ĆWICZENIE 4

FUNKCJE FIZJOLOGICZNE ORGANIZMÓW ŻYWYCH

ODDYCHANIE KOMÓRKOWE

Literatura zalecana:

Eldra P. Solomon, Linda R. Berg, Diana W. Martin, Claude A. Villee. 1996: Biologia, Multico Oficyna Wydawnicza, Warszawa

Rozdział VII „Szlaki uwalniania energii i biosynteza” str. 162 - 183.

Maria Pawlaczyk - Szpilowa 1997: Biologia i ekologia

Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej

Z rozdziału V: „Metabolizm energiotwórczy” i „Inne procesy energiotwórcze”

str.153 - 179.

Zagadnienia szczegółowe:

Oddychanie:

Oddychanie tlenowe, oddychanie komórkowe - etapy (glikoliza, cykl Krebsa, łańcuch oddechowy) oddychanie beztlenowe (fernentacja i oddychanie mineralne).

ODDYCHANIE

Zasada pomiaru apatarem Warburga:

Do pomiaru intensywności oddychania tlenowego wykorzystuje się metodę manometrycznego oznaczania spadku ciśnienia tlenu spowodowanego jego zużyciem na procesy utleniania substratu. Ze względu na to, że ubytkowi tlenu - w trakcie oddychania tlenowego- towarzyszy przyrost stężenia dwutlenku węgla, powstający CO₂ jest wiązany na drodze chemicznej (np.20% KOH) by wyeliminować jego wpływ na mierzone ciśnienie. Badania takie przeprowadza się w aparacie Warburga stosując manometry o stałej objętości.

Aparat Warburga składa się z szeregu precyzyjnych, kapilarnych manometrów o średnicy około 1 mm. Rurka manometru wyskalowana jest co 1 mm i wypełniona cieczą manometryczną o ściśle określonej gęstości. Najczęściej stosuje się do tego celu tzw. płyn Brodiego, którego gęstość wynosi 1,033, a ciśnienie atmosferyczne wyrażone w mm słupa płynu Brodiego wynosi 10 000 mm. Koniec manometru połączony jest szlifem z naczyńkiem reakcyjnym zanurzonym w termostatowanej łaźni wodnej. Dodatkowo naczyńko reakcyjne jest wstrząsane w celu ułatwienia wymiany gazowej pomiędzy fazą ciekłą (zawiesina badanych organizmów) a fazą gazową (gaz wypełniający przestrzeń nad cieczą w naczyńku pomiarowym aż do poziomu płynu Brodiego w zamkniętym ramieniu kapilary manometru). W celu doprowadzenia płynu Brodiego, w zamkniętym ramieniu manometru, do umownego punktu zerowego (najczęściej punkt 150 mm) reguluje się objętość cieczy manometrycznej za pomocą przycisku znajdującego się na zbiorniczku z tym płynem umieszczonym u dołu manometru. W czasie badań odczytów dokonuje się na ramieniu otwartym.

Wzrost ciśnienia gazów (wydzielanie się gazów) w naczyńku reakcyjnym powoduje podniesienie poziomu płynu manometrycznego, podczas spadku ciśnienia gazów (pobierania gazów) poziom płynu opada. Wzrost ciśnienia oznaczamy jako (+h), a ubytek (-h).

Ze względu na to, że na zmianę ciśnienia gazu wywiera istotny wpływ wiele czynników, należy je uwzględnić przy podawaniu wyników badań w postaci objętościowej (μl). Do najważniejszych należą objętość fazy gazowej, objętość fazy ciekłej, rozpuszczalność gazu w cieczy, temperatura łaźni wodnej itp.

Czynniki te uwzględnia tzw. stała naczyńkowa k, której wyznaczenie umożliwia przeliczanie obserwowanych zmian ciśnienia (h• k) na zmiany objętości gazu (x).

x= h•k (μl)

Stałą naczyńkową oblicza się wg równania:

Vg - objętość fazy gazowej (naczyńko + zamknięte ramię manometru do umownego punktu zerowego - 150),

Vc - objętość fazy ciekłej w naczyńku ( objętość badanej próby + odczynniki),

T - temperatura absolutna łaźni wodnej (stopnie Kelvina),

P₀ -ciśnienie normalne (10 000 mm płynu Brodiego),

α - rozpuszczalność badanego gazu w cieczy, w temperaturze T i pod ciśnieniem

1013 hPa (760 mm Hg)

Stała naczynkowa k ma wartość stałą dla danych warunków doświadczenia, tj.: dla danego naczyńka, rodzaju gazu, objętości fazy gazowej, objętości fazy ciekłej i temperatury.

