Laboratorium z biotechnologii

Ćwiczenie 5

„Wyodrębnianie preparatów enzymatycznych z cieczy pohodowlanego.”

1. Wstęp teoretyczny :

Proces hodowli mikroorganizmów związany jest ściśle z pozyskiwaniem odpowiedniego produktu np. enzymu. W skali przemysłowej mamy do czynienia z dużą ilością pożywki, inocullum a co za tym idzie rozwój mikroorganizmów jest wielokrotnie większy niż w skali laboratoryjnej. Nie zmienia to jednak faktu, iż sam sposób wyodrębniania pożądanego produktu hodowli jest podobny i z reguły różni się jedynie skalą wykonywanych w tym celu operacji. Z przyczyn oczywistych na ćwiczeniu wykonano te operacje w skali laboratoryjnej.

Samo wyodrębnianie produktu wiąże się z kilkoma problemami. Przede wszystkim należy ustalić czy dany produkt znajduje się wewnątrz czy na zewnątrz drobnoustrojów, w przypadku enzymów należy więc określić czy wyodrębniane enzym jest endo- czy egzogenny. Ponieważ produkt hodowli jest najczęściej przeznaczony na sprzedaż, dlatego też należy więc go oczyścić przed wprowadzeniem do sprzedaży. Jednymi z głównych „składników” roztworu pohodowlanego są same drobnoustroje, które oczywiście trzeba oddzielić od pożądanego produktu. W tym celu stosuje się dwie główne operacje: wirowanie lub filtrację.

W tym miejscu pojawia się kolejny problem- niewielki rozmiar drobnoustrojów (szczególnie bakteri) sprawia, że wirowanie, a przede wszystkim filtracje może powodować niedokładne oddzielenie mikroorganizmów od roztworu produktu. W przemyśle rozwiązano ten problem stosując kilka poziomów filtracji z coraz to mniejszymi rozmiarami porów w filtrze, wspomagając takie zastosowanie środkami zwiększającymi rozmiary cząstek odfiltrowywanych- koagulanty.

Koagulanty sprawiają, że cząstki które mają pozostać na filtrze koagulują zwiększając rozmiary drobin pozostających na filtrze. Najczęściej stosowanym koagulantem o dobrej skuteczności działania jest CaCl₂ , który pod wpływem zasadowego środowiska przekształca się w Ca(OH)₂ .

Oddzieliwszy biomasę z roztworu pohodowlanego otrzymuje się roztwór enzymu.

Kolejnym etapem wyodrębniania produktu jest zatężenie przesączu/supernatantu. Operację tą można prowadzić na jeden z 4 sposobów:

• Odparowanie wody pod próżnią- w obniżonym ciśnieniu woda paruje w niższej temperaturze(np. 40⁰C), co nie powoduje denaturacji enzymu.

• Ultrafiltracja- filtracja na filtrze o porach o rozmiarach molekularnych (wielkości pojedynczych cząsteczek).

• Wysolenie białka- wypadnięcie stałego białka enzymatycznego z roztworu na skutek dodania silnego elektrolitu (najczęściej siarczanu amonu) do roztworu. Najskuteczniejsze w pH równym punktowi izoelektrycznemu danego białka enzymatycznego.

• Dodanie rozpuszczalnika organicznego, np. etanolu - rozpuszczenie białka enzymatycznego w rozpuszczalniku organicznym, który łatwiej usunąć w porównaniu do wody. Ten proces także prowadzi się w PI enzymu, a rozpuszczalnik dodaje się małymi poracjami aby nie spowodować denaturacji białka.

Co więcej w celu uzyskania stałych preparatów można stosować liofilizację lub suszenie rozpyłowe. Płynne preparaty enzymatyczne są z reguły koncentratami i często dodaje się do nich stabilizatory, np. NaCl .

2. Cel ćwiczenia

Naszym zadaniem było wyodrębnienie preparatów enzymu z cieczy pohodowlanej. W tym celu należało usunąć biomasę Bacillus subtilis z podłoża pohodowlanego, a w następnym etapie wydzielić subtilizynę z supernatantu po oddzieleniu biomasy. Oba te procesy można prowadzić w różny sposób, dlatego zostaliśmy podzieleni na grupy. Każda grupa wykonywała zadanie stosując inną metodę, dzięki temu możemy porównać efektywność każdej z nich.

