Wydział: BiNOŻ 29.05.2009 r.

Kierunek: Biotechnologia

Semestr: VI

Grupa: 5

LABORATORIUM Z BIOTECHNOLOGII

Ćwiczenie nr 10

„Enzymatyczna hydroliza pektyn”

1. Wstęp teoretyczny.

Cel ćwiczenia: Celem tego ćwiczenia jest poznanie metody enzymatycznej hydrolizy pektyn stosowanej do klarowania soków owocowych.

Pektyny są to przede wszystkim poliuronidy składające się z połączonych ze sobą, wiązaniami α-1,4-glikozydowymi, jednostek kwasu D-galakturonowego, w znacznej części zestryfikowanych grupami metylowymi. Pod względem żywieniowym stanowią jedną z frakcji rozpuszczalnego włókna pokarmowego, tzw. błonnika. Wiele mikroorganizmów jest w stanie rozkładać pektynę.

W materiale roślinnym pektyny występują w połączeniu z celulozą i takie substancje są nazywane protopektyną, która tworzy lepiszcze ścian komórkowych. Szczególnie duże ilości substancji pektynowych występują w owocach takich jak: porzeczki, agrest, a także owocach cytrusowych

i jabłkach. Pektyna jest uzyskanym w warunkach przemysłowych preparatem, zawierającym wyizolowane z surowca roślinnego rozpuszczalne w wodzie substancje pektynowe.

Preparaty te są używane jako dodatki do żywności, leków i posiadają w odpowiednich warunkach zdolność tworzenia żeli. Surowcem do produkcji pektyny mogą być suszone wytłoki jabłkowe, zawierające 8-12% substancji pektynowych, oraz wytłoki cytrusowe o zawartości substancji pektynowych w granicach 18 - 25%.

Możemy wyróżnić dwie frakcje pektyn, w zależności od stopnia estryfikacji:

• wysokometylowane, w których zestryfikowanych jest ponad 50% grup karboksylowych reszt kwasu galakturonowego.

• niskometylowane, w których stopień estryfikacji jest mniejszy od 50%.

Wspólną cechą pektyn jest zdolność do tworzenia żeli w kwaśnych warunkach. Zdolność żelowania zależna jest od stopnia zmetylowania pektyn. Pektyny wysokometylowane żelują przy pH 3,0, stężeniu cukru 65% oraz zawartości pektyn 0,3 - 2%. Żele pektyn niskometylowanych powstają przy niższym stężeniu cukru (30-40%) oraz w szerszym zakresie pH (3-6). Jednak niezbędnym czynnikiem utworzenia trójwymiarowej siatki żelu jest obecność jonów wapnia, w stężeniu 0,01 - 0,1%. Zawartość pektyn wynosi wtedy 1,5 - 3,0%. Z tego względu są one wykorzystywane w przemyśle spożywczym jako środek zagęszczający. Pektyny między innymi odpowiedzialne są za zestalanie się dżemów

i powideł.

Araban jest wielocukrem zbudowanym z arabinozy, glaktan zaś zbudowany jest z galaktozy. Pod wpływem działania enzymów pektynolitycznych, jak na przykład protopektynazy, następuje odszczepienie od protopektyny przede wszystkim arabanu i galaktanu. W wyniku tego powstaje pektyna rozpuszczalna, którą hydrolizują dwa główne enzymy jakimi są pektynoesteraza i poligalakturonaza.

Pektynoesteraza rozkłada wiązania estrowe odszczepiając metanol i uwalniając grupy karboksylowe. Poligalakturonaza z kolei działa na rozpuszczalną pektynę, rozrywając wiązania glikozydowe między resztami kwasu galakturonowego, które nie zawierają grup metoksylowych.

2. Przebieg doświadczenia.

1. Materiał i odczynniki.

- Świeże owoce, suszone jabłka i śliwki, wytłoki jabłkowe.

- Preparat pektynolityczny.

- Pektyna oczyszczona.

2. Sprzęt.

Spadek lepkości pektyny mierzymy na wiskozymetrze typu Ostwlda.

3. Wykonanie ćwiczenia.

3.1. Ekstrakcja pektyn z materiału biologicznego.

15 g rozdrobnionych owoców należy gotować przez jedną godzinę w 150 cm³ wody. Zawartość zlewki mieszać co pewien czas bagietką. Następnie części stałe należy oddzielić przez sączenie.

