ĆWICZENIE 12 i 13

Ocena toksyczności i genotoksyczności zanieczyszczeń
metodami biologicznymi

Zad 3 Test określający toksyczność chroniczną na rzęsie Lemna minor i na glonach

Zad 4. Test określający toksyczność chroniczną na glonach

Zad 5. Zatrucie ostre organizmu roślinnego kwaśnymi gazami: dwutlenkiem siarki i tlenkami azotu - pokaz

Zad 6. Badanie mutagennego działania za pomocą testu Amesa - pokaz

Materiały: szczep Salmonella typhimurium, płytki Petriego z podłożem minimalnym, kolbki z top-agarem zawierającym śladowe ilości histydyny i biotyny, bulion Oxoid, bufor fosforanowy, roztwór mutagenu, roztwór badanego związku, sterylne probówki, pipety

Wykonanie:

Do sterylnej probówki wlać 0.5 cm3 buforu fosforanowego. Za pomocą automatycznej mikropipety wprowadzić do probówki 0.1 cm3 całonocnej bulionowej hodowli szczepu Salmonella typhimurium. Dodać 0.1 cm3 związku badanego (jedno z trzech stężeń). Probówkę umieścić w termostacie o temperaturze 37oC na 20 min. (preinkubacja). Po inkubacji dodać 2 cm3 top-agaru, szybko wymieszać a następnie wylać na płytkę Petriego z podłożem minimalnym i równomiernie rozprowadzić po powierzchni. Postępując w sposób podany wyżej wykonać kontrolę pozytywną dodając zamiast związku badanego 0.1 cm3 związku mutagennego (uwaga związek silnie mutagenny). Wykonać kontrolę mutacji spontanicznej postępując jak wyżej (bez dodawania związku badanego). Wszystkie próby wykonać w trzech powtórzeniach. Płytki inkubować w temperaturze 37oC przez 48 h.

Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie na wszystkich płytkach uśredniając powtórzenia. Ocenić czy badany związek ma właściwości mutagenne.

Zad 7. Badanie mutagennego działania za pomocą testu Rec-assay - pokaz.

Materiały: szczep Bacillus: H17 (Rec+) i M 45 (Rec-), probówki z bulionem, płytki Petriego z agarem odżywczym, sterylne krążki bibułowe (16 mm średnicy), pęsety, denaturat

Wykonanie:

Za pomocą sterylnej pęsety umieścić krążek bibuły filtracyjnej na powierzchni płytki Petriego z agarem odżywczym, w odległości ok. 1 cm od brzegu płytki. Pobrać ezą inoculum z całonocnej hodowli bulionowej szczepu H17 i rozprowadzić w postaci pasma od brzegu krążka bibuły. Podobnie posiać na tej samej płytce szczep M45, pod kątem ok. 90o względem poprzedniego posiewu. Nanieść na krążek 2 krople badanego roztworu. Inkubować 24 godziny w temperaturze 37oC.

Po zakończeniu inkubacji zmierzyć długość strefy zahamowania wzrostu obu szczepów (od brzegu krążka do początku wzrostu). Porównać badany wzrost obu szczepów i ocenić czy badany związek ma właściwości mutagenne. Badana substancja może być toksyczna i mutagenna, toksyczna ale niemutagenna, nietoksyczna ale mutagenna, nietosyczna i niemutagenna.

Załącznik do instrukcji:

Szacuje się, że znanych jest obecnie ponad 4 mln związków chemicznych. Z tego ok. 60000 związków jest w powszechnym użyciu. Ciągle produkowane są nowe substancje a wiele z nich ma właściwości mutagenne. Część tych związków posiada taką budowę chemiczną, która nadaje im właściwości oddziaływania wprost z materiałem genetycznym komórki i powodowanie zmian w jego strukturze. Określa się je mianem mutagenów bezpośrednich. Należą tu głównie związki alkilujące (przyłączające do zasad nukleotydowych grupy metylowe - CH3 bądź etylowe - C2H5). Przykładem może być iperyt, czyli gaz musztardowy (bojowy środek parzący) albo związki epoksydowe, wchodzące w skład wielu lakierów i klejów.

