Mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej

(SPME - Solid Phase Microextraction)

SPME jest techniką ekstrakcyjną zaproponowaną w 1990 r. przez Arthura i Pawliszy-

na [13]. Metoda ta ciągle cieszy się ogromnym zainteresowaniem, gdyż może być stoso-

wana w oznaczaniu szerokiej gamy organicznych związków lotnych i średniolotnych w

próbkach środowiskowych i innych, w tym także w próbkach o skomplikowanych matry-

cach. Ponadto spełnia ona wymagania aktualnego trendu miniaturyzacji zestawu do przy-

gotowania próbek i prawie całkowitego wyeliminowania rozpuszczalników z tego proce-

su [14, 15].

Podstawą takiej ekstrakcji jest użycie cienkiego włókna ze stopionej krzemionki po-

krytego odpowiednim materiałem sorpcyjnym, które przymocowane jest do tłoka mikro-

strzykawki do GC. Włókno może być wsuwane bądź wysuwane z igły strzykawki. Kiedy

włókno jest eksponowane bezpośrednio w badanej próbce wodnej lub w jej fazie nadpo-

wierzchniowej, to następuje podział analitu między fazą wodną (matrycę) a fazą stacjo-

narną umieszczoną na włóknie SPME.

Włókno SPME wsunięte do igły strzykawki wprowadza się do dozownika chromato-

grafu gazowego, gdzie po wysunięciu anality są desorbowane termicznie i przenoszone

za pomocą gazu nośnego do kolumny chromatograficznej w celu ich separacji,

a następnie do odpowiedniego detektora [15].

Zalety i wady techniki SPME

Technika SPME jest innowacyjną techniką izolacji i wzbogacania głównie organicz-

nych zanieczyszczeń w próbkach środowiskowych [16]. Technika ta jest szybka, prosta,

łatwa do automatyzacji oraz możliwa do użycia w warunkach polowych. Dzięki jej stoso-

waniu można oznaczać organiczne zanieczyszczenia w wodzie na niskim poziomie stę-

żeń [16]. Technika SPME jest niewrażliwa na zawiesiny obecne w próbce, jeśli zastosuje

się ekstrakcję analitów z fazy nadpowierzchniowej. Może być stosowana nie tylko do

próbek ciekłych, ale także gazowych oraz stałych (ekstrakcja w fazie nadpowierzchnio-

wej HS (Head Space) SPME) [17]. Stosowanie rozpuszczalników jest prawie całkowicie

wyeliminowane.

Główną wadą tej techniki ekstrakcyjnej jest względnie duży koszt włókna i ograni-

czony czas jego użytkowania związany z zanieczyszczaniem w czasie ekstrakcji i ewen-

tualną degradacją. Częściowa degradacja fazy stacjonarnej włókna, szczególnie jeśli de-

sorpcja prowadzona jest w wysokiej temperaturze, i/lub składników próbki nietrwałych

9

termicznie może prowadzić do pojawienia się dodatkowych pików na chromatogramie.

Pogarszać to może dokładność i precyzję analizy [14].

Dodatkową zaletą tej metody jest możliwość jej połączenia z techniką HS. Wokół

włókna umieszczonego w fazie gazowej nad ciekłą próbką nie tworzy się stacjonarna

warstewka wody, utrudniająca transport analitów do włókna, a duża powierzchnia kon-

taktu próbki z fazą gazową może być odnawiana w sposób ciągły w wyniku mieszania.

W rezultacie transport lotnych analitów z próbki do włókna przez fazę nadpowierzchnio-

wą jest dużo szybszy niż bezpośrednio z próbki do włókna. Równowaga w takim ukła-

dzie ustala się bardzo szybko [17].

Sposoby stosowania SPME

W zależności od umieszczenia włókna względem próbki mikroekstrakcję do fazy sta-

cjonarnej można podzielić na [15, 17, 18]:

- bezpośrednią (DI (Direct Immersion) - SPME),

- z fazy nadpowierzchniowej (HS-SPME).

