji objawów klinicznych

Efekt dawki

• działają po przekroczeniu „dawki progowej”

• wzrost narażenia wzrost wystąpienia efektu teratogennego wzrost ciężkości uszkodzenia płodu

Ryzyko efektu teratogennego większe przy narażeniu przewlekłym (nawet w niskiej dawce)niż w przypadku jednorazowej ekspozycji teratogenu o wysokim stężeniu

Swoistość czynników teratogennych - zależy od okresu ciąży

• genopatie - czynnik mutagenny działa na komórki rozrodcze przed zapłodnieniem prowadząc do powstania mutacji

• blastopatie - uszkodzenie zapłodnionej komórki jajowej doszło w okresie do 14 dnia po zapłodnieniu („wszystko albo nic”)

• embriopatie - wady powstały w okresie działania czynnika uszkadzającego między 14 a 60 dniem po zapłodnieniu

• fetopatie - wady indukowane działaniem czynników po 60 dniu od zapłodnienia

Różne związki uszkadzające komórki rozwijającego się płodu w tym samym okresie ciąży, będą prowadziły do podobnych skutków klinicznych. Ten sam czynnik działając w różnych okresach życia płodowego , będzie wywoływał różne konsekwencje

Po organogenezie (po 60 dniu od zapłodnienia)

• szybkie różnicowanie się komórek

• proliferacja i migracji

• śmierć płodu

• zaburzenia funkcjonalne

• upośledzony wzrost

• dysfunkcja OUN

Efekt teratogenny skutki:

• zaburzenia rozrodu

• poronienia

• opóźnienie rozwoju płodowego

• porody przedwczesne

• zwiększona śmiertelność noworodków

W większości przypadków niespecyficznych wad lub zespołów wad wrodzonych, trudno jest określić czynnik etiologiczny

Etiologia wad wrodzonych

Indywidualne zróżnicowana wrażliwość na działanie teratogenów

• indywidualna podatność

• zależy od genotypu matki

• od genotypu dziecka

Warunkujących polimorfizm czynnościowy białek biorących udział w procesach:

• transportu łożyskowego

• absorpcja i dystrybucja

• metabolizm teratogenów chemicznych

• sprawności mechanizmów naprawy DNA (w wielu zespołach dziedzicznie uwarunkowanych zaburzeń naprawy DNA występują wady wrodzone)

V. Cytogenetyka klasyczna

• kariotyp konstytucyjny

• kariotyp nabyty (w białaczkach)

Wskazania do analizy kariotypu konstytucyjnego

• cechy fenotypowe - zespół genetyczny

• wady rozwojowe, cechy dysmorfii wraz z upośledzeniem umysłowym

• niepowodzenia rozrodu

• ≥ 2 poronień samoistnych

• urodzenie dzieci z wadami o nieznanej etiologii

• niepłodność o nieznanej etiologii

• brak cech dojrzewania płciowego

• pierwotny lub wtórny brak miesiączki

• niskorosłość

• nieprawidłowa budowa zewnętrznych narządów płciowych

• nosicielstwo aberracji strukturalnych w rodzinie

• ocena płci genetycznej

• badania prenatalne

• wiek matki ≥ 35 rż.

• jeśli wystąpiła już aneuploidia u dziecka z poprzedniej ciąży

• obecność aberracji u jednego z rodziców

• podejrzenie wystąpienia zespołu o genetycznie uwarunkowanej niestabilności chromosomów: zespół Blooma, anemia Fanconiego, ataxia teleangiektazja, zespół Nijmogen

• zespół kruchego chromosomu X

Zasady hodowli komórkowych

Badania cytogenetyczne

Wyróżniamy następujące etapy:

• pobranie materiału

• założenie hodowli komórkowej

• zatrzymanie komórek w stadium metafazy

• zakończenie hodowli komórkowej

• sporządzenie preparatów

• „dojrzewanie preparatów”

• analiza mikroskopowa

• zapisanie wyniku zgodnie z ISCN

Rodzaj materiału:

• krew obwodowa

• fibroblasty - genotyp ≠ fenotyp i mozaicyzm komórek

• komórki kosmówki - 8-11 tydzień, oczyścić z tk. matczynej

• amniocyty - komórki płodu pochodzące z owodni

• skóra, układ moczowy

• amnioskopia wczesna 11-14 tydzień

• amnioskopia późna 15-17 tydzień

• szpik kostny

• węzeł chłonny

• komórki guzów litych: płyny wysiękowe, fragmenty tkanki guza, biopsja guza

• mechaniczne rozdrobnienie - kolageneza

• pierwotna zawiesina - założenie hodowli komórek

Materiał pobrać jałowo - na heparynę litową - dobrze wymieszać, żeby nie było skrzepów i w ciągu 24h dostarczyć do laboratorium cytogenetycznego w temperaturze pokojowej lub w +4^oC

Zakładanie hodowli komórkowej z krwi:

• hodowle limfocytów T przez 72 h

• podłoże hodowlane + 20 % FCS + antybiotyki + LF-7 (stymulator podziałów) + materiał badany w ilości 1-3×10⁶ komórek /ml

Warunki hodowli komórkowej

• inkubatory hodowlane

• warunki jałowe

• temperatura 37 ^oC

• 5% zawartości CO₂

Uzyskiwanie płytek metafazalnych (kolchicyna)

Zakończenie hodowli komórkowej

• szok hipotoniczny w 0,075 M KCl

• utrwalanie mieszaniną metanol : lodowaty kwas octowy 3:1

Sporządzanie preparatów

• komórki zawieszane w utrwalaczu nakrapia się na szkiełka podstawowe

• materiał schnie w temperaturze pokojowej

• dojrzewanie preparatów odbywa się na płycie ... i temperaturze

Metody barwienia chromosomów

• GTG (prążki G, trypsyna, Giemsa) - najczęściej stos. do oceny kariotypu ,tą metodą uzyskuje się 300-400 prążków ciemnych i jasnych charakterystyczne dla każdej pary chrom. Prążki ciemne zawierają skondensowaną chromatynę = heterochromatynę (dostęp trypsyny do niej jest utrudniony), bogatą w pary zasad A-T, zawierającą stos. mało aktywnych genów. Jest to obszar wolnoreplikujący (replikuje się późno w fazie S) Prążki jasne zawierają euchromatynę, 80% aktywnych genów, dużo par C-G, obszary te replikują się wcześnie. Aby widoczne były mutacje musi być min. 400 prążków na kariotyp. W profazie i prometafazie rozdzielczość jest max.(występuje Ok. 500-850 prążków na kariotyp-możliwe jest stwierdzenie mikromutacji).