Ponieważ podczas oznaczeń ciśnienie atmosferyczne i temperatura łaźni wodnej (pomimo jej termostatowania ) nie są idealnie stałe, dlatego stosuje się każdorazowo manometry kontrolne określane mianem tzw. termobarometrów (Tb). Kontrole te zawierają w naczyńkach tylko wodę w ilości ściśle odpowiadającej objętości zawartej w próbach badanych. Próby te mają dostarczyć informacji na temat zmian odczytów ciśnienia wywołanych wyłącznie przez zmiany warunków zewnętrznych (ciśnienie atmosferyczne i temperatura łaźni wodnej). Są one podstawą do wyznaczenia poprawki dla każdego kolejnego odczytu. W przypadku zgodnego kierunku zmian ciśnienia w termobarometrze i próbie badanej, należy bezwzględną wartość odczytu badanej próby zmniejszyć o poprawkę, a w przeciwnym przypadku poprawkę należy dodać.

Sposób uwzględniania poprawki przedstawia schemat:

odczyt:

-h_t +h_t +h_t -h_t

-h_b +h_b -h_b +h_b

odpowiada to rzeczywistym zmianom ciśnienia :

- (h_b- h_t); + (h_b- h_t); - (h_b+ h_t); + (h_b+ h_t);

W tabeli podano sposób zapisywania odczytów i obliczania μl pobranego tlenu na podstawie odczytów różnic w poziomie płynu Brodiego w tremobarometrze i badanej próbie.

Zapisywanie wyników i obliczanie ilości pobranego tlenu

Czas (min)	Odczyt Tb	Poprawka dla Tb ht	Odczyt próby badanej	Zmiana próby badanej (mm) hb	Zmiana rzeczywista próby badanej (po poprawce)	μl O2 x = (h• k)
0	150	0	150	0	0	0• kO2
5	165	+15	146	-4	-19	-19• kO2
10	160	+10	127	-23	-33	-33• kO2
15	154	+4	94	-56	-60	-60• kO2
20	150	+10	59	-91	-101	-101• kO2
25	149	-1	22	-128	-129	-129• kO2

Zadanie 1.

Badanie aktywności oddechowej osadu czynnego w aparacie Warburga

a)wpływ substratu oddechowego,

b)wpływ substancji toksycznych

Materiały:

• homogenizowany osad czynny;

• bibułki do studzienek;

• recepturki;

• 20% KOH,

• 0,01 M. roztwór KH₂PO₄ o pH = 4,8 (1,36g KH₂PO₄/l);

• 5% glukoza;

• smar do manometrów

• aparat Warburga,

• kalibrowane naczyńka pomiarowe ( objętości fazy ciekłej = 3,5 ml) do aparatu Warburga,

• pipety, zlewki,

Wykonanie:

Przygotować zawiesinę mikroorganizmów osadu czynnego w 0,01 M. roztworze KH₂PO₄ o pH = 7, tak by gęstość optyczna przy długości fali 530 nm wynosiła po 10 -krotnym rozcieńczeniu 1.

Do studzienek naczyniek 3,4,5,6,7,8 wprowadzić KOH i umieścić w nich złożone w harmonijkę kawałki bibuły w celu zwiększenia powierzchni chłonącej CO₂.

Napełnione zgodnie z powyższa tabelą naczyńka przymocować gumką do manometrowi i umieścić a łaźni aparatu (temp. 37⁰C ). Otwarte, za pośrednictwem kranów trójdrożnych, zestawy manometrowi wytrząsać przez 10 min w celu wyrównania warunków w próbach. Po wstępnej inkubacji we wszystkich manometrach wyrównać poziom płynu Brodiego do umownego punktu zerowego (150 mm). Natychmiast zamknąć krany trójdrożne manometrów i zanotować czas. Dokonywać kolejnych odczytów ciśnienia w odstępach pięciominutowych przez 30 min., doprowadzając każdorazowo poziom płynu Brodiego do punktu 150 mm na zamkniętym ramieniu manometru. Następnie odczytać poziom cieczy manometrycznej na ramieniu otwartym i zapisać go w tabeli. Po zakończeniu doświadczenia otworzyć krany zamykające układ i wyjąć manometry z łaźni wodnej.

