Ćwiczenie

Temat: Izolacja i identyfikacja gronkowców

Staphylococcus aureus jest Gram-dodatnim ziarniakiem o średnicy ok.

1 μm. W preparatach mikroskopowych przygotowanych z hodowli płynnych i stałych, obok pojedynczych komórek, obserwuje się charakterystyczne skupiska przypominające grona. Inną typową dla S. aureus cechą jest żółte zabarwienie kolonii na podłożach stałych, przy czym wytwarzanie barwnika zależy od składu podłoża, temperatury i światła.

Hodowla laboratoryjna gronkowca nie sprawia raczej trudności. Do wzrostu wymagane są warunki tlenowe oraz temperatura 37˚C. Zwykle wykorzystuje się podłoża agarowe wzbogacone krwią, ze względu na zdolność S. aureus do hemolizy krwinek (typu β).

Identyfikację gronkowca złocistego w laboratoriach mikrobiologicznych przeprowadza się rutynowo z zastosowaniem prostych testów diagnostycznych. Przykładowa procedura postępowania przedstawiona jest na rysunku 1, natomiast w tabeli 1 umieszczono inne użyteczne w badaniach cechy S. aureus.

Tab. 1. Właściwości wykorzystywane w różnicowaniu gatunków rodzaju Staphylococcus.

Właściwości	S. aureus.
Beztlenowy rozkład mannitolu	+
Rozkład sacharozy w war. tlenowych	+
Rozkład trehalozy w war. tlenowych	+
Wytwarzanie α-toksyny	+
Wytwarzanie termostabilnej nukleazy	+
Wytwarzanie acetoiny	+
Zapotrzebowanie biotyny do wzrostu	−
Zawartość rybitolu w ścianie	+
Zawartość glicerolu w ścianie	−
Aktywność kwaśnej fosfatazy	+
Wrażliwość na nowobiocynę	MIC 0,6 μg/l

Rys. 1. Schemat identyfikacji S. aureus.

Fot. 1. Wzrost S. aureus na podłożu agarowym z krwią

Fot. 2. Preparat mikroskopowy komórek S. aureus barwiony metodą Grama

Fot. 3. Wynik testu na obecność enzymu katalazy - rozkład H₂O₂

Fot. 4. Wynik testu na obecność enzymu koagulazy - aglutynacja osocza

Staphylococcus aureus jako czynnik etiologiczny

Gronkowiec złocisty jest jednym z najczęściej izolowanych patogenów człowieka. Zakażenia dotyczą przede wszystkim skóry i tkanek podskórnych, zwykle z udziałem procesu ropnego (czyraki, trądzik, jęczmień, liszajec zakaźny, toksyczna nekroliza naskórka, róża, cellulitis, zapalenie mieszków włosowych, gronkowcowy zespół oparzonej skóry).

Infekcje gronkowcowe stanowią poważny problem, zwłaszcza w szpitalach, gdzie często dochodzi do zagrażających życiu zakażeń, takich jak syndrom szoku toksycznego, ropnie mózgu, zapalenie płuc, wsierdzia, szpiku kostnego i kości, opon mózgowych, mięśnia sercowego, żył. Często dochodzi też do infekcji układu moczowego. Ponadto u pacjentów po zabiegach chirurgicznych oraz osób z obniżoną odpornością, zakażenie gronkowcowe może przejść w postać uogólnionej posocznicy.

Rozprzestrzenianiu S. aureus sprzyja bezobjawowe nosicielstwo. Szacuje się, że co najmniej 10% ludzi zdrowych to stali nosiciele gronkowca złocistego, zaś 70 - 90% należy do tzw. nosicieli przejściowych. Bakteria zasiedla głównie błony śluzowe nosa oraz gardło.

Chorobotwórczość S. aureus uwarunkowana jest wytwarzaniem przez ten drobnoustrój szeregu enzymów i toksyn, a także obecnością otoczki oraz pewnych powierzchniowych białek i receptorów. Czynniki te umożliwiają gronkowcowi efektywną kolonizację i uszkadzanie tkanek gospodarza. Najważniejsze produkty sekrecyjne gronkowca odpowiedzialne za jego patogenność zestawiono w tabeli 2.

Dodatkowo S. aureus zdolny jest do łatwego nabywania oporności na antybiotyki. Cecha ta jest kodowana chromosomalnie lub wiąże się z obecnością w komórce plazmidu niosącego geny oporności. Obecnie coraz częściej obserwuje się występowanie szczepów wielolekoopornych, co utrudnia skuteczne leczenie infekcji gronkowcowych

Tab. 2. Właściwości wybranych enzymów i toksyn S. aureus.