• GTW (pr.G, trypsyna, b.Wrighta)

• RHG (pr.R, hydroliza na ciepło, Giemsa) - prążki barwią się na odwrót niż w GTG, metoda ta może być użyteczna w badaniu aberracji w regionach telomerowych.

• CBG (prążki C, Ba(OH)2, Giemsa) - Ba(OH)2 wiąże się z heterochromatyną konstytucyjną (występuje ona w centromerach wszystkich chromosomów, w okolicach satelitarnych chromosomów akrocentrycznych-13,14,15,21,22, na końcu ramienia długiego chromosomu Y); dotyczy chromosómów 1,9,16

• QFQ (pr.Q, fluorochrom, quinakryna) - wybarwiają się okolica centromeru chromosomu 3, okolica centromeru i regionu satelitarnego chromosomów akrocentrycznych 13, 14, 15, 21, 22 oraz odcinki dystalnej ramion długich chromosomu Y

• DAPI

• Ag-NOR organizatory jąderkowe traktowane azotanem srebra; stosowane przy białaczkach, bo występuje duża proliferacja i duże organizatory jąderkowe

• Technika GTG - jeden chromosom z pary jest dłuższy i ma mniejszą odległości między prążkami (osoba zdrowa). Przy chromosomie 1, 9, 16 i akrocentrycznych może dojść do bloku heterochromatyny i wtedy należy wykonać CBG.

guinakryna

Kariogram - nie ułożone chromosomy

Kariotyp - uporządkowane chromosomy

Liczba analizowanych komórek

• ≥ 10-20 nieprawidłowych metafaz

• ≥ 20-25 prawidłowych metafaz

• 50-100 mozaicyzm komórkowy

• wynik zgodny z ISCN 2005

Cytogenetyka klasyczna w hematoonkologii

• pełni funkcję diagnostyczną - znane są specyficzne aberracje dla danych typów białaczek

• pełni funkcję prognostyczną - wykrycie danej aberracji,często jest związana z wyborem odpowiedniego leczenia (łagodne v. agresywne) z prawdopodobnym czasem przeżycia

• różnicujące niektóre typy białaczek np. Ph (+) - CMI, a nie MPS; t(1;19) - ALL, a nie AML itd.

• pozwala na monitorowanie wielkości klonu nowotworowego szpiku, jako wskaźnik odpowiedzi na leczenie

• Grupy chromosomów:

• A - 1, 2, 3 - duże metacentryczne

• B - 4, 5 - duże submetacentryczne

• C - 6 - 12, X - średnie submetacentryczne

• D - 13 - 15 - duże akrocentryczne

• E - 16 - 18 - małe submetacentryczne

• F - 19 - 20 - najmniejsze submetacentryczne

• G - 21 - 22, Y - małe akrocentryczne

• Chromosom Y- heterochromatyna w długich ramionach

VII. Fluoroscencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)

• technika cytogenetyki molekularnej - łączy w sobie elementy cytogenetyki klasycznej i metod molekularnych

• zasada metody - hybrydyzacja

• polega na tworzeniu dwuniciowych kompleksów między sondą molekularną a badanym jednoniciowym fragmentem DNA

• wiążą się one zgodnie z zasadą komplementarności

• w metodzie FISH sondy znakowane są fluorochromami

Etapy hybrydyzacji:

• sporządzanie i wyznakowanie sondy

• przygotowanie preparatu

• denaturacja sondy i preparat

• hybrydyzacja

Sonda molekularna

• fragment DNA, którego sekwencja nukleotydów jest specyficzna względem badanego regionu

Sondą może być:

• syntetyczny lub naturalny gen lub jego fragment

• syntetyczny oligonukleotyd

• cDNA

• fragmenty chromosomów

• całe chromosomy

Metody otrzymywania sond:

• klonowanie odpowiedniego fragmentu DNA

• synteza chemiczna (oligonukleotydy o długości 20-50 pz.)

• sondy złożone otrzymuje się przez klonowanie całego chromosomu, tnie się go enzymami restrykcyjnymi, prowadzi elektroforezę, denaturację, wszystkie fragmenty znakuje się tym samym fluorochromem.

Fluorochromy	Długość fali wzbudzania	Długość fali max emisji	kolor
FITC	495	515	Zielony
Rodamina	550	575	Czerwony
Czerwień texas	595	615	Czerwony
DAPI	350	450	niebieski
Cyjamina CyI	550	570	pomarańczowy
TRIC	575	600	czerwony

FISH interfazalny i metafazalny

• przygotowanie preparatów

• materiał do hodowli komórek lub rozmaz krwi lub szpiku musi być utrwalony

• szkiełka odtłuszczone

• chromosomy nie mogą być w cytoplazmie - utrudniona penetracja sondy

• materiał nie może być zbyt gęsto i zbyt rzadko naniesiony na szkiełko

1. Nałożenie materiału na szkiełko (odwodnienie szkiełka w szeregu etanolu 70%, 80%, 90% przez 2 minuty w każdym)

2. Nałożenie odpowiedniej sondy molekularnej ogrzanej do temperatury 37^oC

3. Zaklejeniem szkiełka klejem silikonowym

4. Denaturacja materiału badanego i sondy (termiczna, chemiczna, prom. UV)

5. Hybrydyzacja (w komorze wilgotnej 37^oC, 12h, w ciemności)

6. Odpłukanie niespecyficznie związanej sondy i sond, które nie związała się wcale w buforze płuczącym PBD (przez 2 minuty)

7. Nałożenie DAPI na analizowane pole i przykrycie szkiełkiem nakrywkowym

8. Detekcja sondy (działanie promieniowania, które wzbudza świecenie znacznika)

9. Analiza mikroskopowa

Detekcja sondy

• lampa rtęciowa - źródło promieniowania, które wzbudza emisję znacznika fluoroscencyjnego