3. Część doświadczalna

Usuwanie biomasy Bacillus subtilis z podłoża pohodowlanego:

Grupa 1a - wirowanie

Aby przeprowadzić separację biomasy należało odmierzyć 30 ml (V₀) płynu po hodowli

B. subtilis [PRÓBA 1], a następnie poddać próbę wirowaniu na wirówce laboratoryjnej (4000 rpm, 10 minut). Następnie należało zmierzyć objętość supernatantu otrzymanego po oddzieleniu biomasy (V₁) [PRÓBA 2] i pobrać około 6 ml do oznaczeń zmętnienia i aktywności proteolitycznej.

Zmętnienie: Zmierzyć zmętnienie w PRÓBIE 2 na „Specolu” przy długości fali 660 nm

względem wody destylowanej (próbka rozcieńczona 5x). Zmierzyć również zmętnienie PRÓBY 1 (próbka rozcieńczona 20x).

Z uzyskanych wyników należało obliczyć OD (optical density) dla obydwu prób ze wzoru:

gdzie:

E₆₆₀ - wartość zmierzonej absorbancji,

R - rozcieńczenie próby przed pomiarem.

Aktywność proteolityczna: Zmierzyć aktywność dla PRÓBY 1 oraz supernatantu

[PRÓBA 2] za pomocą metody Ansona (schemat 1.). Dla obu prób należy wykonać 20-krotne rozcieńczenie.

Grupa 2a - koagulacja i wirowanie

Aby przeprowadzić separację biomasy należało odmierzyć 30 ml (V₀) płynu po hodowli

B. subtilis [PRÓBA 1], a następnie wstawić do łaźni z lodem i mieszając, dodać 0,6 ml KH₂PO₄ i 1,2 ml 50% CaCl₂. Całość należało pozostawić w łaźni z lodem na 10 minut, po czym odwirować korzystając z wirówki laboratoryjnej (4000 rpm, 10 minut). Następnie należało zmierzyć objętość supernatantu otrzymanego po oddzieleniu biomasy (V₁)

[PRÓBA 2] oraz pobrać około 6 ml do oznaczeń (j.w.).

Następnie należało wykonać pomiar zmętnienia oraz aktywności proteolitycznej w sposób analogiczny do grupy 1a. Jedyną zmianą, jaką należy uwzględnić przy badaniu zmętnienia jest rozcieńczenie PRÓBY 1. - nie ma potrzeby rozcieńczania ze względu na dodatek czynnika koagulacyjnego. Dla supernatantu należało przygotować 20-krotne rozcieńczenie.

Grupa 3a - koagulacja i filtracja

Aby przeprowadzić separację biomasy należało odmierzyć 30 ml (V₀) płynu po hodowli

B. subtilis [PRÓBA 1], a następnie wstawić do łaźni z lodem i mieszając, dodać 0,06 g KH₂PO₄ i 0,6 ml 50% CaCl₂. Całość pozostawić w łaźni z lodem na 10 minut, po czym dodać 1 g ziemi okrzemkowej (Celit), zamieszać i przefiltrować pod próżnią na lejku Büchnera z wcześniej przygotowaną na filtrze warstwą wilgotnej ziemi okrzemkowej. Następnie należało zmierzyć objętość filtratu otrzymanego po oddzieleniu biomasy (V₁) [PRÓBA 2] oraz pobrać około 6 ml filtratu do oznaczeń.

Pomiary zmętnienia i aktywności proteolitycznej należało przeprowadzić w sposób dokładnie taki sam jak dla grupy 1a. (łącznie z rozcieńczeniami).