Te dwa rozwiązania zebrano i opisano w tabeli 2.

Tabela 2

Sposoby prowadzenia mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej na włóknie

DI-SPME

HS-SPME

Włókno jest bezpośrednio zanurzone w próbce

i anality są przenoszone bezpośrednio z matrycy

próbki do fazy stacjonarnej.

Włókno SPME wprowadza się do fazy nadpo-

wierzchniowej próbki wewnątrz naczyn

Termodynamiczne aspekty tej techniki przygotowania próbek zostały dokładnie prze-

analizowane i wskazują, że ilość ekstrahowanych analitów przez włókno jest wprost pro-

porcjonalna do stężenia analitów w próbce i niezależna od położenia włó

w próbce lub w fazie stacjonarnej). Współczynniki podziału analitu między fazą stacjo-

narną a fazą nadpowierzchniową (K

fh

) oraz analitu między fazą stacjonarną a próbką

(K

fs

) mogą być oszacowane na podstawie danych fizykochemicznych i parametrów chro-

matograficznych [19

Warunki wpływające na wydajność mikroekstrakcji

do fazy stacjonarnej

Z rozważań termodynamicznych wynika, że takie parametry, jak: temperatura, siła jo-

nowa roztworu, polarność matrycy próbki i rodzaj materiału włókna, wpływają na współ-

czynnik podziału, a tym samym na wydajność ekstrakcji i czułość metody, dlatego po-

winny być uwzględnione w procesie optymalizacji. Inne parametry, które mogą wpływać

na czułość oznaczenia, to objętość fazy stacjonarnej, fazy nadpowierzchniowej oraz

próbki [17]. Natomiast kinetyka mikroekstrakcji, będąca funkcją temperatury

i intensywność mieszania, określa czas ekstrakcji. Wydajność ekstrakcji można również

modyfikować, przeprowadzając anality w pochodne [20].

Pokrycie włókna

Włókno w celu osiągnięcia dobrej selektywności i wydajności ekstrakcji analitów po-

winno charakteryzować się odpowiednimi właściwościami chemicznymi i fizycznymi

[20-22]. W pierwszym etapie wybór fazy stacjonarnej korzysta z zasady „podobne roz-

puszcza się w podobnym”, czyli niepolarne anality są skuteczniej ekstrahowane do nie-

polarnego pokrycia włókna, najczęściej polidimetylosiloksanu (PDMS), a polarne anality

są ekstrahowane do polarnego pokrycia włókna, np. poliakrylanu (PA) [23]. Mieszane

fazy (stały sorbent rozproszony w ciekłej fazie stacjonarnej) są stosowane głównie do

ekstrakcji bardzo lotnych związków. Wydajność ekstrakcji do takich włókien jest więk-

sza w porównaniu z PDMS, ale czas użytkowania generalnie krótszy. Proces sorpcji do

faz mieszanych jest zazwyczaj w większym stopniu zależny od adsorpcji niż absorpcji

[21].

Dobór właściwego włókna jest niezmiernie ważny, ponieważ rodzaj i ilość fazy sta-

cjonarnej wpływa na czułość i selektywność procedury, korzystającej z mikroekstrakcji

do fazy stacjonarnej.

W tabeli 3 przedstawiono krótką charakterystykę handlowo dostępnych włókien do

SPME.

Wolne LKT są związkami o silnych właściwościach hydrofilowych i, według wspo-

mnianej wyżej zasady, najbardziej odpowiednie do ich ekstrakcji są włókna mieszane.