• zestaw filtrów - przez, które przechodzi promieniowanie o danej długości fali

• mikroskop fluoroscencyjny - w którym obserwuje się emisję fluorochromu

• aparat cyfrowy lub system komputerowy - który umożliwia dokumentację obserwowanego w mikroskopie obrazu

Rodzaje sond molekularnych stosowanych w FISH

• specyficzne (unikatowe) dla danej sekwencji DNA

• komplementarne do sekwencji powtórzonych

• złożone (malujące) specyficzne dla całego chromosomu lub jego ramion (p v q)

Sondy unikatowe

• specyficzne (unikatowe) - specyficzne dla danej sekwencji DNA metafazy + jądra interfazalne

• do identyfikacji mikrodelecji

• do identyfikacji genów fuzyjnych np. BCR/ABL

• do identyfikacji submikroskopowych aberracji

Zespoły mikrodelecyjne

Cri du chat (kociego krzyku)5p15

Z. Millera-Diekera 17p13.3

Z. Smitha- Magenisa 17p11.2

Z. Di George 22q11.2

Z. Williamsa 7q11.23

Z. Pradera-Willego/Angelmana 15q12

Retinoblastoma 13q14

Fuzje genowe

• 95% pacjentów z CML ma t(9;22)(q14;q11) z fuzją genową BCR/AAL1 (tzw. chromosomy PH) i ABL1/BCR(9q+)

• inne fuzje:

• t(15;17) PMLI

• t(8;21)/ETO/AML1 = AML-

• (12;21)/TEL/AML1=B-ALL

Sondy komplementarne do sekwencji powtórzonych

• metafazy +jądra interfazalne

• sondy centromerowe

• sondy telomerowe

• sondy komplementarne do regionów heterochromatyny konstytutywnej

W diagnostyce aneuploidii

• do identyfikacji chromosomów markerowych

• do identyfikacji aberracji chromosomowych (delecje terminalne) - sondy telomerowe

• do identyfikacji mozaikowatości komórkowej

Sondy złożone

• malujące - specyficzne dla całego chromosomu z wyłączeniem centromeru metafazy

• do identyfikacji chromosomów markerowych

• do identyfikacji dodatkowego materiału genetycznego

• do identyfikacji złożonych lub ukrytych translokacji

• do identyfikacji aneuploidii i zaburzeń ilości chromosomów płci

Multikator FISH (M-FISH lub SKY-FISH)

• pseudokolorowanie

• nie widać mikrodelecji, duplikacji, insercji

• widać dodatkowe chromosomy, których nie można przypasować i skąd mają fragmenty

mBAND - embanding FISH

• przydatne przy mikrodelecjach i mikroduplikacjach

Trisomia 21 (zespół Downa)

Zespół Downa jest najczęstszym zaburzeniem chromosomalnym. Wśród noworodków choroba ujawnia się z częstotliwością ok. 1 na 700 żywych urodzeń. Dla kobiet, które urodziły dziecko obciążene trisomią 21 chromosomu, ryzyko urodzenia kolejnego dziecka z tą wadą wynosi ok. 1%.

95% chorych cierpi z powodu „klasycznej” postaci trisomii wynikającej z obecności dodatkowego chromosomu 21 (47,XX,+21 lub 47,XY,+21). W tych przypadkach u rodziców nie stwierdza się żadnych zmian w kariotypie.

Od dawna obserwowano, że częściej na zespół Downa chorują dzieci starszych matek: dla kobiet w wieku 21-23 lata prawdopodobieństwo urodzenia dziecka obciążonego tą wadą wynosi ok. 0,5-0,7 na 1000 żywych porodów, w wieku 35 lat - ok. 3 na 1000, w wieku 40 lat - ok. 10 na 1000, a w wieku 45 lat i starszym - ok. 25-34 na 1000 żywych porodów. Narzucający się związek wzrostu częstości zachorowań dzieci wraz z wiekiem matki sugerował, że do nondysjunkcji pary chromosomów 21 dochodzi w drugiej fazie podziału mejotycznego, w wyniku którego powstaje komórka jajowa i ciałko resztkowe. W rzeczy samej, badania polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych DNA wykazały, że dodatkowy chromosom w większości przypadków pochodzi od matki, jednakże dotychczas nie wyjaśniono przyczyny, dla której tak się dzieje.

W około 4% przypadków trisomii 21 chromosomu dodatkowy materiał chromosomalny jest wynikiem translokacji. W tych przypadkach do translokacji dochodzi w trakcie gametogenezy, lub - co jest znacznie częstsze - jedno z rodziców jest nosicielem translokacji zrównoważonej, obejmującej chromosom 21 i inny akrocentryczny chromosom np. 22. Do wystąpienia pełnoobjawowego zespołu Downa z wszystkimi charakterystycznymi zaburzeniami fenotypowymi wystarczy translokacja stosunkowo niewielkiej części chromosomu 21: a mianowicie 21q22.2 do 21q22.3. Interesujące, że obserwowana częstość powstawania trisomii 21 u dzieci rodziców-nosicieli translokacji jest z niejasnych powodów znacząco niższa od teoretycznej, wynoszącej 1:3.

Około 1% ogółu pacjentów cierpiących na zespół Downa stanowią chorzy z mozaikowatością, których tkanki składają się z przemieszanych w różnych proporcjach prawidłowych somatycznych komórek diploidalnych i komórek zawierających dodatkowy chromosom 21. Ilość komórek wykazujących kariotyp trisomiczny uzależniona jest od tego, na jak wczesnym etapie embriogenezy doszło do nondysjunkcji w jednej z komórek. Podobnie zmienne jest nasilenie objawów. Przypadki trisomii 21 związane z mozaikowatością i z translokacją są niezależne od wieku matki.