Inne związki są nieaktywne biologicznie i dopiero po dostaniu się do organizmu są przekształcane w związki mutagenne. Określa się je mianem mutagenów pośrednich lub promutagenów. Zdolność uaktywniania promutagenów, które dostały się do organizmu, posiada wiele tkanek i narządów (łożysko, nerka, płuco, nabłonek przewodu pokarmowego), jednak najważniejszym narządem biorącym udział w metabolizmie tych związków jest wątroba. Narząd ten za pomocą enzymów z grupy oksydaz potrafi metabolizować każdą niemal obcą substancję, powodując jej detoksykację, czyli pozbawienie właściwości toksycznych. W toku tego procesu nieaktywne promutageny przechodzą w wysoce reaktywne metabolity, których naturalnym dalszym losem jest chemiczne sprzężenie z obojętnymi składnikami (np. kwasami żółciowymi czy kwasem glukuronowym), a następnie wydalenie takich kompleksów z moczem lub kałem. Jednak w tym procesie odtruwania część reaktywnych metabolitów może zboczyć z naturalnej drogi przemian i wejść w reakcje z materiałem genetycznym powodując mutacje.

Do najbardziej znanych promutagenów należą: policykliczne węglowodory aromatyczne (np. benzo(a)piren), aflatoksyna (silna trucizna produkowana przez żółtą pleśń Aspergillus flavus), CCl4, chlorek winylu i inne.

Niektóre mutageny mogą działać zarówno bezpośrednio jak i po aktywacji. Przykładem mogą być jony metali np. Cr. Istnieje wyraźna zależność między zdolnością do wywoływania mutacji a potencjałem rakotwórczym danej substancji. Można przyjąć, że substancje lub czynniki, które wykazują właściwości mutagenne, są jednocześnie potencjalnymi substancjami (czynnikami) kancerogennymi czyli rakotwórczymi. Często oba pojęcia (mutageny, kancerogeny) używa się zamiennie. Istotą bowiem przemiany prawidłowych komórek w komórki nowotworowe, czyli transformacji nowotworowej, jest zmiana w aparacie genetycznym normalnej komórki, zwłaszcza w obrębie tzw. onkogenów, która daje komórkom możliwość niekontrolowanych podziałów.

Wobec wzrastającej liczby różnorodnych związków chemicznych, które dostają się do środowiska, istnieje konieczność badań pod kątem ich właściwości mutagennych/kancerogennych. Służą do tego testy biologiczne.

Badania na żywych zwierzętach są kosztowne i czasochłonne. Jedna próba wymaga użycia przynajmniej 600 zwierząt (głównie myszy i szczurów) i trwa ok. 2 lata. Z tych powodów do monitorowania skażeń genotoksycznych używa się testów bakteryjnych, które są proste, szybkie i niedrogie. Odnoszenie wyników badań z modeli bakteryjnych do ludzi musi być obarczone pewnym błędem. Istnieje jednak na ogół wysoka korelacja między kancerogennością stwierdzoną w bezpośrednich badaniach na zwierzętach, a mutagennością wykazywaną przez testy bakteryjne.

Najczęściej stosowanym testem jest test Amesa. Został on opracowany w USA w latach 70-tych i jest ciągle udoskonalany. Używa się w nim specjalnie zmienionych szczepów Salmonella typhimurium. Bakteria ta w naturze wywołuje choroby zakaźne i zwierząt i zatrucia pokarmowe u człowieka. Szczególnie często jest przyczyną zatruć po spożyciu jaj (zwłaszcza kaczych).

Szczepy używane w teście są zmutowane w kilku miejscach genomu i mają obniżoną zjadliwość (zdolność do wywoływania chorób). Przede wszystkim, w wyniku mutacji w jednym z genów odpowiedzialnych za produkcję histydyny, zostały one pozbawione zdolności do syntezy tego aminokwasu, którą posiadają szczepy nie zmutowane (tzw. dzikie). Dlatego nie mogą rosnąć na podłożu bez histydyny (są histydynozależne, his-). Jednak pod wpływem czynnika mutagennego jakim może okazać się badany związek, bakterie te mogą ulec mutacji powrotnej (rewersji), która przywróci im pierwotną zdolność do syntezy aminokwasu (his+) i umożliwi wzrost na podłożu pozbawionym tego związku (bakterie zsyntetyzują go z glukozy obecnej w pożywce). Dlatego wzrost szczepów testowych w obecności związku badanego, na podłożu bez histydyny, świadczy o mutagennym działaniu tego związku.

Mutacja powstaje zwykle w trakcie replikacji DNA, towarzyszącej podziałom komórkowym. Stąd aby badana próbka mogła spowodować mutację, niezbędna jest jednak śladowa ilość histydyny w podłożu, umożliwiająca bakteriom wykonanie kilku podziałów. Efektem tego ograniczonego wzrostu jest powstanie murawy utworzonej przez ledwo widoczne gołym okiem kolonie. Z powodu wyczerpania histydyny, dalej rosnąć mogą tylko komórki, w których zaszła rewersja (mutanty his+). One właśnie utworzą wyraźnie widoczne, możliwe do policzenia kolonie. Im silniej mutagennie będzie działać badany związek, tym więcej wyrośnie kolonii rewertantów.