Dla wszystkich odczytów prób badanych i endogennych obliczyć objętości tlenu jakie zostały zużyte na proces oddychania w badanym czasie. Obliczyć wartości średnie z prób 3 i 4, 5 i 6 , 7 i 8 ( (pr. badane) i 9 i 10 (pr. endogenne). Wyniki pomiarów i obliczeń należy wpisać do tabeli.

Z uzyskanych danych sporządzić wykres zależności ubytku tlenu (oś rzędnych ) w czasie ( oś odciętych).

Naczyńka reakcyjne należy napełnić tak, jak podano niżej:

Skład poszczególnych naczyniek reakcyjnych:

Nr zestawu	Studzienka 20%KOH ml	Komora główna
				KH2PO4	H2O	Mikroorganizmy osadu czynnego	5% glukoza	Zw. Toksyczny
				ml
1 termobarome	-	-	3,5	-	-	-
2 termobarome	-	-	3,5	-	-	-
3 Próba. Badana	0,2	2	-	1,2	0,1	-
4 Próba. Badana	0,2	2	-	1,2	0,1	-
5 Próba. Badana	0,2	2	-	1,2	0,1	0,1 ml CuSO4 w stęż. 1mg/l
6 Próba. Badana	0,2	2	-	1,2	0,1	0,1 ml CuSO4 w stęż. 1mg/l
7 Próba. Badana	0,2	2	-	1,2	0,1	0,1 ml CH 3COOHw stęż.1mg/l
8 Próba Badana	0,2	2	-	1,2	0,1	0,1 ml CH 3COOH w stęż. 1mg/l
9* Próba endogenna	0,2	2	-	1,2	-	-
10*Próba endogenna	0,2	2	-	1,2	-	-

*Próba nr 9 i 10 tzw. endogenna - określa intensywność pobierania tlenu przez badane komórki na proces utleniania zmagazynowanych w nich materiałów zapasowych. Wyniki uzyskane dla tych prób należy porównać z wynikami prób w których utleniana jest glukoza jako substrat oddechowy.

Zadanie 2.

Określenie intensywności oddychania roślin wyższych (nasiona grochu) poprzez oznaczanie ilości wydzielonego dwutlenku węgla.

Materiały:

• kiełkujące nasiona grochu;

• 2 kolbki Erlenmayera o poj. 250ml z dopasowanymi korkami gumowymi;

• gaza, biureta;

• 0,02 N Ca(OH)₂;

• 0,02 N (COOH)₂;

• fenoloftaleina.

Wykonanie:

Do 2 kolbek Erlenmayera o pojemności 250 ml wprowadzić po 50 ml 0,02 N Ca(OH)₂ i natychmiast zamknąć korkiem. W jednej przeprowadzone będzie doświadczenie, a drugiej tylko próba odczynnikowa. Następnie do woreczka z gazą włożyć 5g kiełkujących nasion grochu i umieścić woreczek w jednej z kolb. Trzymając koniec woreczka zamknąć kolbę korkiem tak, aby woreczek zawisnął nad powierzchnią wodorotlenku baru. Czas wiązania dwutlenku węgla przez wodorotlenek baru powinien wynosić 30 minut. Osad węglanu wapnia wytrąca się w reakcji:

Ca(OH)₂ + CO₂ = CaCO₃↓ + H₂O

Następnie należy zmiareczkować powstałą zawiesinę 0,02 N kwasem szczawiowym wobec fenoloftaleiny:

COOH COO\

Ca(OH)₂ + │ = │ Ca↓ + 2H₂O

COOH COO⁄

W trakcie doświadczenia zachodzącego w pierwszej kolbie przeprowadzić próbę odczynnikową w kolbie drugiej - zmiareczkować 50 ml wody barytowej kwasem szczawiowym (wartość A). Po upływie 30 minut oznaczyć ilość CO₂ w pierwszej kolbie (wartość B).