Enzym / toksyna	Właściwości
Acetoina	Decyduje o zjadliwości
Hialuronidaza	Powoduje rozkład substancji międzykom., przez co umożliwia w tkankach penetrację innych czynników chorobotwórczości
Enterotoksyny A-F	Odpowiada za zatrucia pokarmowe
Fosfataza	Determinuje patogenność
Fosfolipaza	Decyduje o zjadliwości
Katalaza	Rozkłada H2O2 do tlenu i wody
Koagulaza	Odpowiada za krzepnięcie krwi
Leukocydyny	Niszczą leukocyty - ochrona przed sfagocytowaniem
Lipazy	Uczestniczą w patogenezie zmian ropnych skóry
Nukleazy	Odpowiadają za uszkodzenie kw. nukleinowych
Penicylinaza	Rozkłada wiązania β-laktamowe w podstawowej strukturze antybiotyków z grupy penicylin
Proteinazy	Odpowiadają za chorobotwórczość
Stafylokinaza	Rozpuszcza fibrynę
Toksyna α	Powoduje Lizę erytrocytów i uszkadza płytki krwi
Toksyna β	Uszkadza erytrocyty
Toksyna γ	Uszkadza lizosomy
Toksyna pirogenna	Odpowiada za gorączkę
Toksyna epidermolityczna	Odpowiada za uszkodzenie naskórka w liszaju i gronkowcowym zespole oparzonej skóry (ang.SSSS)
T. zespołu wstrząsu toksycznego 1 i 2	Odpowiadają za wstrząs toksyczny

Część praktyczna: materiały

Szczepy S.aureus MSSA i MRSA (referencyjne i kliniczne) na podłożu stałym (agarowym) i płynnym; Staphylococcus epidermidis na podłożu płynnym

Podłoża agarowe zwykłe 12 płytek

Podłoże krwawe na hemolizę 2 sztuki

Podłoże Chapmana 12x2

Podłoże na fermentację glukozy 12x2

Sól fizjologiczna, woda jałowa

Szkiełka podstawowe 24 sztuki

Probówki serologiczne( 6 x 2 )+ 1 sztuk

Test lateksowy

Woda utleniona

Osocze królicze stosuje się w diagnostyce gronkowców w testach:

1. szkiełkowym - do oznaczania gronkowców wytwarzających czynnik zlepny clumping factor (koagulaza związana),

2. probówkowym - do oznaczania szczepów gronkowców zdolnych do produkcji pozakomórkowego enzymu koagulazy, powodującej krzepnięcie osocza króliczego (koagulaza wolna)

Potencjalnie chorobotwórcze szczepy S.aureus wytwarzają przeważnie oba te czynniki.

Ampułkę rozpuścić w 1.8 ml jałowej wody destylowanej

Oznaczanie gronkowcowego clumping factor metodą szkiełkową:

• na szkiełku podstawowym umieścić obok siebie dwie krople fizjologicznego roztworu chlorku sodowego,

• w obu kroplach zawiesić za pomocą ezy badane bakterie pochodzące z hodowli na podłożu agarowym, zawiesina powinna być gęsta, w przybliżeniu odpowiadać wyglądowi mleka

• do jednej kropli zawiesiny dodać za pomocą ezy (1 oczko0 osocza króliczego i delikatnie wymieszać

Oznaczanie koagulazy metodą probówkową:

• do oznaczeń stosuje się osocze królicze 5x jałowym, fizjologicznym roztworem chlorku sodowego

• do 0.5 ml osocza dodać 0.5 ml hodowli bulionowej

• w taki sam sposób przygotować próbę kontrolną ze szczepami koagulazo-dodatnimi i koagulazo - ujemnymi

• inkubować w temperaturze +37

• wynik testu odczytać po 1,3, 6, 24 godzinach

Odczyt i interpretacja wyników:

Oznaczanie clumping factor

W ciągu kilkunastu sekund powinny pojawić się wyraźne kłaczki, co dowodzi obecności clumping factor. Zawiesina bakterii bez osocza powinna pozostawać homogenna, pojawienie się kłaczków w zawiesinie bez osocza świadczy o autoaglutynacji bakterii i nie może być podstawą do przyjęcia ujemnego lub dodatniego wyniku.

Oznaczenie koagulazy

Szczepy koagulazo-dodatnie Staphylococcus aureus powodują powstanie w probówce wyraźnego skrzepu, natomiast koagulazo-ujemne nie powodują krzepnięcia osocza.