Grupa 4a - filtracja

Aby przeprowadzić separację biomasy należało odmierzyć 20 ml (V₀) płynu po hodowli

B. subtilis [PRÓBA 1], a następnie podjąć próbę przefiltrowania cieczy po hodowli pod próżnią przez sączek bibułowy na lejku Büchnera. Następnie należało zmierzyć objętość filtratu otrzymanego po oddzieleniu biomasy (V₁) [PRÓBA 2] oraz pobrać około 6 ml filtratu do oznaczeń.

Oznaczenie(analogicznie do grupy 1a. Rozcieńczenia do zmętnienia dla PRÓBY 2. -

(5-10-krotne), dla PRÓBY 1. - 20-krotne

Wydzielanie subtilizyny z supernatantu po oddzieleniu biomasy:

Grupa 1b i 2b - wysalanie enzymu (subtilizyny)

W tym celu należało odmierzyć 30 ml (V₀) supernatantu bez biomasy (o pH=7,4) [PRÓBA 3] do zlewki o objętości 100 - 150 ml i wstawić do łaźni z lodem. Następnie odważyć 12 g stałego siarczanu amonu i dodawać go małymi porcjami do supernatantu, mieszając całość na mieszadle magnetycznym. Końcowe stężenie soli w roztworze wynosić powinno 40 % w/v.

Następnie należało nie mieszając inkubować otrzymaną mieszaninę w łaźni z lodem przez około 15 minut. Po inkubacji należało oddzielić osad wysolonego białka proteinaz przez wirowanie na wirówce laboratoryjnej (4000 rpm, 10 minut). Po wirowaniu należało usunąć ciecz znad osadu białka, a osad rozpuścić w 15 ml 0,1 % roztworu octanu wapnia (jony Ca²⁺ stabilizują białko subtilizyny) (V₁) [PRÓBA 4].

Aktywność proteolityczna: Następnie należało wykonać oznaczenie aktywności proteolitycznej supernatantu bez biomasy [PRÓBA 3] i otrzymanego roztworu subtilizyny [PRÓBA 4] metodą Ansona (schemat 1.). Próbki do oznaczenia powinny być rozcieńczone odpowiednio 20- i 40-krotnie.

Stężenia białka: Oznaczenie należało przeprowadzić metodą Lowry'ego (schemat 2.) w supernatancie bez biomasy [PRÓBA 3] i otrzymanym roztworze subtilizyny [PRÓBA4]. Próbki powinny być rozcieńczone odpowiednio 40- i 80-krotnie.

Grupa 3b i 4b - wytrącanie białek (subtilizyny) etanolem

W tym celu należało do 20 ml (V₀) zimnej cieczy bez biomasy [PRÓBA 3] o pH=7,4 i mieszając dodawać 60 ml oziębionego etanolu (całość przeprowadzać w łaźni z lodem). Następnie należało pozostawić mieszaninę w lodzie na 3-5 minut i po tym czasie odwirować wytrącony osad białek na wirówce laboratoryjnej (4000 rpm, 10 minut). Następnie zlać ciecz znad osadu, a osad białek proteinaz rozpuścić w 10 ml 0,1% octanu wapnia. Zmierzyć końcową objętość otrzymanego roztworu białek (zawierającego subtilizynę) (V₁) [PRÓBA 4].

Oznaczenia aktywności proteolitycznej supernatantu bez biomasy i otrzymanego roztworu subtilizyny, a także oznaczenie stężenia białka w supernatancie bez biomasy i w otrzymanym roztworze subtilizyny należało przeprowadzać analogicznie jak grupy 1b i 2b.

Metody analityczne wykorzystane w doświadczeniu:

Oznaczanie aktywności proteolitycznej (subtilizyny) metodą Ansona:

W metodzie tej wykorzystuje się fakt, że hemoglobina denaturowana mocznikiem w środowisku zasadowym trawiona enzymem proteolitycznym odczepia produkty rozpuszczalne w kwasie trójchlorooctowym. Zawartą w nich tyrozynę i tryptofan oznacza się fenolowym odczynnikiem Folina - Ciocalteu. Jednostka aktywności (Ansona) odpowiada takiej aktywności enzymu, która powoduje uwalnianie produktów rozpuszczalnych w TCA w ilości odpowiadającej jednemu milimolowi tyrozyny, (określanej przy użyciu odczynnika Folina - Ciocalteu), w ciągu 1 minuty (w 6 ml mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 ml roztworu enzymu i 5 ml 2% (w/v) roztworu hemoglobiny). Warunki standardowe reakcji to 25˚C, 10 minut.