Typowe fazy mieszane (PDMS-DVB, PDMS-CAR i PDMS-CAR-DVB) użyto i porów-

nano pod względem możliwości oznaczania LKT w próbkach ścieków miejskich za po-

mocą HS-SPME-GC-FID [11]. Największe powierzchnie pików uzyskano dla wolnych

LKT o większej masie molekularnej (C4-C7). Wszystkie te włókna dały satysfakcjonują-

ce powierzchnie pików. Kwasy o mniejszej liczbie węgla w molekule (kwas octowy

i propionowy) były ekstrahowane z użyciem włókna PDMS-CAR, by uzyskać wystarcza-

jąco duże pole powierzchni pików. Szczególnie korzystne było jego użycie do oznacza-

nia kwasu octowego.

W porównaniu z PDMS-DVB, włókno PDMS-CAR-DVB dawało lepszą wartość od-

zysku dla kwasu octowego, propionowego i masłowego, podczas gdy dla kwasu waleria-

nowego, heksanowego i heptanowego nie było znaczącej różnicy między tymi dwoma

włóknami.

Tabela 3

Handlowo dostępne włókna do SPME [19, 22, 24, 26]

Pokrycie włókna

Akronim

Grubość

filmu

[m]

Oznacze-

nie końco-

we

Zastosowanie

WŁÓKNA NIEPOLARNE

Polidimetylosiloksan

PDMS

100

30

7

GC, HPLC

GC, HPLC

GC, HPLC

Niepolarne związki organiczne:

VOCs, PAHs, BTEX

WŁÓKNA POLARNE

Poliakrylan

PA

85

GC, HPLC

Polarne związki organiczne:

triazyny, fosfoorganiczne pe-

stycydy i fenole

WŁÓKNA MIESZANE

Polidimetylosiloksan-polidiwiny-

lobenzen

PDMS-DVB

65

60

GC

HPLC

Węglowodory

aromatyczne,

aromatyczne aminy, VOCs

Polidimetylosiloksan - Carboxen

PDMS-

CAR

75

GC

Gazowe/lotne anality, VOCs,

węglowodory

Carbowax - Polidiwinylobenzen

CW-DVB

65

GC

Polarne związki organiczne, al-

kohole, ketony, nitroaroma-

tyczne związki

Carbowax - żywica z nadrukiem

molekularnym

CW-TPR

50

HPLC

Anionowe surfaktanty, aroma-

tyczne aminy

Polidimetylosiloksan -Polidiwiny-

lobenzen/Carboxen

PDMS-

DVB/CAR

50/30

GC

Szeroki zakres polarnych anali-

tów

Natomiast do ekstrakcji benzylowych pochodnych LKT z matrycy wodnej zastosowano

włókno polarne (PA), które charakteryzuje się stabilnością mechaniczną i zapewniają do-

brą powtarzalność ekstrakcji [27]. W przeprowadzonych badaniach porównywano rów-

nież wydajność ekstrakcji do włókien PDMS i CW-DVB, uzyskując ponad

10-krotnie mniejszą wydajność dla PDMS. W przypadku włókna CW-DVB wystąpił na-

tomiast problem natury trwałości mechanicznej, wynikający z pęcznienia powierzchni

włókna. Dlatego też do dalszej ekstrakcji wykorzystywano jedynie włókno PA.

Włókno pokryte poliakrylanem jest przeważnie stosowane do ekstrakcji pochodnych

LKT po etapie derywatyzacji lub do jednoczesnej derywatyzacji i sorpcji na włóknie.

Derywatyzacja za pomocą takich odczynników, jak np. 1-pentafluorofenylodiazoetan

(PFPDE) i pirenylodiazometan (PDAM) w połączeniu z techniką SPME służy do moni-

torowania LKT w próbkach wodnych i w powietrzu. Na ogół lepszy odzysk otrzymuje

się, prowadząc jednocześnie ekstrakcję i derywatyzację na powierzchni włókna pokryte-

go fazą stacjonarną z odczynnikiem derywatyzującym, uzyskując 98% przekształcenie

kwasów w estry LKT w fazie stacjonarnej [25].