3.2. Pomiar spadku lepkości ekstraktu w trakcie hydrolizy pektyn.

Wiskozymetr Ostwalda napełniłyśmy wodą o temperaturze 20^oC i w trakcie ćwiczenia utrzymywałyśmy tą temperaturę.

Następnie wiskozymetr napełniłyśmy 15 cm³ wody destylowanej i trzykrotnie zmierzyłyśmy czas

jej przepływu, w celu wyeliminowania błędnego pomiaru.

W kolejnym etapie do wiskozymetru wlałyśmy 15 cm³ roztworu zawierającego 13 ml pektyny

i 2 ml wody destylowanej i po wyrównaniu temperatury zmierzyłyśmy czas przepływu tego roztworu.

Kolejne 4 pomiary miały na celu zbadanie przebiegu spadku lepkości ekstraktu w wyniku hydrolizy pektyn w zależności od ilości dodanego enzymu. Reakcję hydrolizy prowadziłyśmy przez 10 minut

w temperaturze 20^oC. Badane roztwory mają następujący skład:

- 13 ml pektyny; 1,5 ml wody; 0,5 ml enzymu

- 13 ml pektyny; 1 ml wody; 1 ml enzymu

- 13 ml pektyny; 0,5 ml wody; 1,5 ml enzymu

- 13 ml pektyny; 2 ml enzymu

Tabela nr 1 „Wyniki pomiaru spadku lepkości ekstraktu w wyniku hydrolizy pektyn”

Rodzaj badanego roztworu	Czas przepływu roztworu w wiskozymetrze [s]	Wartość spadku lepkości roztworu Bx
Woda destylowana	62	-
Roztwór bez enzymu	119	-
Roztwór + 0,5 ml enzymu	110	15,8
Roztwór + 1 ml enzymu	88	54,3
Roztwór + 1,5 ml enzymu	76	75,4
Roztwór + 2 ml enzymu	72	82,5

Spadek lepkości roztworu liczymy ze wzoru:

B_x= [(t_p-t_x)/(t_p-t_H2O)]*100

Gdzie:

- t_p- czas przepływu roztworu bez enzymu

- t_x- czas przepływu roztworu zawierającego enzym

- t _H2O- czas przepływu wody destylowanej

Przykład obliczeń dla roztworu zawierającego 1 ml enzymu i 1 ml wody destylowanej:

B_x= [(119-88)/(119-62)]*100=54,3

Tabela nr 2 „Zestawienie wyników pomiaru spadku lepkości dla różnych temperatur prowadzonego procesu”

Temperatura [^oC] Ilość dodanego enzymu [ml]	40	40	30	30	20	20	10	10
0,5	31,3	43	11,3	9	18,8	15,8	11,9	12,5
1	41,3	65	45,2	41,6	30,4	54,3	30,6	31,25
1,5	57,5	75	61,7	50,2	40,6	75,4	45,5	43,75
2	64,6	83	70,8	54,7	49,3	82,5	52,9	50

Na podstawie powyższych danych można wykreślić wykres zależności wartości B_x od objętości dodanego enzymu (Wykres nr 1).

Optymalną wartością współczynnika lepkości jest B_x=40. Dla wartości tej z wykresu nr 1 odczytujemy wartości objętości enzymu, w danej temperaturze, jaka jest potrzebna by lepkość roztworu pektyn spadła do 40. Uśrednione wyniki są podane w tabeli poniżej.

Tabela nr 3 „Optymalne objętości dodanego enzymu w danej temperaturze reakcji hydrolizy pektyn”

Temperatura [^oC]	Objętość enzymu [ml]
40	0,74
30	0,94
20	1,14
10	1,30

Na podstawie tych danych można stworzyć wykres ilości enzymu, potrzebnej do uzyskania stopnia lepkości B_x=40, w zależności od temperatury w jakiej prowadzony jest proces hydrolizy pektyn (Wykres nr 2).

