81. Hipoteza/teoria sygnałów.

Nie wiem czy o to chodzi, ale piszę jak mi się wydaje.

Teoria sygnałów mówi o tym, że wszystkie białka kierowane są do odpowiednich organelli za pomocą specyficznych sekwencji sygnalnych zawartych w ich sekwencji. Są one rozpoznawana przez odpowiednie receptory na powierzchni tych organelli, które kierują przenoszone białka na translokony - kompleksy białkowe importujące te białka do organelli. Sekwencja może znajdować się w różnych miejscach łańcucha polipeptydowego, często na N-końcu. Końcowe sekwencje mogą zostać odcinane, choć nie zawsze się tak dzieje.

82. Układ doświadczalny pozwalający wykazać, że określone białko powstaje na rybosomach związanych z ER.

Nie ma takiego układu pokazanego ani w Lodiszu ani w wykładach. Jest tylko układ pokazujący, że syntetyzowane na szorstkim ER białka transportowane są do światła ER. Może Sikorski źle sformułował pytanie, a może nie.

W tym modelu chodzi o to, że na krótko przed homogenizacją inkubujemy komórki ze znakowanymi radioaktywnie aminokwasami tak, że tylko nowo zrobione białka będą radioaktywne. Potem homogenizujemy komórkę i izolujemy szorstkie mikrosomy (które są gęstsze od gładkich i od innych błon). Jedną porcję poddajemy działaniu proteazy i detergentu, a drugą tylko proteazy. Analiza obecności białek w tych dwóch próbkach (nie było powiedziane jak to robią) pozwala wykazać, że tylko tam gdzie był detergent znakowane białka zostały pocięte. W ten sposób można udowodnić, że białka syntetyzowane na szorstkim ER są od razu translokowane do światła ER.

WYDAJE mi się, że można by to tak zmodyfikować, żeby wykrywać konkretne białko. Skoro wiemy już, że białko syntetyzowane na szorstkim ER trafia do lumen, to znaczy też, że białko, którego „świeże” cząsteczki są w lumen ER musi być syntetyzowane na szorstkim ER. Czyli tak jak poprzednio inkubujemy komórkę na krótko przed homogenizacją z radioaktywnymi aminokwasami, izolujemy mikrosomy i trawimy proteazą BEZ detergentu. Potem inaktywujemy proteazę, rozbijamy mikrosomy detergentem i przeprowadzamy detekcję naszego białka Np. western blotem ze znakowanymi przeciwciałami. Jeśli pasek dający sygnał od przeciwciał daje również sygnał od radioaktywnych aminokwasów to badane białko jest syntetyzowane na rybosomach szorstkiego ER.

Obrazek przedstawia pierwszy model:

83. To to samo co 75.

84. To to samo co 77

85. Zależność pomiędzy strukturą pierwszorzędową a lokalizacją białek integralnych w błonie.

Elementem struktury pierwszorzędowej decydującym o lokalizacji białka w błonie są sekwencje topogeniczne (ta nazwa nie pojawiła się w zag. 77 a powinna, chodzi o te sekwencje, które zatrzymują/zmieniają orientacje translokacji i są potem helisami błonowymi). W zależności od posiadanych sekwencji topogenicznych białko należy do jednego z 4 typów topologicznych.

Obecność sekwencji topogenicznych w białku można przewidywać na podstawie analizy struktury pierwszorzędowej. W tym celu należy w bazie danych zawierającej sekwencję białka poszukać fragmentów na tyle hydrofobowych (i o odpowiedniej długości) żeby mogły stanowić sekwencje topogeniczne. Wykonuje się tzw. profil hydropatyczny z pomocą komputera. Każdemu aminokwasowi przypisuje się indeks hydropatyczny, dodatni dla aminokwasów hydrofobowych i ujemny dla aminokwasów hydrofilowych (tym bardziej dodatni/ujemny im bardziej hydrofobowy/hydrofilowy aminokwas). Następnie komputer oblicza wypadkowy indeks hydrofobowy dla kolejnych nakładających się dwudziestek aminokwasów (tzn. 1-20, 2-21, 3-22 itd.) na całej długości białka i tworzy wykres tych indeksów w zależności od położenia w strukturze pierwszorzędowej białka. Zdecydowane i szerokie piki oznaczają możliwe sekwencje topogeniczne, pik na samym N-końcu - sekwencję sygnalną kierującą do ER. To, czy sekwencja jest STA, SA-II, czy SA-III (patrz następne zagadnienie i uzupełnienie do 77., które jest na końcu pliku) określa obecność naładowanych dodatnio aminokwasów w okolicy potencjalnej sekwencji topogenicznej. Jeśli ich nie ma to jest to STA, jeśli zgrupowanie jest po N stronie to SA-II, a jeśli po C stronie to SA-III. Przykłady wykresów poniżej:

86. Sekwencje topogeniczne w białkach integralnych.

W białkach integralnych wyróżniamy 3 rodzaje sekwencji topogenicznych (nie jestem do końca pewnie, ale N-końcowa sekwencja sygnalna nie jest sekwencją topogeniczną), których obecność w białku determinuje jego lokalizację w błonie, czyi typ topologiczny. Są to sekwencje STA (stop-transfer anchor), SA-II i SA-III (signal-anchor). Wszystkie składają się z 20-25 hydrofobowych aminokwasów tworzących w błonie transbłonowe helisy. Dodatkowo SA posiadają obok helisy region silnego ładunku dodatniego, II po N stronie, a III po C stronie. Sekwencje STA blokują translokację kotwicząc się błonie, a sekwencje SA dodatkowo układają się w transolokonie w specyficzny sposób (tak żeby ładunek dodatki był na cytozolowej stronie). Białka typu i posiadają jedną sekwencję STA. Dodatkowo mają na N-końcu odcinaną sekwencję sygnalną do ER, taką jak białka sekrecyjne. Białka typu II mają jedną sekwencję SA-II i ich N-koniec wystaje do cytozolu, a C-koniec do lumen. Białka typu II I SA-III i odwrotnie końce. Białka typu IV-A mają powtarzające się SA-II i STA. Pierwsza sekwencja sprawia, że N-koniec jest w cytozolu, dalsze konsekwentnie zmieniają strony po której rośnie łańcuch. Białka IV-B mają pierwszą sekwencję SA-III a potem powtarzajże się SA-II i STA. Pierwsza kieruje N-koniec do lumen, a dalsze zmieniają strony.