Grubość warstwy fazy stacjonarnej jest niezmiernie ważna. Zastosowanie grubej war-

stwy fazy stacjonarnej powoduje, że układ dochodzi do równowagi znacznie dłużej. Na-

leży wybierać włókno z najmniejszą grubością filmu, które już zapewnia wymaganą czu-

łość [19]. Do oznaczania LKT stosowano handlowo dostępne włókna pokryte filmem

fazy stacjonarnej o różnych grubościach.

W tabeli 4 przedstawiono właściwości i zakres zastosowania włókien o różnej grubo-

ści warstwy fazy stacjonarnej [18, 22, 23,

Czas ekstrakcji

Z punktu widzenia powtarzalności i czułości najlepiej, jeśli ekstrakcję (a właściwie

sorpcję) prowadzi się do momentu osiągnięcia stanu równowagi pomiędzy próbką a fazą

stacjonarną włókna. Czas uzyskania równowagi jest definiowany jak czas, po którym

ilość ekstrahowanych analitów pozostaje stała w granicach błędu eksperymentalnego

i równa ilości ekstrahowanej w nieskończenie długim czasie. Określając ilość wyekstra-

howanego analitu dla stanu równowagi, można obliczyć współczynnik podziału (K

fs

)

[18], który generalnie wzrasta wraz ze wzrostem długości łańcucha i temperaturą wrzenia

analitu [23].

Czas ekspozycji włókna ekstrakcyjnego w fazie nadpowierzchniowej dla wolnych

LKT w próbkach ścieków miejskich wynosił 20 min [4, 5], a bezpośrednio z próbek ście-

ków z farmy trzody chlewnej wynosił również 20 min [7]. W przypadku ekstrakcji połą-

czonej z derywatyzacją stosowano czas ekspozycji 180240 min dla próbek powietrza, a

w fazie nadpowierzchniowej próbek wodnych 60 min [31]. Czas ten jest zależny od

współczynnika podziału analitu, współczynnika dyfuzji oraz intensywności mieszania

próbki, których wzrost skraca czas potrzebny do osiągnięcia stanu równowagi, ponieważ

przyspiesza transport analitów w kierunku do włókna [20]. Czas ten jest generalnie krót-

szy dla ekstrakcji z fazy nadpowierzchniowej [25].

Temperatura

Temperatura ekstrakcji wpływa na proces SPME w dwojaki sposób [20]. Korzystne

i negatywne aspekty podwyższenia temperatury procesu ekstrakcji przedstawiono

w tabeli 6. Zazwyczaj można ustalić optymalną temperaturę, w której ilość wyekstraho-

wanego analitu jest największa. Temperatura ta zależy od składu matrycy i stosowanej

fazy stacjonarnej [17]. Najczęściej stosowaną temperaturą w trakcie ekstrakcji LKT było

25°C [11, 12, 14, 26].

Tabela 6

Korzystne i negatywne aspekty podwyższonej temperatury ekstrakcji [15, 17, 18, 20, 25]

Korzystne

Negatywne



powoduje wzrost szybkości ekstrakcji przez

wzmożoną dyfuzję analitów w kierunku włók-

na



zmniejsza wartość współczynnika podziału ana-

litów (K

fs

), ponieważ etap absorpcji jest proce-

sem egzotermicznym



pomaga przenieść anality do fazy nadpo-

wierzchniowej (HS-SPME)



dla termicznie niestabilnych związków, takich

jak np. HMX podwyższona temperatura nie jest

zalecana

współczynnik dyfuzji w wodzie jest większy i

czas ekstrakcji krótszy, ale współczynnik po-

działu włókno-próbka jest wówczas mniejszy



zmniejsza wartość współczynnika podziału mię-

dzy fazą stacjonarną a fazą nadpowierzchniową



ułatwia desorpcję analitów związanych z ma-

trycą

i przyspiesza transport analitów o małej lotno-

ści

Mieszanie

Mieszanie odgrywa ważną rolę w procesie ekstrakcji SPME. Stosowane zazwyczaj

sposoby mieszania opisano w tabeli 7 [17, 19, 23, 28].

