ĆWICZENIE 5
BIOLOGICZNE PROCESY ROZKŁADU MATERII ORGANICZNEJ.
Literatura zalecana:
Schlegel G. Hans: Mikrobiologia ogólna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2000, str. 500-535.
Duvigneand Paul: Biosfera jako środowisko człowieka, str. 91-96
Zagadnienia szczegółowe:
Znajomość pojęć: biodegradacja, biokumulacja, enzymy adaptacyjne, kometabolizm, ksenobiotyk.
Rozkład substancji naturalnych: celuloza, ksylan, skrobia, pektyny, chityna, lignina, węglowodory, białka.
Rozkład syntetycznych związków organicznych: chlorowcowane fenole, detergenty.
Mikrobiologiczne przemiany metali ciężkich.
Czynniki wpływające na podatność substancji organicznych na rozkład biologiczny.
Zadanie 1.
Rozkład fenolu przez drobnoustroje wyizolowane z wody powierzchniowej oraz przez szczep bakterii Psedomonas fluorescens.
Materiały:
Zawiesina drobnoustrojów wyizolowanych z wody powierzchniowej oraz szczepu bakterii Psedomonas fluorescens, kolby płaskodenne z podłożem minimalnym 80 cm3, 0,1% roztwór fenolu, kolbki miarowe o pojemności 50 cm3, bufor fosforanowy, roztwór 4-aminoantypiryny, roztwór żelazicyjanku potasowego.
Wykonanie:
Do kolby płaskodennej o objętości 250 cm3 zawierającej 80 cm3 sterylnego podłoża minimalnego dodać sterylnie 10 cm3 0,1% roztworu fenolu i zaszczepić drobnoustrojami wyizolowanymi z wody powierzchniowej oraz bakteriami Psedomonas fluorescens. Jednocześnie przygotować zestaw kontrolny zawierający sterylne podłoże minimalne i fenol w takiej ilości jak w próbie zaszczepionej
bakteriami. Kolby ustawić na wytrząsarce i inkubować w temperaturze pokojowej przez 72 h. Po tym czasie pobrać 10 cm3 hodowli, odwirować przez 10 minut z prędkością 10 tys. obr./min i oznaczyć zawartość fenolu w 1cm3 supernatantu. Jednocześnie oznaczyć zawartość fenolu w próbce kontrolnej.
Oznaczanie fenolu - metoda 4-aminoantypirynowa:
Fenole lotne z parą wodną reagują przy pH=4 w obecności żelazicyjanku potasowego z 4-aminoantypiryną tworząc pochodne indofenolowe o zabarwieniu od żółtego do czerwonego, w zależności od stężenia fenolu.
Do kolbki miarowej o poj. 50 cm3 wprowadzić 1 ml badanej próby, dodać 20 ml buforu fosforanowego (pH=7,9), dobrze wymieszać. Następnie dodać 0,5 ml r-ru 4-aminoantypiryny, dobrze wymieszać. Dodać 0,5 ml r-ru żelazicyjanku potasowego, dobrze wymieszać. Po 15 minutach odczytać absorpcję przy długości fali 500 nm względem próby kontrolnej. Określić stężenie fenoli w próbce z krzywej wzorcowej.
Sporządzenie krzywej wzorcowej.
Do kolejnych czterech kolbek miarowych o poj. 50 ml wprowadzić 1, 2, 5, 10 ml roztworu fenolu zawierającego w 1ml 0,01 mg fenolu (100-krotnie rozcieńczony 0,1% r-r fenolu). Dalej postępować jak podano wyżej przy oznaczaniu fenoli w badanej próbce. Odczytać absorpcję kolejnych wzorców i sporządzić krzywą wzorcową.
Zadanie 2.
Obserwacja rozkładu celulozy przez organizmy glebowe i osadu dennego
Materiały:
Różne rodzaje gleb, gleba wyjałowiona termicznie, krążki bibuły, pojemniki na glebę, duże szkiełka zegarkowe.
Wykonanie:
Napełnić pojemniki do połowy badaną glebą;
Położyć na powierzchnię podłoża krążek bibuły (celuloza) i zwilżyć go wodą;
Przykryć szkiełkiem zegarkowym;
Analogicznie nastawić próbę kontrolną z podłożem wyjałowionym w wysokiej temperaturze.
Obserwować powierzchnię krążków przez okres paru tygodni. Zwrócić uwagę na pojawiające się plamy o różnym zabarwieniu i powstające w ich miejscu ubytki.
Porównać intensywność rozkładu celulozy na różnych podłożach i w próbach kontrolnych.
Zadanie 3.
Obserwacja rozkładu wybranych materiałów tekstylnych w środowisku glebowym.
Materiały:
Różne rodzaje gleb, gleba wyjałowiona termicznie, próbki tkanin, pojemniki na glebę.
Wykonanie:
Wprowadzić do każdej z gleb badany materiał i przetrzymać przez kilka tygodni;
Utrzymać wilgotność prób przez skrapianie wodą;
Po kilku tygodniach obserwować zmiany na powierzchni tkanin i porównać wyniki.
Zadanie 4.
Rozkład drewna i celulozy przez grzyby pasożytujące na drzewach.
Materiały:
Zawiesina grzybni korowicy (Phanerochete sp.), pożywka mineralna o pH=4,5, krążki bibułowe, kawałki drewna, kolby stożkowe.
Wykonanie:
Rozkład drewna
Wprowadzić sterylnie do kolbek z pożywką zawierającą drewno ok. 0,5 ml zawiesiny grzybni;
Przygotować próbę kontrolną przez wprowadzenie 0,5 ml zawiesiny do pożywki nie zawierającej drewna;
Inkubować w temp. 37oC;
Obserwować wzrost grzyba w obu próbach.
Zmiany w drewnie powodowane przez grzyb mogą być widoczne gołym okiem dopiero po dłuższym czasie biodegradacji, ze względu na obecność w drewnie trudno rozkładalnych substancji ligninowych (osłaniających celulozę). Dlatego o dokonującym się procesie rozkładu można tu wnioskować pośrednio, np. na podstawie wzrostu grzybni. Porastanie przez grzyb drewna świadczy o procesie jego rozkładu, gdyż w pożywce nie ma innych źródeł węgla. Ewentualny ograniczony wzrost w próbie kontrolnej, może wynikać z wprowadzenia niewielkich ilości związków organicznych wraz z inokulum.
Rozkład celulozy
Wprowadzić sterylnie do kolbek z pożywką mineralną krążek celulozowy;
Zaszczepić pożywkę inokulum w postaci 0,5 ml zawiesiny grzybni;
Przygotować próbę kontrolna (bez grzyba);
Inkubować w temp. 37oC;
Obserwować przez ok. 3 tygodnie zmiany zachodzące w krążkach badanych i kontrolnych. Wykonać preparaty mikroskopowe z obu krążków. Zwrócić uwagę na przerośnięcie włókien celulozowych strzępkami grzybni.