Laboratorium z biotechnologii

Ćwiczenie 8

Temat:

Biosynteza α-galaktozydazy Mortierella vinacea IBT-3

Data wykonania ćwiczenia:12.05.2009 r.

1. Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia jest zbadanie wpływu parametrów hodowli wgłębnej na charakter wzrostu Mortierella vinacea IBT - 3 i biosyntezę α - galaktozydazy przez ten grzyb.

2. Materiał biologiczny:

Kultura grzyba Mortierella vinacea IBT - 3 na podłożu zawierającym: laktozę, glukozę, namok kukurydziany, siarczan amonu i sole mineralne.

3. Wykonanie ćwiczenie:

3.1. Wpływ wypełnienia kolb:

Oznaczyłyśmy aktywność enzymu zawartego w grzybniach wyhodowanych w kolbach zawierających 10, 20, 30 i 40%(v/v) podłoża.

3.2. Wpływ wypełnienia pH:

Oznaczyłyśmy aktywność enzymu zawartego w grzybniach wyhodowanych w podłożach o pH: 5,0; 6,0; 7,0; 8,0.

3.3. Otrzymywanie surowego preparatu α - galaktozydazy:

Na początku oddzieliłyśmy grzybnię od podłoża hodowlanego na lejku Buchnera i dokładnie przemyłyśmy wodą destylowaną. Następnie roztarłyśmy ją w moździerzu z dodatkiem piasku, aż do uzyskania pasty.

Roztartą grzybnię zawiesiłyśmy w wodzie destylowanej do objętości równej objętości podłoża hodowlanego (100ml) i wstawiłyśmy do wirówki na 15 min, na 10 000 rpm.

W supernatancie oznaczyłyśmy aktywność α - galaktozydazy.

3.4. Oznaczenie aktywności hydrolitycznej α - galaktozydazy:

W oznaczeniu aktywności enzymu jako substratu użyłyśmy p-nitrofenylo-α-D-galaktopiranozydu (pNPG). Wykonałyśmy dwa rodzaje rozcieńczeń: 100-krotne i 200-krotne.

Skład mieszaniny reakcyjnej:

• 0,5 ml substratu

• 0,5 ml enzymu (odpowiednio rozcieńczonego)

• 1 ml Na₂CO₃

Na początku substrat wstawiłyśmy substrat na 2 min do łaźni o temperaturze 50^oC. Następnie dodałyśmy odpowiednio rozcieńczonego enzymu i pozostawiłyśmy w łaźni na 15 min. Reakcję zatrzymałyśmy poprzez dodanie 1ml Na₂CO₃.

Ilość uwolnionego p-nitrofenolu oznaczyłyśmy poprzez pomiar absorbancji spektrofotometrycznie przy długości fali λ = 405 nm.

Aktywność α-galaktozydazy wyraża się w jednostkach, określających ilość μmoli p-nitrofenlu uwolnionych z pNPG w ciągu minuty w standardowych warunkach reakcji (50°C, pH 5.0, 10 min)

4. Opracowanie wyników:

Tabela 1: Zestawienie wyników:

Nr	Masa [g]	[jtk/ml]	Absorbancja		Absorbancja		Aktywność [I/ml]
						100x	200x	100x	200x	100x	200x
1	6,55	7,5*10^5	2,15	2,08	0,69	0,35	0,699	0,709
2	5,35	3,5*10^5	1,97	1,86	0,49	0,23	0,497	0,466
3	4,9	1,4*10^5	0,411 (R=100x )	0,240 (R=200x )	0,46	0,25	0,466	0,507
4	4,2	0,7*10^5	0,582 (R=100x )	0,284 (R=200x )	0,24	0,12	0,243	0,243

Przykładowe obliczenia:

gdzie:

A₄₀₅ - absorbancja przy 405 nm

0,076 - współczynnik przeliczeniowy wyznaczony na podstawie krzywej wzorcowej

R - rozcieńczenie

Obliczenie aktywność przy absorbancji 0,69 dla rozcieńczenia 100 krotnego:

Obliczenie aktywność przy absorbancji 0,35 dla rozcieńczenia 200 krotnego:

5. Wnioski:

Na podstawie otrzymanych wyników zaobserwowałyśmy wraz ze spadkiem stężenia inokulum nagromadzenie biomasy oraz spadek aktywności enzymu.

Na podstawie obserwacji makroskopowych zauważyłyśmy, że wraz ze spadkiem stężenia inokulum nastąpił wzrost wielkości koloni statycznych.

1

---