Objawy kliniczne zespołu Downa są zwykle trudne do przeoczenia. Od lat uwagę lekarzy zwracał „płaski” profil twarzy, skośny przebieg szczelin powiekowych, hiperteloryzm, płaska nasada nosa i fałdy nakątne nadające twarzom chorych charakterystyczny wygląd, z powodu którego zaburzenie to znane było jako „mongolizm”. Dodatkowo stwierdza się tzw. plamki Brushfielda na tęczówce, zmniejszenie nosa, małżowin usznych (nisko osadzonych i często zniekształconych) oraz żuchwy. Czaszka i szyja są krótkie, ta ostatnia zwykle „płetwiasta”. Dłonie, krótkie i szerokie, w ponad ¾ przypadków wykazują obecność pojedynczej, poprzecznej bruzdy (tzw. „małpia bruzda”), a często również zakrzywienie V palca (klinodaktylia). Często stwierdzanym objawem jest także duży odstęp pomiędzy pierwszym i drugim paluchem stopy. Zewnętrzne narządy płciowe są niedorozwinięte, a napięcie mięśniowe obniżone. Chorzy są zwykle niscy, ich wzrost nie przekracza 150 cm.

Stałym objawem jest upośledzenie umysłowe, zwykle znacznego stopnia - ok. 80% chorych wykazuje IQ w granicach 25-50. Wyższy IQ wskazuje na różnego stopnia mozaikowatość. Trisomia 21 odpowiada za ponad 30% wszystkich przypadków ciężkiego i umiarkowanego upośledzenia umysłowego u dzieci oraz za opóźnienie ich rozwoju zarówno emocjonalnego jak i ruchowego.

Oprócz opisanych wyżej zaburzeń fenotypowych i upośledzenia umysłowego u chorych często ujawniają się wady narządów wewnętrznych. Około 40% pacjentów cierpi z powodu wrodzonej wady serca, zazwyczaj wynikających z zaburzenia rozwoju poduszeczek wsierdziowych, które prawidłowo, ok. 5 tygodnia życia płodowego, tworzą przegrodę pośrednią, rozdzielającą prawe i lewe ujście przedsionkowo-komorowe; następnie powyżej i poniżej niej powstaje przegroda, odpowiednio, międzyprzedsionkowa i międzykomorowa. Zazwyczaj są to wady typu ostium primum, wady dotyczące przegród międzyprzedsionkowej lub międzykomorowej, wady zastawek przedsionkowo-komorowych, rzadziej przetrwały przewód tętniczy Botalla. Wady te stanowią najczęstszą przyczynę zgonów w wieku noworodkowym i niemowlęcym.

Na drugim co do częstości miejscu są wady przewodu pokarmowego (zwężenie lub niedrożność zazwyczaj na poziomie przełyku lub jelita cienkiego, rzadziej odbytu), a rzadziej stwierdza się wady układu moczowego i kostnego (wrodzone zwichnięcie stawów biodrowych) oraz niedoczynność tarczycy.

Wśród dzieci chorych na zespół Downa występuje ok. 10-20 razy wyższe ryzyko zachorowania na ostrą białaczkę, zarówno limfoblastyczną jak i mieloblastyczną. Przypuszczalnie jest to związane z występowaniem nadmiaru białek takich jak np. czynnik transkrypcyjny związany z karłowatością odgrywający rolę w ostrej białaczce mieloblastycznej RUNX1 (21q22.3), onkogen ETS-2 (21q22.3), czy czynnik mieloproliferacyjny TAM (21q11.2). Jednakże przeprowadzone niedawno w Danii badania epidemiologiczne dużej grupy chorych wykazały, że zachorowalność na białaczki jest wyższa wśród dzieci do lat 4 i nieco większa również u starszych chorych; za to zmniejsza się wśród nich zachorowalność na guzy lite. Wiąże się ów fenomen z hipotetycznym(i) antyonkogenem(ami) zlokalizowanym(i) na chromosomie 21, mającymi występować w szczególnie dużych ilościach kopii w przypadkach trisomii tego chromosomu.

Także układ immunologiczny chorych jest w pewnym stopniu upośledzony, predystynując ich do zapadania na ciężkie infekcje, głównie dolnych dróg oddechowych oraz na rozwój chorób autoagresyjnych, szczególnie dotyczący tarczycy. Podłoże molekularne tych zaburzeń, związanych w większości przypadków z odpowiedzią komórkową, jest jak dotychczas nieznane.

Obecnie niemal 80% chorych z zespołem Downa przeżywa więcej niż 30 lat. Mężczyźni są bezpłodni, kobiety w niewielkim odsetku przypadków mogą mieć dzieci, jednakże połowa potomstwa cierpi na trisomię 21. Niemal wszyscy chorzy z trisomią 21 po 40 rż. zapadają na chorobę Alzheimera, nasilającą w znacznym stopniu objawy niedorozwoju umysłowego.

Zespół Klinefeltera

Jednym z najczęstszych zaburzeń chromosomalnych związanych z płcią jest zespół Klinefeltera. Polega on na występowaniu u osobnika o męskim fenotypie przynajmniej 2 chromosomów X i przynajmniej jednego chromosomu Y w każdej komórce somatycznej. Stwierdzany jest z częstotliwością ok. 1 na 850 żywych urodzeń wśród chłopców i stanowi jedną z najczęstszych przyczyn hipogonadyzmu o podłożu genetycznym.

Do rozpoznania zespołu Klinefeltera dochodzi najczęściej u młodzieży lub dorosłych mężczyzn, zgłaszających się do lekarza z powodu hipogonadyzmu i bezpłodności; w wieku dziecięcym zwykle brak charakterystycznych cech fenotypowych pozwalających na postawienie wstępnej diagnozy.

Chorzy są wysocy, o wyraźnie zaburzonych proporcjach długości tułowia do długości kończyn, na korzyść tych ostatnich. Najbardziej stałym objawem klinicznym jest zmniejszenie wielkości zewnętrznych narządów płciowych (szczególnie jąder), często widoczna jest ginekomastia oraz brak charakterystycznego dla mężczyzn owłosienia łonowego czy brody. Poziom FSH w osoczu jest podwyższony, a stężenie testosteronu obniżone. Stosunek poziomu testosteronu do estrogenów (których stężenie zazwyczaj rośnie) determinuje stopień feminizacji pacjenta. IQ jest nieco niższe od przeciętnego, jednakże tylko u około 20% chorych stwierdza się cechy nieznacznego upośledzenia umysłowego.