4. Zadanie rachunkowe.

Należy wyznaczyć optymalne warunki hydrolizy pektyn, biorąc pod uwagę całkowity koszt hydrolizy 10 m³ roztworu pektyny o temperaturze 10^oC. Litr preparatu enzymatycznego kosztuje 100 zł, a koszt podgrzania 10 m³ pektyny o 1^oC wynosi 5 zł.

Koszt całkowity tego procesu można obliczyć z następującego wzoru:

K_c= K_enz + K _podgrz

Gdzie:

- K_c - koszt całkowity procesu

- K_enz - koszt zużytego enzymu

- K_podgrz - koszt energii zużytej na podgrzanie preparatu

a) Koszt całkowity dla reakcji zachodzącej w 10^oC.

K_podgrz = 0

Gdyż w tym przypadku nie ogrzewamy roztworu pektyny.

Wiemy, że do hydrolizy 13 ml roztworu pektyny, tak by jego lepkość wyniosła B_x=40 zużyto

ok. 1,30 ml enzymu.

13 [ml]= 13*10^-3 [l]

1,30 [ml]=1,3*10^-3 [l]

10 [m^3]= 10⁴ [l]

A zatem z proporcji możemy policzyć:

13*10^-3 [l] 1,3*10^-3 [l]

10⁴ [l] X

X= (10⁴* 1,3*10^-3)/ 13*10^-3= 1000

Jednak użyty enzym był rozcieńczony 600 razy, dlatego otrzymany wynik dzielimy:

1000/600= 1,67 [l]

Koszt użytego enzymu wynosi:

1,67 l * 100 zł/l = 167 zł

A zatem K_c= 167 zł

b) Koszt całkowity dla reakcji zachodzącej w 20^oC.

K_podgrz = 10*5 zł= 50 zł

Wiemy, że do hydrolizy 13 ml roztworu pektyny, tak by jego lepkość wyniosła B_x=40 zużyto

ok. 1,14 ml enzymu.

13*10^-3 [l] 1,14*10^-3 [l]

10⁴ [l] X₂

X₂= (10⁴*1,14*10^-3)/ 13*10^-3= 877 [l]

877/600= 1,46 [l]

Koszt zużytego enzymu wynosi:

1,46* 100= 146 zł

K_c= 50 zł + 146zł = 196 zł

c) Koszt całkowity dla reakcji zachodzącej w 30^oC.

K_podgrz = 20*5 zł= 100 zł

Wiemy, że do hydrolizy 13 ml roztworu pektyny, tak by jego lepkość wyniosła B_x=40 zużyto

ok. 0,94 ml enzymu.

13*10^-3 [l] 0,94*10^-3 [l]

10⁴ [l] X₃

X₃= (10⁴*0,94*10^-3)/ 13*10^-3= 723 [l]

723/600= 1,21 [l]

Koszt zużytego enzymu wynosi:

1,21* 100= 121 zł

K_c=100zł+121zł = 221 zł

d) Koszt całkowity dla reakcji zachodzącej w 40^oC.

K_podgrz = 30*5 zł= 150 zł

Wiemy, że do hydrolizy 13 ml roztworu pektyny, tak by jego lepkość wyniosła B_x=40 zużyto

ok. 0,74 ml enzymu.

13*10^-3 [l] 0,74*10^-3 [l]

10⁴ [l] X₄

X₄= (10⁴*0,74*10^-3)/ 13*10^-3= 569 [l]

569/600= 0,95 [l]

Koszt zużytego enzymu wynosi:

0,95* 100= 95 zł

K_c= 150 zł + 95zł = 245 zł

Na podstawie powyższych wyników można wykreślić wykres zależności kosztów całkowitych Kc od kosztów dodanego enzymu (Wykres nr 3).

3. Wnioski.

Optymalnym stopniem lepkości roztworu pektyn jest B_x= 40 dlatego hydrolizę prowadzi się przede wszystkim do czasu uzyskania tej wartości. Obserwując przebieg wykresu nr 2 możemy dojść do wniosku, że im wyższa jest temperatura, w której prowadzony jest proces hydrolizy, tym wymagana jest mniejsza ilość enzymu. Jednak prowadzenie reakcji w wysokich temperaturach nie jest korzystne z ekonomicznego punktu widzenia, gdyż niesie to za sobą koszty powstałe w wyniku ogrzewania roztworu.

1

---