Ilość wydzielonego przez nasiona CO₂ w badanej próbie oblicza się z różnicy ml zużytego do miareczkowania kwasu szczawiowego (A-B). Różnica ta wyraża równoważną ilość ml 0,02 N kwasu węglowego związanego przez Ca(OH)₂ w CaCO₃. Ze względu na to, że 1 ml 0,02 N kwasu szczawiowego odpowiada 0,44 mg CO₂, obliczyć ilość wydzielanego CO₂ na 1g masy nasion na 1 godzinę. Wyniki podać w tabeli:

Masa nasion [g]	Miareczkowanie A [ml]	Miareczkowanie B [ml]	Różnica (A-B) [ml]	Natężenie oddychania mg CO2 (z 1g nasion)/godz.

Zadanie 3.

Wyznaczenie ubytku CO₂ w procesie fermentacji alkoholowej.

Materiały:

• drożdże Saccharomyces cerevisiae 24 godzinna hodowla;

• 50 ml pożywki wg Ridera w kolbach Erlenmayera z rurkami fermentacyjnymi;

• waga;

• cieplarka.

Wykonanie:

Pożywkę fermentacyjną wg Ridera zaszczepić 24 godzinną zawierającą 5 ml drożdży Saccharomyces cerevisiae. Zamknąć kolbę rurką fermentacyjną. Zważyć zestaw. Drożdże inkubować 7 dni w temperaturze 26^oC, a następnie ponownie zważyć zestaw. Z różnicy wagi zestawu przed i po fermentacji obliczyć ubytek CO₂.

Zadanie 4.

Wykazanie produktów fermentacji masłowej zachodzącej z udziałem mikroflory glebowej.

Materiały:

• gleba;

• probówki zamknięte szczelnymi korkami gumowymi ze sterylnym 2% roztworem sacharozy;

• łaźnia wodna o temp. 75-80 ^oC;

• roztwór chlorku żelaza (III);

• szkiełka zegarkowe.

Wykonanie:

Probówki z 2% roztworem sacharozy zaszczepić grudką ziemi. Zawartość probówki ogrzewać przez 10 minut w łaźni wodnej w temperaturze 75-80^oC. Następnie probówkę szybko schłodzić, szczelnie zakorkować. Inkubować przez 7 dni w temperaturze 20^oC. Po inkubacji stwierdzić obecność kwasu masłowego (zapach). Pobrać 3 ml przesączonej hodowli na szkiełko zegarkowe, dodać kilka kropel chlorku żelaza. podgrzać. W obecności kwasu masłowego pojawia się brązowy maślan żelaza (III).

Zadanie 5.

Wykrywanie bakterii denitryfikacyjnych w wodzie rzecznej lub osadach dennych

Materiały:

- woda z rzeki;

• probówki ze sterylnym bulionem z KNO₃;

• odczynnik Griessa;

• odczynnik Nesslera;

• szkiełka zegarkowe.

Wykonanie:

Podłoże dla bakterii denitryfikacyjnych - bulion z KNO₃ zaszczepić 1 ml wody rzecznej lub osadem dennym. Próby inkubować w temperaturze 20-22 ^oC w ciągu trzech dni. Przebieg denitryfikacji stwierdzić po wydzieleniu gazów tworzących pianę na powierzchni pożywki lub przez wykrycie azotynów odczynnikiem Griessa lub amoniaku odczynnikiem Nesslera.

Zadanie 6.

Wykrywanie obecności bakterii desulfurykacyjnych w osadach dennych

Materiały:

• osad denny;

• słupki z pożywką Starkey'a ( z octanem ołowiu);

• igła preparacyjna.

Wykonanie:

Wykonać posiew osadu dennego metodą kłutą. W tym celu sterylną igłę preparacyjną zanurzyć w osadzie dennym i wkłuć w zestalony słupek agarowy z pożywką Starkey'a . Próby inkubować w 22-23 ^oC w ciągu 6 dni. Po inkubacji wokół bakterii desulfurykacyjnych powstają brunatne, prawie czarne strefy na skutek wytwarzania PbS co świadczy o występowaniu w badanym materiale bakterii zdolnych do redukcji zw. siarki (VI).

---