Znakomitą większość chorych na zespół Klinefeltera - ok. 80% - stanowią pacjenci z kariotypem 47,XXY. Jest on wynikiem nondysjunkcji w czasie podziału mejotycznego gamet u jednego z rodziców, przy czym nieznacznie częściej niż w połowie przypadków zachodzi ona u matki, w czasie pierwszego podziału mejotycznego, a zatem - podobnie jak w zespole Downa - w tej grupie chorych obserwuje się zwiększenie częstości zachorowań wśród dzieci starszych kobiet. Większość pozostałych przypadków wynika z nondysjunkcji w trakcie pierwszego podziału mejotycznego u ojca, jednakże nie ma znaczenia od któregokolwiek rodziców pochodzą nadmiarowe chromosomy X. Dla rodziców posiadających już jedno dziecko z zespołem Klinefeltera ryzyko urodzenia kolejnego dziecka obarczonego tą chorobą nie jest większe niż w populacji.

Aż u 15% chorych stwierdza się mozaikowatość, najczęściej 46,XY/47,XXY i w tych przypadkach objawy są łagodniejsze. Pozostałe, stosunkowo rzadko spotykane przypadki mozaikowatości (np. 47,XXY/48,XXXY) oraz chorzy, u których stwierdza się kariotyp 48,XXXY lub 49,XXXXY zazwyczaj cierpią z powodu dodatkowych zaburzeń, do których zalicza się wnętrostwo (cryptorchismus), spodziectwo (hypospodiasis), ciężką hipoplazję jąder i zmiany w obrębie układu kostnego (najczęściej prognatyzm i kościozrosty promieniowo-łokciowe).

Zespół Turnera

Zespół Turnera stanowi wśród kobiet najczęstsze zaburzenie genetyczne związane z chromosomami płciowymi. Obserwowane zaburzenia fenotypowe są skutkiem częściowej lub całkowitej utraty chromosomu X, pociągającej za sobą hipogonadyzm. Schorzenie występuje z częstością 1 na 3000 żywo urodzonych noworodków płci żeńskiej. Zespół Turnera stwierdza się w niespełna 25% przypadków samoistnych poronień w pierwszym trymestrze ciąży.

Noworodki z zespołem Turnera zwracają uwagę znacznymi obrzękami chłonnymi (wynikającymi z zastoju limfy) obwodowych części kończyn, szczególnie na grzbietach dłoni i stóp oraz tkanki podskórnej charakterystycznie krótkiej szyi. Obrzęki zlokalizowane na szyi zmniejszają się wraz z wiekiem, jednak pozostają po nich charakterystyczne „płetwowate” fałdy skórne (pterygium colli), ewentualnie rzadziej dochodzi do torbielowatego poszerzenia naczyń limfatycznych na karku i powstania tak zwanego wodniaka torbielowatego (hygroma cysticum). Linia owłosienia na czole i karku przebiega nisko, niskie jest także osadzenie małżowin usznych. Ustawienie szpar powiekowych jest skośne, obecne są, podobnie jak w zespole Downa, zmarszczki nakątne. Podniebienie dziecka jest bardzo wysoko wysklepione a żuchwa niedorozwinięta. Klatka piersiowa jest szeroka, „puklerzowata”, z szeroko rozstawionymi, hipoplastycznymi brodawkami. IV i V kość śródręcza są charakterystycznie skrócone, stawy łokciowe są koślawe (cubitus valgus). Większość dzieci ma zaburzenia w rozwoju paznokci i liczne znamiona barwnikowe na skórze.

U dzieci z zespołem Turnera stwierdza się niedorozwój zewnętrznych narządów płciowych.. Macica jest hipoplastyczna, ale jajowody normalne. Jajniki zanikają i włóknieją. Jest to przyczyną obserwowanego u starszych chorych braku cech dojrzewania płciowego, pierwotnego braku miesiączki i bezpłodności. Szczególnie zwraca uwagę niski wzrost, nie przekraczający zwykle 150 cm. Brak jest zwykle owłosienia pachowego i łonowego, lub jest bardzo skąpe, rozwój gruczołów sutkowych jest zaburzony. IQ w znakomitej większości przypadków jest prawidłowy.

Stosunkowo często stwierdza się wady wrodzone układu sercowo-naczyniowego, z których najczęstsza jest koarktacja aorty (u 20% chorych), rzadziej dwupłatkowa zastawka aorty i defekty przegrody międzyprzedsionkowej. Stanowią one najważniejszą przyczynę zgonów dzieci z zespołem Turnera. Częste są wady nerek. Z niewyjaśnionych przyczyn u 50% pacjentek występują autoprzeciwciała skierowane przeciw tarczycy, a u połowy z nich stwierdza się kliniczne cechy jej niedoczynności. Podobnie niewyjaśnione są otyłość i insulinooporność stwierdzane u części pacjentek. Wychwycenie insulinooporności jest szczególnie istotne, albowiem nasila się ona na skutek terapii hormonem wzrostu, powszechnie stosowanej u chorych z zespołem Turnera.

Największą grupę chorych (ok. 57%) stanowią pacjentki z kariotypem 45,X, u których doszło do utraty całego chromosomu X, zwykle na skutek nondysjunkcji w czasie podziału mejotycznego. U 75% chorych jedyny chromosom X pochodzi od matki.

U ok. 14% pacjentek posiadających dwa chromosomy X można wykazać strukturalne zaburzenia jednego z nich. Pod względem częstości kolejność obserwowanych zaburzeń jest następująca:

1. Delecja krótkiego ramienia z utworzeniem izochromosomu długiego ramienia: 46,X,i(X)(q10).

2. Delecja fragmentów długiego i krótkiego ramienia z utworzeniem chromosomu kolistego: 46,X,r(X).

3. Delecja fragmentów długiego i krótkiego ramienia: 46,X,del(Xq) lub 46,X,del(Xp).

Pozostałe chore cierpią z powodu mozaikowatości, z najczęściej obserwowanymi kariotypami: 45,X/46,XX; 45,X/47,XXX; 45,X/46,X,i(X)(q10); 45,X/46,XY - w tym ostatnim przypadku jest możliwe wystąpienie cech wirylizacji, co stanowi bezwzględne wskazanie do chirurgicznego usunięcia gonad. Przy zastosowaniu metod cytologicznych mozaikowatość wykrywa się u ok. 29% chorych, jednakże metody stosowane w biologii molekularnej (FISH i PCR) przy użyciu których badano więcej niż jedną populację komórek, zwiększyły ten odsetek nawet do 75%. W najłagodniej przebiegających przypadkach mozaikowatości jedynymi objawami zespołu Turnera mogą być niewielkie zaburzenia miesiączki.