Aby właściwie ocenić mutagenność testowanej próbki, należy wykonać kontrolę, w której bakterie będą rosnąć w takich samych warunkach, ale bez kontaktu ze związkiem badanym. Wówczas niewielka liczba komórek również zostanie zmutowana, gdyż w środowisku zawsze działają różne, często nieuchwytne czynniki mutagenne (np. promienie UV, składniki podłoża i inne). Wywołają one tzw. mutacje spontaniczne, które również mogą przywrócić bakteriom zdolność do syntezy histydyny i umożliwić wzrost na podłożu testowym. Liczba kolonii rewertantów powstałych spontanicznie stanowi punkt odniesienia (tło), uwzględniany przy odczycie wyników testu. Przyjęto, że aby uznać badaną próbę za mutagenną (kancerogenną) liczba rewertantów na płytkach badanych powinna być przynajmniej dwukrotnie wyższa, niż na płytkach kontrolnych bez testowanego związku.

Aby zwiększyć wrażliwość na działanie mutagenów szczepy testowe mają uszkodzoną ścianę komórkową, co czyni ją bardziej przepuszczalną dla dużych cząsteczek takich jak np. benzo(a)piren (nie przechodzi przez normalną ścianę). Ponadto, szczepy mają ograniczoną zdolność do naprawy uszkodzeń w DNA, co znacznie zwiększa ich czułość na działanie mutagenne. Jak wspomniano we wstępie, bakterie (i inne organizmy) posiadają szereg systemów naprawy, które różnią się zdolnością do wiernego odtwarzania pierwotnej struktury. Szczepy używane w teście Amesa pozbawione są tego systemu reperacji, który działa bezbłędnie (naprawa przez wycinanie uszkodzonych fragmentów, wstawianie prawidłowych), natomiast mają uwydatniony system popełniający błędy (SOS).

Aby sprawdzić czy stosowane szczepy posiadają właściwą czułość, poddaje się je tzw. kontroli pozytywnej. Polega ona na badaniu wielkości rewersji spowodowanej przez mutageny o znanej sile działania. Takim mutagenem wykorzystywanym w ćwiczeniu będzie daunomycyna - antybiotyk przeciwnowotworowy produkowany przez promieniowce. Jest to mutagen bezpośredni.

Wiele związków ujawnia swoje właściwości mutagenne (kancerogenne) dopiero po przekształceniu w organizmie, głównie w wątrobie. Aby stworzyć w teście warunki zbliżone do panujących w ustroju człowieka poddaje się badaną próbę aktywacji za pomocą frakcji enzymatycznej uzyskanej z wątroby szczura.

Test Amesa nadaje się do badań szerokiego spektrum związków, w tym również do badania prób środowiskowych, jak woda, gleba, powietrze, masa roślinna, mocz i inne. Materiały pobrane ze środowiska, przed zbadaniem poddaje się ekstrakcji w odpowiednich rozpuszczalnikach bądź absorbuje na specjalnych żywicach. Ekstrakty lub eluenty odparowuje się, zalewa odpowiednim rozpuszczalnikiem i wprowadza do testu. Test ten jest stosunkowo mało czuły wobec pestycydów i związków metali (z wyjątkiem Cr+6)

Innym często stosowanym testem bakteryjnym jest test "rec-assay" (z ang. recombination - rekombinacja, assay - próba). Metoda ta polega na badaniu zwiększonego działania letalnego (śmiertelnego) związków mutagennych na komórki mutantów bakterii Bacillus subtilis. Mutanty te nie posiadają zdolności do reperowania uszkodzeń w DNA za pomocą rekombinacji (rec-), w przeciwieństwie do szczepu dzikiego (rec+). Reperacja rekombinacyjna jest jeszcze drugim (obok poznanych już: fotoreaktywacji, reperacji przez wycinanie i SOS) metodą naprawy. Komórki pozbawione jej mają jednocześnie osłabione pozostałe systemy naprawcze, dlatego nawet stosunkowo niewielkie uszkodzenia DNA mogą powodować u nich zahamowanie wzrostu. A więc, w przeciwieństwie do testu Amesa, w teście rec-assay badana substancja o właściwościach mutagennych nie powoduje mutacji w komórkach testowych, lecz degradację DNA, która hamuje dalszy wzrost (komórka nie potrafii naprawić uszkodzenia). Szczep dziki natomiast jest w stanie rosnąć, dopóki siła działania mutagenu nie przekroczy możliwości naprawczych komórek. Porównując długość linii wzrostu obu szczepów ocenia się właściwości mutagenne próbki. Test rec-assay jest czułym testem, szczególnie przydatnym do badania związków metali, na które test Amesa jest mniej wrażliwy.

---