87. Sygnał(y) i odpowiedź na pojawienie się niesfałdowanego białka.

Pojawienie się niesfałdowanego lub źle sfałdowanego białka w lumen ER powoduje powstanie kilku sygnałów i odpowiedzi, które mogą mieć postać regulacji ekspresji genów czaperonów, albo eksportu niepoprawnych białek do cytozolu i ich degradacji.

Niepoprawnie sfałdowaną cząsteczka białka wiąże czaperon BiP. W stanie wolnym Bip jest związany z pewnym receptorem błony ER - Ire1 - i utrzymuje go w formie monomerycznej. Po zwolnieniu BiP Ire1 dimeryzują, a ich cytozolowe domeny tworzą specyficzną endonukleazę RNA. Ma ona za zadanie wyciąć intron obecnego w cytozolu(!) niedojrzałego mRNA białka Hac1 - czynnika transkrypcyjnego regulującego ekspresję genów kodujących wiele czaperonów. Egzony Hac1 łączą się spontanicznie i następuje ekspresja, a gotowe białko Hac1 translokuje się do jądra i inicjuję ekspresję wspomnianych genów. Mechanizm ten występuje i u drożdży i u ssaków.

Inny mechanizm, występujący tylko u ssaków, polega na cięciu proteolitycznym integralnego białka błonowego ER - ARF6. Uwolniona domena cytozolowa przemieszcza się do jądra i aktywuję ekspresję genów kodujących czaperony.

Poza tym, po ok. godzinie - dwóch od syntezy, nieprawidłowe białka są degradowane. Dzieje się to w cytozolu, a białka te wychodzą z ER przez translokon. Enzymy na cytozolowej stronie błony ER łączą je z ubikwityną, która kieruje nieprawidłowe białka do proteasomu.

88. Szaperonina BiP, izomeraza disiarczkowa.

Zagadnienie jest identyczne jak 76. Ale zapomniałem tam napisać kilka rzeczy o BiP. Wspomniałem o translokacji potranslacyjnej, ale nie wspomniałem, że w czasie translokacji kotranslacyjnej również BiP łączy się z rosnącym łańcuchem nowego białka zapobiegając jego fałdowaniu/agregacji. Dzięki temu białko zwija się dopiero jak cały łańcuch jest utworzony i przeniesiony do ER i unika się złego fałdowania N-końcowych fragmentów. Rola BiP w odpowiedzi na niesfałdowane białka była opisana w poprzednim zagadnieniu.

89. Białka biorące udział w kontroli prawidłowego procesu zwijania białek.

Istnieje kilka białek lub klas białek zaangażowanych w ten proces, są to:

- izomeraza disiarczkowa (protein disulfide isomerase PDI), której rolę już znamy

-grupa białek zwanych czaperonami molekularnymi, które wiążą niesfałdowane białka i chronią je przed agregacja i degradacją, np. BiP. Białka te są ATPazami i do wiązania się z innymi używają energii pochodzącej z hydrolizy ATP

-kalneksyna i kalretikulina z grupy cetyn wiążą reszty cukrowe dodawane w ER przez N-glikozylację i zapobiegają ich agregacji

-izoemerazy peptydyloprolilowe (PPIazy) katalizują przejście wiązania peptydowego X-P z konformacji trans w cis, jaka występuje w ok. 6% przypadków. Niekatalizowana taka reakcja jest niesamowicie wolna (praktycznie nie zachodzi). Nawet z katalizą, ten etap często jest limitującym dla dojrzewania białek z takim wiązaniem.

-białka z rodziny czaperonin tworzące cylindryczne multimetryczne kompleksy z wolną przestrzenią w środku. Niesfałdowane białko zamykane jest w tej środkowej przestrzeni przez białka pomocnicze i tam fałdowane przy użyciu energii pochodzącej z hydrolizy ATP. Takie białka to na przykład bakteryjne GroEL z białkiem pomocniczym GroES

90. było w 76.

Uzupełnienie do 77:

Te sekwencje, które tworzą transmembranowe helisy to sekwencje topologiczne. Te, które określiłem jak „stop-transfer anchor” to inaczej STA, a „signal-anchor” to SA. W typie II i II białek występują różne rodzaje SA, odp. II i III. Różnica w ich budowie odpowiada za różnicę ustawienia tych białek.

Sekwencje SA (signal-anchor) ustawiają się w translokonie w konkretny sposób - II tak, żeby N-koniec był w cytozolu, a III tak żeby w lumen. O tym jaką orientację przyjmie w błonie sekwencja typu SA (tzn. czy jest II czy III) decyduje to po której stronie ma aminokwasy zasadowe (naładowane dodatnio). Takie centrum ładunku dodatniego lokuje się po stronie cytozolowej, tak więc II będą je miały po N stronie helisy, a III po C stronie.

---