Patogeneza molekularna schorzenia nie została jeszcze dokładnie poznana. Wiadomo, że geny znajdujące się na chromosomach X są kluczowe dla prawidłowego rozwoju jajników. Są one aktywne w czasie oogenezy. W trakcie rozwoju płodowego w jajnikach znajduje się 5-7 milionów oocytów, w czasie pokwitania już tylko ok. 400000, zaś w czasie menopauzy nie więcej niż 10000. U pacjentek z zespołem Turnera, pozbawionych jednego z chromosomów X, utrata oocytów ulega znacznemu przyspieszeniu tak, że ostatnie z nich ulegają apoptozie w 2 roku życia chorego dziecka. W pewnym sensie zatem „menopauza wyprzedza pokwitanie”. Jajniki ulegają atrofii i pozostają po nich pasma tkanki włóknistej, pozbawione komórek jajowych (ang. streak ovaries). Za pozostałe, pozagonadalne zaburzenia (np. zaburzenia wzrostu i wady narządowe) obserwowane w zespole Turnera odpowiedzialne są geny zlokalizowane na krótkim ramieniu chromosomu X, częściowo homologicznym z chromosomem Y.

Długość życia chorych na zespół Turnera nie odbiega od normy. Dla rodziców posiadających już jedno dziecko chore, ryzyko urodzenia kolejnego chorego dziecka nie wzrasta.

Choroby dziedziczące się autosomalnie dominująco

Schorzenie autosomalne dominujące ujawnia się już przy uszkodzeniu tylko jednego z alleli, czyli u osobnika heterozygotycznego. Nosicielem może być każde z rodziców, niezależnie od płci i każde może przekazywać wadliwy gen potomstwu, dlatego prawdopodobieństwo urodzenia chorego dziecka wynosi 50%.

Z obserwacji klinicznych wynika, że wbrew powyższym teoretycznym regułom dziedziczenia, część rodziców chorych dzieci nie wykazuje żadnych objawów schorzenia. W tych przypadkach choroba jest skutkiem nowej mutacji, powstającej w gametach. Nie zwiększa ona ryzyka zachorowania wśród rodzeństwa chorego dziecka. Prawdopodobieństwo zachorowania jest uzależnione od wpływu choroby na zdolności reprodukcyjne: jeśli schorzenie zaburza reprodukcję, wówczas większość nowych przypadków zachorowań jest rezultatem mutacji de novo. Szczególnie duży odsetek mutacji w DNA gamet obserwuje się u starszych rodziców (po 40 rż). Istnieje również stosunkowo niewielka grupa chorób dziedziczących się autosomalnie dominująco, które ujawniają się z pewnym opóźnieniem, dopiero w wieku dorosłym; należy do nich np. choroba Huntingtona.

Nasilenie i rozległość objawów chorobowych opisuje się używając dwóch terminów: ekspresji i penetracji.

Penetracja opisuje częstość ujawniania się określonej cechy fenotypowej: jeśli wśród osób z mutacją tylko u połowy ujawni się określony objaw, mówimy, że jego penetracja wynosi 50%. W przypadku pozostałych pacjentów, u których mimo mutacji, nie obserwuje się zmian w fenotypie, mówi się o niepełnej penetracji.

Ekspresja oznacza zmienność nasilenia cech fenotypowych, czyli objawów, przy istniejącym i możliwym do zidentyfikowania zaburzeniu w genomie; mówimy wtedy o zmiennej ekspresji. Doskonałym przykładem jest nerwiakowłókniakowatość typu 1 (opisana dalej) - w przypadku niektórych pacjentów jedynymi objawami są jedynie brązowe plamki na skórze, a u innych występują mnogie, guzowate zmiany na skórze i deformacje kości.

Mechanizmy leżące u podstaw niepełnej penetracji i zmiennej ekspresji nie są do końca poznane. Prawdopodobnie są one rezultatem wpływu innych genów lub czynników środowiskowych na ekspresję zmutowanych alleli. Wiadomo na przykład, że fenotyp chorego na niedokrwistość sierpowatokomórkową (rezultat mutacji w genie dla podjednostki β hemoglobiny) jest uzależniony od genu kodującego podjednostkę α ponieważ od niego zależy ile w ogóle powstaje hemoglobiny. Z kolei czynnikiem środowiskowym silnie modyfikującym fenotyp chorego na hipercholesterolemię rodzinną (patrz dalej) jest zawartość tłuszczów w diecie.

Z biochemicznego punktu widzenia, choroby dziedziczone autosomalnie dominująco można rozpatrywać w kontekście natury samej mutacji oraz typu białka, którego produkcja zostaje w wyniku tejże mutacji upośledzona. Większość mutacji prowadzi do produkcji białek nieaktywnych - noszą one wspólną nazwę mutacji z utratą funkcji.

Jeśli mutacja dotyczy tylko jednego allelu kodującego białko enzymatyczne, to taka utrata aktywności zwykle może zostać skompensowana przez enzym kodowany na drugim allelu - dlatego niedobory enzymatyczne nie manifestują się jako zaburzenia autosomalne dominujące. Zaburzenia autosomalne dominujące dotyczą głównie białek nieenzymatycznych, szczególnie dwóch głównych grup:

◄Białka związane z głównymi ścieżkami metabolicznymi, które są w prawidłowych warunkach hamowane w mechanizmie ujemnego sprzężenia zwrotnego. Przykładowo, w hipercholesterolemii rodzinnej (opisanej dalej) inaktywacja 50% receptorów LDL prowadzi do silnego wzrostu poziomu cholesterolu predysponującego do rozwoju miażdżycy.

