Biotechnologia enzymatyczna

Sprawozdanie

Kinetyka reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę.

Kierunek: Biotechnologia
rok III
Grupa chemia 1
Grupa laboratoryjna 4

Data odbycia zajęć: 30.10.2009

1. Cel ćwiczenia:

Wyznaczenie stałej Michaelisa- Menten oraz szybkości maksymalnej dla reakcji hydrolizy sacharozy katalizowanej przez inwertazę.

2. Przebieg ćwiczenia:

1. Grupa została podzielona na 5 sekcji, z których każda wykonała 100 ml roztworu sacharozy o określonym stężeniu w buforze octanowym (0.5, 1, 2, 3 oraz 4 g/100ml). W tym celu do kolby o pojemności 100 ml wsypano odpowiednią ilość sacharozy i dopełniono do kreski buforem octanowym.

2. Następnie z każdego rozcieńczenia pobrano po 25 ml roztworu, przeniesiono go do osobnej kolby.

3. Rozpoczynając od najmniejszego stężenia dodawano kolejno do kolb po 0,05 ml inwertazy, wprowadzano roztwór do rurki polarymetrycznej i mierzono kąt skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego po 2,4,6,8 i 10 minutach od wprowadzenia enzymu. Wyniki zanotowano w tabeli.

W celu ograniczenia błędów pomiarowych pomiary rozpoczęto od najmniejszego stężenia, a pomiędzy pomiarami rurkę polarymetru dokładnie przepłukiwano acetonem, i dopiero po jego odparowaniu wprowadzano kolejny roztwór, uważając przy tym, aby nie pozostawić we wnętrzu rurki żadnego pęcherzyka powietrza.

3. Opracowanie wyników:

Wyniki zebrano w tabeli oraz przeprowadzono odpowiednie obliczenia:

1. Stężenie substratu c_s :

l - długość rurki polarymetrycznej; 2 dm
α - kąt skręcania w stopniach
c₀ - stężenie wagowe sacharozy na początku pomiarów, g/100ml

2. Stężenie produktu c_p :

c_p - stężenie produktu, g/100ml

c₀ - stężenie wagowe sacharozy na początku pomiarów, g/100ml

c_s - stężenie substratu, g/100 ml

3. Szybkość początkowa v_o (za szybkość początkową przyjmujemy stężenie produktu w 8 minucie pomiaru)

c_p- stężenie produktu w 8 minucie

t- przyjmujemy czas: 8 minut

4. 1/c₀ i 1/v₀ potrzebne do sporządzenia wykresu dla równania Lineweavera-Burka.

4. Wyniki

Czas, min	Skręcalność, stopnie	Stężenie substratu Cs g/100 ml	Stężenie produktu C0-Cs, g/100 ml	Szybkość początkowa v0, g/min	1/Cs0	1/V0
Stężenie sacharozy w buforze octanowym: 0.504 g/100 ml
2	0.58	0.45	0.054	0.0305	3.846	32.787
4	0.46	0.38	0.124
6	0.34	0.31	0.194
8	0.25	0.26	0.244
10	0.17	0.21	0.290
Stężenie sacharozy w buforze octanowym: 1.012 g/100 ml
2	1.19	0.923	0.089	0.0590	1.852	16.949
4	1.01	0.819	0.193
6	0.73	0.656	0.356
8	0.53	0.540	0.472
10	0.36	0.442	0.570
Stężenie sacharozy w buforze octanowym: 2.01 g/100 ml
2	2.15	1.709	0.301	0.105	0.855	9.524
4	1.85	1.535	0.475
6	1.51	1.338	0.672
8	1.22	1.170	0.840
10	0.95	1.013	0.997
Stężenie sacharozy w buforze octanowym: 3.001 g/100 ml
2	3.14	2.511	0.490	0.1294	0.509	7.728
4	2.86	2.349	0.652
6	2.53	2.158	0.843
8	2.20	1.966	1.035
10	1.89	1.786	1.215
Stężenie sacharozy w buforze octanowym: 3.997 g/100 ml
2	4.88	3.750	0.247	V6 = 0.116	1/Cs6 = 0.303	1/V6 = 8.621
4	4.53	3.550	0.447
6	4.11	3.303	0.694
8	3.68	3.054	0.943
10	3.23	2.793	1.204

Równanie krzywej wzorcowej:

y = 7,191x + 4,528

1/V_max = 4,528 Vmax = 0,221[g/min]
-1/K_M = -0,629 K_M = 1,589 [g/100ml]

2. Dla każdego stężenia sacharozy wykreślono zależność ilości wytworzonego produktu od czasu.

a) Stężenie 0,5 g/100ml:

b) Stężenie 1 g/100ml:

c) Stężenie 2 g/100ml:

d) Stężenie 3 g/100 ml:

e) Stężenie 4 g/100ml

5. Wnioski:

Ponieważ V_max jest osiągalne przy bardzo dużym stężeniu substratu, nie możemy precyzyjnie wyznaczyć wartości V _max z wykresu hiperbolicznego. Jednakże wartość V _max i K_m można wyznaczyć doświadczalnie mierząc V_o przy różnych stężeniach substratu. Następnie metodą regresji liniowej wykonujemy wykres kinetyki enzymu w układzie współrzędnych, które są odwrotnościami V i [S], czyli wykres Lineweavera-Burka.

Na wykresie tym na osi y zostały odłożone odwrotne wartości prędkości V₈ a na osi x odwrotne wartości stężenia C₈, dla poszczególnych początkowych stężeń sacharozy. Do obliczeń wykorzystano pomiary dokonane w 8 minucie, czas ten pozwolił na ustalenie się reakcji.

Z wykresu Lineweavera-Burka możemy wyznaczyć K_m i V_max, ponieważ wykres ma postać linii prostej przecięcie z osią y jest równe 1/V_max i wynosi 4,528. Natomiast przecięcie z osią x równa się -1/K_m i wynosi -0,629. Oznacza to że K_m ma wartość 1,589, a V_max 0,221.  Nachylenie linii ma wartość K_m/V_m i w naszym przypadku wynosi 7,191

Z przeprowadzonych obliczeń widać również zależność między K_m a V_max - wraz z przekroczeniem stężenia odpowiadającego K_m została również przekroczona połowa prędkości maksymalnej.

Jak można było się spodziewać wzrost stężenia substratu skutkował wzrostem szybkości reakcji, jest to następstwem korzystania z niskich stężeń (C <= Km), dla których taka zależność jest zauważalna. 

Na wykresie jest widoczny jeden punkt odstający odpowiadający stężeniu 4g/100ml. Jego obecność jest spowodowana poruszeniem się stołu w trakcie dokonywania pomiaru w 8 minucie i zachwianiem wyniku, do obliczeń wzięto więc wartości wyznaczone dla 6 minuty.

Z wykresów pokazujących zależność ilości produktu od czasu można wywnioskować, że podczas doświadczenia prędkość nie malała wraz z postępem reakcji - linie są proste, nie widać zmniejszającego się przyrostu produktu z czasem.

---