Tabela 7

Sposoby mieszania stosowane w technice SPME

Metoda miesza-

nia

Charakterystyka

magnetyczne



wymaga zastosowania mieszadełka magnetycznego w naczynku z próbką



jest najczęściej stosowaną techniką w SPME ze względu na łatwość realizacji

w laboratoriach analitycznych, a ponadto może być stosowane w różnych wer-

sjach SPME

technika „wiru”



naczynko jest szybko obracane ruchem okrężnym

stały przepływ

próbki



odnawianie powierzchni włókna i zwiększony transport analitów do włókna

przy użyciu

ultradźwięków



jest najbardziej skutecznym i najszybszym sposobem. Wadą jest ogrzewanie się

próbki, a co za tym idzie - możliwość degradacji analitów oraz obniżenie precy-

zji oznaczeń

Porównując wyniki analiz próbek mieszanych z wykorzystaniem mieszadła magne-

tycznego i próbek bez mieszania, większe pola powierzchni pików chromatograficznych

LKT uzyskuje się zazwyczaj dla tego pierwszego [4]. Wynika to z faktu, że skuteczna

technika mieszania minimalizuje czas potrzebny do uzyskania stanu równowagi, a tym

samym zwiększa odzysk przeprowadzonej ekstrakcji. Czas ten zależy od współczynnika

podziału oraz od sposobu i intensywności mieszania. Gdy szybkość mieszania rośnie, to

pola powierzchni pików chromatograficznych lotnych kwasów tłuszczowych również

wzrastają [4]. W praktyce trudno jest osiągnąć idealne warunki mieszania dla próbek

wodnych, gdyż wokół włókna powstaje cienka, nieruchoma warstewka wody, która two-

rzy barierę dyfuzyjną. Wpływa to znacząco na wydłużenie czasu dochodzenia do stanu

równowagi. Najszybszy czas dochodzenia do równowagi w przypadku LKT daje miesza-

nie z zastosowaniem ultradźwięków (20 s); natomiast czas w przypadku najbardziej roz-

powszechnionego sposobu mieszania za pomocą mieszadła magnetycznego wynosi od 2

do 60 min. Mieszanie wpływa również korzystnie na dyfuzję składników z fazy ciekłej

do fazy nadpowierzchniowej.

Ze względu na stosunkowo dużą lotność LKT również bez mieszania można osiągnąć

stan równowagi w wersji HS-SPME [4]

Zmiana wartości pH

Przez odpowiedni dobór pH próbki można w znacznym stopniu poprawić czułość

procedury analitycznej, korzystając z techniki SPME. Obniżając wartość pH próbki,

można cofnąć dysocjację kwaśnych analitów; przy pH = 2 LKT pozostają praktycznie

całkowicie w formie niezdysocjowanej.

Dla analitów kwasowych pH powinno mieć wartość co najmniej o 2 jednostki mniej-

szą niż pK

a

analitu, a dla zasadowych analitów o dwie większą niż pK

b

[18]. Jednak nale-

ży pamiętać, że włókna pokryte fazą PDMS nie mogą być eksponowane na działanie

próbki o pH poniżej 4 i powyżej 10 [19, 25].

Dodatek soli

Dodatek soli, najczęściej NaCl lub Na

2

SO

4

, zwiększa siłę jonową roztworu, co

zmniejsza rozpuszczalność wielu substancji organicznych, w tym LKT w wodzie, a tym

samym zwiększa ułamek ekstrahowanych analitów do włókna [20, 25, 29]. Zmniejszenie

rozpuszczalności wielu związków polarnych może być na tyle duże, że następuje kilka-

krotny wzrost współczynnika podziału między fazę stacjonarną a próbkę [17, 19]. Efek-

tem towarzyszącym może być spadek selektywności włókna [25]. Włókno po desorpcji

musi być bardzo ostrożnie i dokładnie umyte, ponieważ sól zwiększa na ogół jego kru-

chość [19].