◄Główne białka strukturalne, takie jak kolagen czy elementy cytoszkieletu (np. spektryna). W ich przypadku wiedza dotycząca mechanizmów leżących u podstaw ujawniania się zaburzeń przy 50% inaktywacji białka jest fragmentaryczna. Wiadomo jednak, że nieprawidłowe cząsteczki białek strukturalnych mogą negatywnie wpływać na białka prawidłowe - np. w przypadku cząsteczek kolagenu, którego aż trzy cząsteczki muszą spolimeryzować w helikalny łańcuch, deformacja tylko jednej z nich uniemożliwia stabilne połączenie pozostałych. Mutację tego typu (najczęściej punktową) nazywamy mutacją dominującą negatywną, ponieważ jeden produkt nieprawidłowego allelu negatywnie wpływa na prawidłowe produkty białkowe pozostałych. Tego typu zaburzenia leżą u podłoża zespołu Marfana czy nieprawidłowego wrodzonego kościotworzenia.

Rzadko stwierdza się mutacje, w wyniku których białko zyskuje nową funkcję. Niemal wszystkie tego typu zaburzenia dziedziczone są autosomalnie dominująco. Przykładem schorzenia, w którym wadliwe białko wykazuje funkcję niespotykaną w przypadku białka prawidłowego jest choroba Huntingtona, szczegółowo omówiona w rozdziale dotyczącym patologii OUN. Nieprawidłowe białko powstające na skutek mutacji w obrębie genu Huntingtona - Huntingtona - jest toksyczna dla neuronów.

	choroba	białko	loci genu
	choroba Huntingtona	huntingtyna	4p16.3
		neurofibromatoza	neurofibromina	17q11.2
		dystrofia miotoniczna	kinaza proteinowa dystrofii miotonicznej	19q13.2-3
		stwardnienie guzowate	białko-1 stwardnienia guzowatego	9q34
	wielotorbielowatość nerek dorosłych typ 1	policystyna 1	16p13.3
	rodzinna polipowatość jelita grubego	białko polipowatości gruczolakowatej jelit	5q21
	sferocytoza wrodzona typ 2	erytrocytowa ankyrina-1	8p11.2
		choroba von Willebrandta	czynnik VIII	12p13.3
		zespół Marfana	fibryllina	15q21
		zespół Ehlersa-Danlosa (niekt. warianty)	prokolagen / kolagen (różne typy)	~
		wrodzona łamliwość kości typ 1	prokolagen α-1 i α-2	~
		achondroplazja	receptor 3 czynnika wzrostu fibroblastów	4p16.3
		hipercholesterolemia rodzinna	receptor LDL	~
		ostra przerywana porfiria	syntaza hydroksymetylobilanu	11q23.3

Choroby dziedziczące się autosomalnie recesywnie

Choroby dziedziczące się autosomalnie recesywnie stanowią największą grupę schorzeń dziedziczących się klasycznie. Schorzenia te są rezultatem zaburzeń dotyczących obydwu alleli danego genu. Heterozygotycznie rodzice chorego dziecka (homozygoty) nie są z reguły chorzy, jednak schorzenie może dotyczyć jego rodzeństwa; statystyczne ryzyko zachorowania wynosi 25% na każdą kolejną ciążę. Jeśli zmutowany gen rzadko występuje w populacji, wówczas istnieje znaczne prawdopodobieństwo, że chore dziecko jest rezultatem małżeństwa pomiędzy krewnymi.

W odróżnieniu od schorzeń dziedziczonych autosomalnie dominująco, choroby autosomalne recesywne cechują się zwykle pełną penetracją i znacznie mniej zróżnicowaną ekspresją i ujawniają się we wczesnym dzieciństwie. Nowe mutacje są znacznie rzadziej niż w przypadku chorób autosomalnych dominujących przyczyną schorzeń, ponieważ mutacja dotyczy zwykle jednego allelu (mutacje w dwóch różnych loci są znacznie mniej prawdopodobne) i czasem nie ujawnia się nawet w ciągu kilku pokoleń - dopóty, dopóki gameta heterozygotycznego nosiciela nie połączy się z gametą innego heterozygoty. Mutacje dotyczą głównie białek enzymatycznych - w ten sposób dziedziczą się niemal wszystkie wrodzone schorzenia metaboliczne - i wiążą się z utratą funkcji białka. Heterozygoty posiadają jedynie połowę prawidłowej ilości enzymu, jednak jest to zwykle ilość wystarczająca do sprawnego funkcjonowania organizmu.

	choroba	białko	loci
	zwłóknienie torbielowate	CFTR	7q31-32
		galaktozemia	urydylotransferaza galaktozo-1-fosforanowa	9p13
		homocystynuria (jeden z podtypów)	β-syntaza cystationiny	21q22.3
		lizosomalne choroby spichrzeniowe	różne	~
		niedobór α1-antytrypsyny	α1-antytrypsyna	14q32.1
		choroba Wilsona	β-łańcuch białka transportującego miedź	13q14.3-q21.1
		hemochromatoza	HLA-H	6p21.3
		glikogenozy	różne	~
		alkaptonuria	oksydaza kwasu homogentyzynowego	3q21-q23
		niedokrwistość sierpowatokomórkowa	podjednostka β hemoglobiny	11p15.5
		talasemia β	podjednostka β hemoglobiny	11p15.5
	wrodzony przerost nadnerczy	różne	~
	zespół Ehlersa-Danlosa (niektóre warianty)	różne	~
	neurogenne atrofie mięśniowe	różne	~
		ataksja Friedricha	frataksyna	9q13
		rdzeniowe atrofie mięśniowe	różne	5q

Choroby dziedziczne sprzężone z chromosomem X

Wszystkie schorzenia sprzężone z płcią są równocześnie sprzężone z chromosomem X i prawie wszystkie są dziedziczone recesywnie. Geny zlokalizowane na chromosomie Y są odpowiedzialne za rozwój jąder, stąd wszystkie ich mutacje wiążą się z bezpłodnością - zatem nie są dziedziczone. Zmapowano na chromosomie Y kilka genów nie związanych z determinacją płci, jednakże nie są znane żadne schorzenia, które byłyby z nimi związane.