Wynik testu obserwować we wskazanym powyżej czasie, ponieważ po dłuższej inkubacji, , w niektórych przypadkach może nastąpić rozpuszczenie skrzepu przy udziale wytwarzanego przez gronkowce aktywatora plazmowego.

Slidex Staph Plus (bioMerieux)

Zasada działania

Odczynnik zawiera cząsteczki niebieskiego lateksu uczulone ludzkim fibrynogenem i przeciwciałami monoklonalnymi.

Dlatego jest możliwe wykrywanie równoczesne:

1. clumping factor

2. białka A, dzieki uzyciu fragmentu Fc IgG myszy

3. grupowo specyficznego antygenu związanego ze strukturami powierzchniowymi S.aureus

Wynik pozytywny dla S.aureus obserwuje się jako widoczną aglutynację, bez użycia szkła powiększającego.

Odczynniki:

R1 lateks do wykrywania S.aureus - lateks uczulony ludzkim fibrynogenem i przeciwciałami monoklonalnymi anty- S.aureus

R2 negatywna kontrola lateksowa

Wybrać dwa sąsiadujące pola reakcyjne na karcie i opisć je numerami

Na jedno pole nanieść 1 kroplę R1, na drugie R2. Nakrapiając odczynnik trzymać butelkę w pozycji pionowej

Używając dwóch różnych pałeczek nanieść na każde z dwóch pól reakcyjnych kolonie bakteryjne:1-2 śre3dniej wielkości z niewybiórczego podłoza lub 3-6 małych koloni z podłoża Chapmana

Mieszać przez 10 sekund, rozetrzeć lateks na całej powierzchni pola reakcyjnego

Przez 20 sekund powoli obracać kartą, obserwując powstawanie aglutynacji

Pastorex Staph-plus (czerwone kuleczki) Bio-Rad - test aglutynacji lateksowej do identyfikacji S.aureus. Służy do detekcji następujących czynników

1. clumping factor (czynnik wiążący fibrynogen)

2. białko A, które wykazuje powinowactwo do fragmentu Fc gamma immunoglobuliny IgG

3. otoczki polisacharydowe

Odczynnik jest kompozycją lateksowych cząsteczek opłaszczonych fibrynogenem, IgG, specyficznymi monoklonalnych przeciwciałami przeciw otoczkom polisacharydowym.

Test na katalazę

Test na katalazę - na szkiełko podstawowe nakładamy ezą kroplę soli fizjologicznej i szczep bakterii, następnie zalewamy to wodą utlenioną. Jeśli pojawią się bąbelki znaczy to, że szczep ten jest katalazo (+).

Test na DNAzę - szczep bakterii na szalce Petriego zalewa się 10% HCl, co powoduje denaturację DNA.

Staphylococcus aureus Growing on DNase Agar

Note there is breakdown of the DNA in the agar. There is a clear zone (arrow) around the bacterial growth where there is no longer any DNA left in the agar to precipitate out of solution after the HCl was added.

		The Staphylococus aureus on the left is negative for DNase production; the Serratia marcescens on the right is positive for DNase production as evidenced by the area of clearing around the growth.

DNase agar is a differential medium that tests the ability of an organism to produce an exoenzyme, called deoxyribonuclease or DNase, that hydrolyzes DNA. DNase agar contains nutrients for the bacteria, DNA, and methyl green as an indicator.  Methyl green is a cation which binds to the negatively-charged DNA. 

Deoxyribonuclease allows the organisms that produce it to break down DNA into smaller fragments.

When the DNA is broken down, it no longer binds to the methyl green, and a clear halo will appear around the areas where the DNase-producing organism has grown.

Mannitol Salt Agar (MSA) is a selective and differential medium. The high concentration of salt (7.5%) selects for members of the genus Staphylococcus, since they can tolerate high saline levels. Organisms from other genera may grow, but they typically grow very weakly.

MSA also contains the sugar mannitol and the pH indicator phenol red.  If an organism can ferment mannitol, an acidic byproduct is formed that will cause the phenol red in the agar to turn yellow. Most pathogenic staphylococci, such as Staphylococcus aureus, will ferment mannitol.  Most non-pathogenic staphylococci will not ferment mannitol.

The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow.  The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. Streptococcus agalactiae does not grow on MSA because of the high salt content. Staphylococcus epidermidis grows but does not ferment mannitol. Test na fermentację glukozy na podłożu Hugh i Leifsona (omówiony na ćwiczeniu)

6

Badany materiał

Posiew na podłoże agarowe z krwią

24h, 37°C

Określanie morfologii kolonii

Barwienie preparatu metodą Grama

Próba na katalazę (+)

Próba na wytwarzanie koagulazy (+)

---