Wielkość efektu wysolenia próbki zależy od polarności analitu, stężenia soli oraz od

matrycy próbki [20].

Dodatek rozpuszczalnika

Problem dodatku organicznego rozpuszczalnika do próbki ciekłej nie jest jeszcze

gruntownie zbadany. Obecność organicznych rozpuszczalników w próbkach wodnych

zazwyczaj zmniejsza ułamek ekstrahowanych analitów. Dodatek rozpuszczalnika orga-

nicznego lub wody do próbek stałych i mulistych pozwala na uwolnienie analitów

z matrycy i dzięki temu zwiększa skuteczność ekstrakcji [20].

Objętość próbki

Ważnym parametrem w procesie optymalizacji warunków ekstrakcji LKT jest obję-

tość próbki, która ma bezpośredni wpływ na czułość metodyki analitycznej. Objętość

próbki jest wielokrotnie większa niż objętość fazy stacjonarnej na włóknie i ilość ekstra-

howanych analitów jest proporcjonalna do współczynnika podziału, stężenia próbki oraz

objętości fazy stacjonarnej na włóknie. Związki chemiczne o dużej wartości współczyn-

nika K

fs

są bardziej wrażliwe na zmiany objętości próbki niż związki o małym powino-

wactwie do włókna. Z tego powodu jednym z kryteriów doboru odpowiedniej objętości

próbki jest uwzględnienie wartości współczynnika podziału K

fs

. Natomiast dla mikro-

ekstracji w fazie nadpowierzchniowej (HS-SPME) objętość fazy gazowej powinna być

zminimalizowana, aby osiągnąć jak największe stężenie LKT w fazie nadpowierzchnio-

wej, a co za tym idzie - uzyskać zwiększoną czułość metodyki [20, 21]

Desorpcja analitów z włókna

Głównymi czynnikami wpływającymi na termiczną desorpcję LKT z włókna SPME

są: temperatura, czas desorpcji i położenie igły w dozowniku GC [25]. Wpływ tych czyn-

ników został scharakteryzowany w tabeli 8. Skuteczność termicznej desorpcji analitów w

dozowniku GC jest również zależna od lotności analitów i grubości pokrycia włókna

[30]. Większość dozowników w chromatografach gazowych jest przystosowana do bez-

pośredniego wprowadzenia włókna. Objętość wkładki wpływa na kształt pików chroma-

tograficznych; większa objętość jest powodem poszerzania pasma analizowanych sub-

stancji. Dozownik powinien być ustawiony na pracę w układzie bez dzielenia strumienia.

Wzrost temperatury powoduje zmniejszenie powinowactwa LKT do włókna, a tym

samym zwiększa efektywność ich uwolnienia do dalszej analizy [11, 20], zaś natężenie

przepływu gazu nośnego determinuje czas przeniesienia LKT z dozownika do kolumny

GC.

Tabela 8

Wpływ temperatury, czasu i położenia igły w dozowniku na proces desorpcji termicznej

Temperatura



zazwyczaj pomiędzy 250300°C



zależy od rodzaju pokrycia włókna



optymalna temperatura jest w przybliżeniu równa temperaturze wrzenia najmniej

lotnego kwasu



początkowa temperatura kolumny GC powinna być:

¬

utrzymana na niskim poziomie lub kolumna chłodzona, ażeby zapobiec posze-

rzaniu się pasm chromatograficznych

¬

niższa o 80100°C od temperatury wrzenia najbardziej lotnego kwasu

Czas



zależy od temperatury desorpcji dla danego kwasu



na ogół pomiędzy 1 s i 1 min [25], 2 min [20], jednakże w celu wyeliminowania

efektu pamięci proponuje się zostawić włókno w dozowniku na 510 min

Położenie igły

w dozowniku



ważne szczególnie dla trudniej lotnych związków chemicznych, gdyż dozownik nie

jest jednolicie ogrzany



najlepiej utrzymywać igłę zawsze w tej samej pozycj

---