Choroby recesywne sprzężone z chromosomem X stanowią niewielki odsetek schorzeń uwarunkowanych genetycznie. Większość genów na chromosomie X nie ma swoich homologicznych odpowiedników na chromosomie Y, stąd mężczyźni są hemizygotami dla tych genów, w związku z tym choroby te występują tylko u mężczyzn.

Chorzy mężczyźni nie przekazują zmutowanego genu synom, jednakże wszystkie ich córki są nosicielkami. Statystycznie synowie tych kobiet mają 50% szansy na to, że nie otrzymają uszkodzonego genu będą zdrowi, zaś ich córki - że nie będą nosicielkami.

Heterozygotyczne nosicielki zwykle nie wykazują pełnej ekspresji zmian fenotypowych z powodu obecności prawidłowego allelu. Dzieje się tak z powodu wybiórczej inaktywacji jednego z chromosomów X w komórkach somatycznych kobiet, w pewnej liczbie tych komórek inaktywowany jest prawidłowy chromosom X. Przykładowo, w niedoborze dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu - kluczowego dla metabolizmu erytrocytów enzymu, którego gen położony jest w na chromosomie X - u mężczyzn dochodzi do masywnej hemolizy wewnątrznaczyniowej. U kobiet może dochodzić do częściowej hemolizy, o nasileniu zależnym od tego, w jakim odsetku komórek prekursorowych doszło do inaktywacji prawidłowego chromosomu X; jeżeli inaktywowany był we wszystkich komórkach prekursorowych uszkodzony chromosom X - penetracja jest zerowa i vice versa. Z reguły jednak ekspresja tego schorzenia u kobiet jest znacznie skromniejsza niż u mężczyzn.

	choroba	białko	loci
	dystrofia mięśniowa Duchenne	dystrofina	Xp21
	hemofilia A	czynnik VIII	Xq28
		hemofilia B	czynnik IX	Xq27.1-q27.2
		przewlekła choroba ziarniniakowa (postać sprzężona z chromosomem X)	polipeptyd β cytochromu b-245	Xp21.1
		niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej	dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa	Xq28
		Agamma-globulinemia typ 1	kinaza tyrozy- nowa agamma- globulinemii Brutona	Xq21.3-q22
		zespół Wiskotta-Aldricha	białko zespołu Wiskotta-Aldricha	Xp11.23-p11.22
		moczówka prosta (jedna z postaci)	receptor 2 dla wazopresyny	Xq28
		zespół Lescha-Nyhana	Fosforybozylo-transferaza hipoksantynowa	Xq26-q27.2
	zespół łamliwego chromosomu X	FMR-1	Xq27.3

Translokacja

W przypadku translokacji aberracja polega na przeniesieniu fragmentu chromosomu w inne miejsce. Zaburzenie to oznaczamy literką t (ang. translocation). W zależności od miejsca docelowego wyróżniamy:

Translokację wewnątrzchromosomalną (intrachromosomalną)

W tym przypadku fragment chromosomu jest przenoszony z jednego miejsca chromosomu w inne miejsce tego samego chromosomu. O translokacji takiej można powiedzieć, że jest zrównoważona, ponieważ nie ma utraty materiału genetycznego i bardzo rzadko aberracja tego typu doprowadza do poważnych następstw.

Translokację międzychromosomalną (interchromosomalną)

Polega na przeniesieniu odcinka chromatyny pomiędzy dwoma chromosomami. Jeśli są to chromosomy homologiczne to mówimy o translokacji siostrzanej, jeśli nie - jest to translokacja zewnętrzna. Można tą aberrację podzielić na:

Transpozycję

Termin ten oznacza przeniesienie fragmentu chromosomu na inny chromosom.

Translokację wzajemną

Ta aberracja polega na „wymianie” fragmentów chromosomów pomiędzy sobą. W uczonych podręcznikach wymienia się wiele tego typu zaburzeń, z punktu widzenia patologii istotne są dwa:

Zrównoważona translokacja wzajemna

Aberracja ta jest skutkiem wzajemnej wymiany obwodowych fragmentów ramion dwóch chromosomów. W przypadku, gdy są to chromosomy homologiczne, zjawisko to może nie mieć żadnych następstw (jeśli wymieniane odcinki są równej długości) lub być przyczyną duplikacji krótkiego odcinka na jednym chromosomie z równoczesną jego delecją na drugim (kiedy wymieniane odcinki nie są równe). W obydwu tych sytuacjach translokacja jest zrównoważona, jednak w drugim może prowadzić do powstania niezrównoważonej mutacji u potomstwa.

Jeśli nie są to chromosomy homologiczne, co nota bene zachodzi częściej, przykładowo: jeśli dochodzi do translokacji ramienia długiego chromosomu 2 i krótkiego ramienia chromosomu 5 u kobiety, zapisujemy to 46,XX,t(2;5)(q31;p14). Nosicielka tej mutacji jest zazwyczaj fenotypowo prawidłowa (bo jej genom - niezależnie od tego gdzie - zawiera wszystkie potrzebne geny). Istnieje jednak zagrożenie, że u jej potomstwa dojdzie do translokacji niezrównoważonej, ponieważ do gamet trafią nieprawidłowe zestawy chromosomów: w jednym zestawie zabraknie fragmentu ramienia długiego chromosomu 2, z będą tam dwie kopie ramienia krótkiego chromosomu 5, a w drugim - odwrotnie. Efektem będzie poronienie lub powstanie wady wrodzonej u noworodka.

Translokacja robertsonowska czyli połączenie centryczne

Jest to translokacja pomiędzy dwoma chromosomami akrocentrycznymi. Przełamanie chromatyny w chromosomach przebiega w pobliżu centromerów, a w wyniku translokacji powstaje z reguły jeden ogromny chromosom składający się z długich ramion macierzystych chromatyd i jeden mały - nie posiadający zwykle centromeru i ginący w czasie podziału komórkowego. Znajduje się na nim jednak tak mało materiału genetycznego, że nie ma zmian fenotypowych. Chromosom robertsonowski występuje w populacji ze średnią częstością około 1 na 1000 zdrowych osób i stanowi jedną z głównych przyczyn powstawania zaburzeń chromosomalnych (m.in. zespołu Downa) u dzieci nosicieli.

---