Schemat 1. Postępowanie analityczne w metodzie Ansona.

Obliczenie aktywności należy przeprowadzić ze wzoru:

, gdzie:

A_10,2 - aktywność subtilizyny wyrażona w milijednostkach Ansona na 1 ml roztworu enzymu [ µmol tyrozyny / min ∙ ml],

K - współczynnik przeliczający ΔE₆₉₀ na jednostki Ansona wynikający z krzywej wzorcowej (K=0,69 µmol tyrozyny / min ∙ ml),

ΔE₆₉₀ - różnica absorbancji próby właściwej i kontrolnej,

R - rozcieńczenie enzymu wykonane przed oznaczaniem.

Oznaczanie stężenia białka metodą Lowry'ego:

Metoda ta opiera się na bardzo czułej reakcji zachodzącej między odczynnikiem Folina - Ciocalteu a atomami azotu tworzącymi wiązania peptydowe i aminokwasami aromatycznymi (Tyr, Trp, Phe), które są obecne w białku. Czułość metody: stężenie białka - 1µg/ml.

Schemat 2. Postępowanie analityczne w metodzie Lawry'ego.

Obliczenie stężenia białka należy przeprowadzać za pomocą wzoru:

[mg/ml], gdzie:

C - stężenie białka [mg/ml],

K - współczynnik wynikający z nachylenia krzywej wzorcowej: ΔE₆₅₀ = f (stężenia wzorcowego białka), białkiem tym jest albumina wołowa, BSA (ang. bovine serum albumin), K = 0,5 mg/ml,

ΔE₆₅₀ - różnica absorbancji próby badanej i odczynnikowej,

R - rozcieńczenie białka wykonane przed oznaczeniem.

4. Otrzymane wyniki:

A - Usuwanie biomasy Bacillus subtilis z podłoża pohodowlanego.

E₆₆₀ = 0,296 dla płynu pohodowlanego

E₆₆₀ = 0,0278 dla supernatantu

Obliczenie OD

OD₆₆₀ = E₆₆₀ * R

OD₆₆₀ = 0,296 * 20

OD₆₆₀ = 5,92 dla płynu pohod.

OD₆₆₀ = 0,0278⋅5 = 0,139 dla supernatantu

Przed wirowaniem: ΔE₆₉₀ = 0,379

Po wirowaniu: ΔE₆₉₀ = 0,238

Przykładowe obliczenia:

Obliczenie aktywności:

Korzystając ze wzoru:

A_10,2 = K⋅ E₆₉₀⋅R

Dla płynu pohodowlanego:

A_10,2 = 0,69⋅0,379⋅20

A_10,2 = 5,23 [mjA/ml ]

Dla supernatantu:

A_10,2 = 0,69⋅0,238⋅20

A_10,2 = 3,28 [mjA/ml ]

Obliczenie sumarycznej aktywności:

AS = V⋅ A_10,2

Dla płynu pohodowlanego:

AS₀ = 20 ml⋅5,23 mjA/ml

AS₀ = 104,6 [mjA]

Dla supernatantu:

AS₁ = 19 ml⋅3,28 mjA/ml

AS₁ = 62,32 [mjA]

B - Wydzielenie subtilizyny z supernatantu po oddzieleniu biomasy

Obliczenia aktywności analogicznie jak w punkcie A

A_10,2 = 4,35 [mjA/ml]

Dla rozcieńczenia 40-krotnego

A_10,2 = 3,59 [mjA/ml]

Obliczenie sumarycznej aktywności:

AS₀ = 30 ml⋅4,1 mjA/m

AS₀ = 123 [mjA]

Dla rozcieńczenia 40-krotnego

AS₁ = 17 ml⋅ 5,8 mjA/ml

AS₁ = 98,6 [mjA]

Wyznaczenie wydajności procesu wydzielenia białka z supernatantu:

ŋ% = AS ₁ / AS ₀ ⋅100

ŋ% = 80,2 %

Oznaczenie stężenia białka metodą

B = V ∙ C

V₀ = 30 ml

V₁ = 17 ml

C₀ = 5,94 [mg/ml ]

C₁ = 5,88 [mg/ml ]

Obliczenie sumarycznej ilości białka:

B₀ = 30 ml * 5,94 [mg/ml ]

B₀ = 178,2[mg]

B₁ = 17 ml * 5,88 [mg/ml ]

B₁ = 99,96[mg]

Obliczenie wydajności procesu:

ŋ% = B₁/ B₀ ⋅100

ŋ% = 56,09[%]

Aktywność właściwa:

= 4,1[mjA/ml]

C = 5,94[mg/ml ]

[mjA/mg]

= 5,8[mjA/ml]

C = 5,88[mg/ml ]

[mjA/mg]

Teraz możemy obliczyć stopień oczyszczenia subtilizyny:

Stopień oczyszczenia =
/

Stopień oczyszczenia = 0,986 [ mjA/mgbiałka] / 0,69 [ mjA/mgbiałka]

Stopień oczyszczenia = 1,4

5. Wnioski

1) Zmętnienie przed oddzieleniem biomasy jest prawie jednakowe. Najlepszą metodą na oddzielenie biomasy jest ta, po której roztwór jest klarowny. Jest to koagulacja+ wirowanie jak również koagulacja + filtracja.

Wirowanie jak i filtracja tez może być brane pod uwagę ale najpierw musi być skoagulowane.

Z wyników wydać wyraźnie, że koagulanty mają bardzo istotny wpływ na proces oddzielania biomasy. Z tych dwóch wyżej wymienionych metod lepszą okazała się metoda filtracji, a duży wpływ na to miała zapewne ziemia okrzemkowa zastosowana jako środek filtracyjny. Podczas stosowania samej filtracji otrzymuje się słabe wyniki, zatem trzeba wspomagać je dodatkowymi absorbentami. Filtracja jest najgorszym z badanych przez nas sposobów oddzielania biomasy, daje marne efekty i bardzo rzadko jest stosowana w przemyśle w formie niewspomaganej.
W profesjonalnych zakładach wydajność oddzielania produktu osiąga do 99 %. Efektywność może spadać m.in. z powodu źle dobranych koagulantów. Jeżeli chodzi o wytrącanie białek, to badaliśmy dwie metody: wysalanie oraz wytrącanie rozpuszczalnikiem organicznym. Można odnieść wrażenie że skuteczność obu metod jest porównywalna, jednakże wydajność wydzielenie białka z supernatantu zaobserwowana podczas prowadzenia procesu wysalania, wskazuje nam jakby, która z tych dwóch metod jest mimo wszystko lepsza.

	Oddzielenie biomasy								Wydzielanie białka prote. sery.
	Sposób	OD 660		Objętość cieczy [ml]		Akty.prot [mjA/ml]		η % (aky)	Sposób	Objętość cieczy		aktywność		Stężenie białka		η % (akt)	η % (białko)
			Przed OD660	Po OD660	Przed Vo	Po V1	Przed A10,2			Po A10,2			Przed Vo	Po V1	Przed A10,2			Po A10,2	C0	C1
1	Wirowanie	10,4	0,45	30	29	6,62	5,93	86,6	Wysalanie pH7,4	30	17	4,35	3,59	9,5	3,69	46,7	32,26
2	Koagulacja+ wirowanie	5,92	0,139	20	19	5,23	3,28	59,6	Wysalanie pH7,4	30	17	4,1	5,8	9,94	5,88	80,2	56,09
3	Koagulacja + filtracja	10	0,1	20	18	4,76	3,31	62,6	Wytrącanie etanolem pH 7,4	20	10,9	5,93	6,62	10,3	4,6	61	24,33
4	Filtracja	5,6	3,3	20	19	5,18	2,42	44,4	Wytrącanie etanolem pH 7,4	20	11	6,35	7,31	10,2	4,8	53,31	25,88

---